一种新型冠状病毒N蛋白抗原变体及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型冠状病毒n蛋白抗原变体及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用，该抗原变体在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长n蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题，有效提高了新型冠状病毒抗体检测的专属性。

背景技术：

新型冠状病毒（novelsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus2,sars-cov-2）是一种具有急性呼吸道传染性的rna病毒。截至2020年7月底，新型冠状病毒已引起全球约1800万人感染，69万人死亡。

表面有冠状刺突的球状新型冠状病毒外部是由多种蛋白组成的壳，分别是刺突糖蛋白（s，spikeprotein）、小包膜糖蛋白（e，envelopprotein）、膜糖蛋白（m,membraneprotein）。病毒内部是由n蛋白与病毒rna形成核糖核蛋白复合物，n蛋白是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、破坏各种宿主细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征。

新型冠状病毒的n蛋白、e蛋白和s蛋白在病毒感染人体后，刺激浆细胞产生特异性抗体，具有较强的抗原性，被广泛应用于新冠抗体血清学检测产品中。截至2020年5月底，国家药品监督管理局一共应急审批通过了44个新冠检测试剂及设备，其中有18个新冠抗体血清学检测产品。获批的新冠病毒抗体检测试剂盒都以常规冠状病毒抗原s和n蛋白，尤其是以n蛋白作为抗体捕获抗原。

n蛋白作为抗体捕获蛋白有诸多优点，分子量相对较小，没有糖基化，使其容易在成本较低的原核或低等真核表达系统中得到高效表达。更重要的是n蛋白抗原性强，根据sars的血清学研究，利用sars病毒n蛋白的抗体检测试剂具有很高的灵敏度，90-100%的sars病人血清能与n蛋白产生抗原抗体反应，而仅有78%的sars阳性病人血清与s蛋白反应。n蛋白是最保守和最稳定的蛋白。sars-cov-2的n蛋白与sars-covn蛋白具有90％的氨基酸序列同一性，与造成季节性流感的人类冠状病毒hcovs，如hcov-oc43和hcov-229e等也有极高同源性。gorse等人在2010年发表文章揭示全球有90%的人群具有针对流感人类冠状病毒的抗体。

woo等研究者在2004年的一项研究发现使用全长n蛋白检测sars病毒抗体时，假阳性率高达87%（在检测阳性的33个样本中有29个为假阳性）。而2006年maache等学者的一项研究也指出n蛋白用于测sars抗体完全无法区分阳性血清和健康人血清。而基于s蛋白的抗体检测则具有较低的假阳性率。

技术实现要素：

本发明目的是：提供一种新型冠状病毒n蛋白抗原变体，在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长n蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题。

本发明的再一目的在于：提供上述变体在新型冠状病毒抗体检测中的应用。

本发明提供了一种冠状病毒n蛋白的抗原肽，在有效捕获病毒抗体同时，大幅降低了因全长n蛋白的非特异性反应所造成的病毒抗体检测的假阳性问题，有效提高了新型冠状病毒抗体检测的专属性。

本发明提供了一种多肽，所述的多肽是冠状病毒n蛋白表位肽的突变体，具有冠状病毒n蛋白表位肽活性并且在c端添加半胱氨酸残基，在本发明中称为冠状病毒n蛋白表位肽变体；

突变发生的氨基酸残基位点选自：

第342的赖氨酸、第347的赖氨酸、第387的赖氨酸、第388的赖氨酸突变为同源性较低的氨基酸；

所述的冠状病毒n蛋白编码第340-419的多肽序列如seqidno7所示。

所述的n蛋白可以是冠状病毒的n蛋白，例如seqidno1显示了新冠病毒n蛋白的序列。

较好的，所述的突变发生的氨基酸残基突变为丙氨酸。

即在新型冠状病毒n蛋白340-419间80个氨基酸残基的多肽的基础上，在n蛋白的第342的赖氨酸（k）或/和第347的赖氨酸（k）或/和第387的赖氨酸（k）或/和第388的赖氨酸（k）突变为同源性较低的氨基酸，并且c端添加半胱氨酸（c）残基。

