本发明涉及一种筛选利福霉素sv高产菌株的方法，特别是一种氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法。
背景技术：
：：利福霉素sv类抗生素由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。利福霉素sv类药物有：利福霉素svb二乙酰胺、利福平等。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。利福霉素sv的结构式如下：在现行的利福霉素sv批培养发酵工艺中，大多仅仅采ph、do、温度等作为控制策略的依据和手段。这些参数大多数情况仅仅能反应出设备的性能或者操作条件，而不能实时的、真实的反应出微生物的生理状态。福霉素发酵过程属于耗氧发酵，供氧对生产菌株的生长和产物形成有着重要的影响。在利福霉素发酵过程中，必须提供合适的搅拌和通气，菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。此外，在不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，发酵液的供氧能力的大小直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。因此研究供氧大小对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(dissolvedoxygen,简称do)来表征供氧水平，通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制do。由于利福霉素属于次级代谢产物，发酵周期较长，因此培养基中往往会加入大量的豆饼粉、花生饼粉、玉米粉等原料，这些原料溶解和灭菌处理后，发酵液的粘度较高，限制了氧的传递。同时利福霉素发酵前期，随着菌体浓度的增长，发酵液粘度急剧上升。发酵中前期的氧供应对于菌体生长和启动利福霉素sv合成非常关键。为了保证充足的氧供应，需要提升搅拌转速和空气流量来维持一定的供氧水平，造成了大量的动力消耗，同时，高的搅拌功率对菌体也有很大的损伤，影响菌体的生长和合成代谢。能够适应利福霉素大型生产发酵罐中供氧能力限制的生产菌株的获得一直是本行业生产菌筛选的关键，然而相应育种方面的研究较少，仅有的一些研究主要采用常规的诱变育种技术，进行突变株的筛选，很难筛选到能够耐受氧限制环境的高产菌株。也有从发酵培养后期的发酵液中分离相应的耐受低氧的菌株，但分离到的菌株很难具备低氧环境的高效表达特性，也难于实现性状的稳定遗传。发明人检索到以下相关专利文献：cn105505915a公开了一种使用artp诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，采用新型常压室温等离子体射流诱变系统构建降解甲醛菌株的诱变育种体系，结合高浓度甲醛梯度双层琼脂培养基筛选手段，获得一系列高活性耐受甲醛降解效率发生变化的突变株。cn109797116a公开了一种通过叠加式artp诱变筛选强抑菌活性的海绵共附生链霉菌hns054突变株，将链霉菌(streptomycessp.)hns054与金黄色葡萄球菌分别进行振荡培养；制备野生链霉菌单孢子悬液；对野生型链霉菌孢子进行artp诱变；artp诱变致死率和阳性率的计算；诱变菌株的筛选；抑菌活性的测定。通过3轮叠加式artp诱变对菌株进行诱变处理，并与抑菌活性筛选相结合，增强了诱变强度，使得基因突变范围更广，突变效率更快。优化后的诱变时间为120s，致死率为99％左右时，更容易获得活性突变菌株。采用多次诱变的方法，最终获得了3株抑菌直径增加了27％左右且遗传性能稳定的突变株。以上这些技术对于如何提供一种氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法，该方法能筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出良好的发酵生产能力，并未给出具体的指导方案。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法，该方法能筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，高产菌株的遗传稳定性好，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出良好的发酵生产能力。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法，所述方法是基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，其技术方案在于所述方法包括如下工艺步骤：在利福霉素sv的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株；在筛选培养基中添加0.8～1.2g/l的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在0.8～1.2g/l，将低温等离子体artp诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率(21.3±2.0％)。所述的耐受氧限制的高产菌株在低氧供应水平下利福霉素sv的产物合成量≥7900mg/ml。上述技术方案中，优选的技术方案可以是，所述的氧限制模型中无水亚硫酸铵的添加量最好为1.0g/l。低温等离子体artp诱变处理时间最好为25秒。综上所述，本发明的方法是一种基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，在筛选培养基中添加无水亚硫酸钠制备筛选平皿，将artp诱变处理的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，高模型能够显著提升筛选菌株的正突变率，并实现在设备氧限制条件下大幅度提升发酵水平。本发明针对上述已有技术中的难题，本发明将微生物菌种诱变处理技术与氧限制模型相结合，筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，高产菌株的遗传稳定性好，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出较好的发酵生产能力。本发明通过定向氧限制模型，筛选能够耐受低氧环境的利福霉素高产菌株，结果表明筛选到的耐受低氧的突变菌株能快速提升利福霉素sv的发酵效率。以下为实验部分：1.材料和方法1.1菌种和培养基菌种：地中海诺卡氏放线菌(即地中海诺卡氏菌)，可以由河北欣港药业有限公司提供(公司内部编号：地中海诺卡氏放线菌nsmxg-b23)。种子培养基(g/l)：葡萄糖40g，蛋白胨20g，鱼粉4.6g，硝酸钾5.8g，碳酸钙2.6g，泡敌1ml，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。发酵培养基(g/l)：葡萄糖55g，蛋白胨10g，豆饼粉34g，鱼粉6.6g，硝酸钾10.6g，碳