较好的，所述的多肽的序列如seqidno2-seqidno6中任意一条所示。

n蛋白表位肽活性是指，该多肽能够被n蛋白的抗体识别或者与n蛋白的抗体识别，相应的多肽能够指示n蛋白的存在。

另外，本发明还提供了所述的多肽在制备检测冠状病毒n蛋白的试剂中的应用。例如，所述的多肽可以作为检测冠状病毒n蛋白的检测标志物，用于捕获或者筛选识别冠状病毒n蛋白的抗体。

较好的，所述的应用包括以下步骤：

制备冠状病毒n蛋白表位肽变体；和/或

将冠状病毒n蛋白表位肽变体与载体蛋白或者大分子聚合物偶联；

检测识别冠状病毒n蛋白的抗体的存在。

制备冠状病毒n蛋白表位肽变体包括人工合成或者使用生物体表达产生所述的多肽或者其衍生物。

人工合成包括化学合成冠状病毒n蛋白表位肽变体或者其衍生物。

本发明中，也可以将编码冠状病毒n蛋白表位肽变体的核酸连接到表达载体，导入宿主细胞内如酵母菌、大肠杆菌，在适合条件下表达所述多肽。

较好的，所述的载体蛋白选自bsa、hsa、klh、ova，或者是检测上可接受的蛋白载体。

所述的大分子聚合物可以是羧甲基纤维素，或者是检测上可接受的大分子载体。

再一方面，本发明提供了一种筛选冠状病毒n蛋白的抗体的方法，所述的方法包括以下步骤：

（1）化学合成冠状病毒n蛋白表位肽变体或者其衍生物，或将编码冠状病毒n蛋白表位肽变体的核酸连接到表达载体，导入宿主细胞内如酵母菌、大肠杆菌，在适合条件下表达所述多肽；

（2）步骤（1）获得的多肽与载体蛋白或者大分子偶联；

（3）偶联多肽固定于固相载体或与胶体金偶联成为金标抗原，用于捕获冠状病毒n蛋白的抗体。用于识别或者筛选冠状病毒n蛋白的抗体。

再一方面，本发明提供了一种抗原组合物，含有：

冠状病毒n蛋白表位肽变体或者其变体衍生物；和

检测上可接受的稀释剂、载体或助剂。

本发明还提供了一种检测试剂，包括冠状病毒n蛋白表位肽变体或者上述抗原组合物。

较好的，所述的检测可以是侧向层析或elisa。

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括检测试纸,所述的检测试纸含有冠状病毒n蛋白表位肽变体。

本发明针对新型冠状病毒抗体检测特异性低的问题，提供了一种n抗原变体，旨在提高新型冠状病毒抗体检测中抗原抗体反应的特异性，降低了与新型冠状病毒同源性高的冠状病毒抗体如sars、人流感冠状病毒抗体的非特异性反应。所述n蛋白抗原变体包含了sars-cov2n蛋白原序列340-419间80个氨基酸残基的多肽，在seqidno1序列的第420位添加半胱氨酸（c），或/和在seqidno1序列的第342的赖氨酸（k）或/和第347的赖氨酸（k）或/和第387的赖氨酸（k）或/和第388的赖氨酸（k）突变为丙氨酸（a）。上述多肽可以用以bsa、hsa、klh及ova为代表的蛋白类或以羧甲基纤维素等大分子聚合物为载体，用于新型冠状病毒抗体的检测。

所述的n蛋白抗原变体的序列选自，但不限于以下表1的序列：

。

所述的新型冠状病毒n蛋白的340-419间80个氨基酸的多肽及此多肽变体，或它们的衍生物，在保持n蛋白强抗原性的同时，能降低抗原蛋白与人流感冠状病毒抗体和sars病毒抗体的非特异性反应，从而提高以此抗原为基础设计的新型冠状病毒抗体检测试剂的特异性。

所述的n蛋白340-419多肽序列如下：

ddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa（seqidno7）。

本发明还提供了获得上述多肽并将其应用于新冠抗体检测试剂的方法，所述方法包括以下步骤：

1)化学合成上述多肽或变体，或将编码所述多肽的核酸连接到表达载体，导入宿主细胞内如酵母菌、大肠杆菌，在适合条件下表达所述多肽。

2)与载体蛋白如bsa进行偶联。

3)偶联多肽以适宜浓度固定于nc膜上，或与胶体金偶联成为金标抗原，用于特异性的捕获新冠病毒抗体。

本发明提供了降低非特异性抗体反应的新型冠状病毒抗原多肽变体或任何形式的含有所述多肽的抗原组合物，可用于新型冠状病毒抗体的检测，包括侧向层析，elisa等新冠抗体检测方法。

本发明提供一种新型冠状病毒n蛋白抗原变体序列，具体涉及n蛋白重要抗原表位多肽的变体，这些变体降低了新型冠状病毒n蛋白作为捕获抗原与其它冠状病毒抗体如sars、人流感冠状病毒抗体的非特异性反应。本发明还披露了所述变体的抗原组合物、用途和方法。

附图说明

图1为实施例1,2,3,4中方法制备的检测试剂进行新冠抗体检测的结果。

具体实施方式

以下以seqidno5的n4为例，通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

抗体检测制备材料：兔抗山羊igg(ab6741)和山羊igg(ab102420)购自abcam公司。胶体金溶液、pvc背板、玻璃纤维结合垫、上样垫及硝酸纤维素nc膜购自上海捷宁生物科技有限公司。硼酸缓冲盐、牛血清白蛋白bsa购自探索平台。

实施例1

n4多肽合成

根据多肽合成的常规操作化学合成n4多肽，本实施例合成的n4多肽来源于上海吉尔生化。hplc检测纯度为99%。n4多肽c端增加了半胱氨酸残基，用于提供巯基与bsa的氨基进行偶联反应。

实施例2

抗原片段n4与载体蛋白bsa偶联

bsa购自sigma，采用smcc（4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯）双功能团交联剂将n4多肽与bsa进行偶联。bsa采用smcc交联剂激活，交联剂与蛋白的摩尔比为20，混合均匀在室温下孵育反应30分钟。反应结束后，使用脱盐柱去除未反应的交联剂，透析24小时备用。将n4多肽加入到活化的蛋白溶液中，bsa与合成多肽按照质量比1：1进行偶联反应，4度下孵育2小时。偶联产物经过透析后冻干备用。

实施例3

n4抗原胶体金偶联物与山羊igg抗原偶联物的制备

将10µg的n4抗原蛋白加入到1mlaunp胶体金溶液(ph8.0)中。室温孵育30min后，加入100µl10%的bsa，对aunp表面进行封闭。室温孵育15min后,8000rpm离心15分钟，弃上清，加入1ml硼酸缓冲液（20mm,ph8.0,含1%bsa）重新悬浮。离心和重悬步骤重复2次，最终以100µl硼酸缓冲液（20mm,ph8.0,含1%bsa）重悬待用。

同样方法制备山羊igg胶体金偶联物，与上述n4抗原胶体金偶联溶液以1：4的比例混合均匀待用。

实施例4

双抗原夹心法新冠抗体快速检测试纸的制备

上述金标混合物用0.6mnacl、2%bsa(w/v)、3%蔗糖(w/v)、0.2%tween-20(v/v)和0.1%叠氮钠(w/v)的硼酸缓冲液（20mm,ph8.0）稀释2倍，喷洒到玻璃纤维结合垫上，于37°c烘干2小时备用。将bsa偶联的n4抗原冻干粉用10mmpbs缓冲液配制为2mg/ml溶液，和兔抗山羊igg（1mg/ml）抗体分别在检测线（t线）和质控线（c线）上固定。将nc膜、上样垫、结合垫分别组装到pvc背板上进行切割和处理。

实施例1,2,3,4中方法制备的检测试剂进行新冠抗体检测的结果如图1所示,以实施例1中合成的n4多肽，以实施例2所示方法进行bsa偶联，产物一部分用于实施例3中的胶体金偶联，另一部分以实施例4所述浓度固定于nc膜上捕获新冠抗体。结果显示，n4能够快速、准确的用于新冠病毒的甄别。

图1中自左到右1-20为新冠阳性血清样本编号，对号√标记为试剂成功检出的样本,以n4多肽为捕获抗原，用实施例1,2,3,4方法制备的新冠抗体检测试剂检出率达到90%。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

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<110>上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

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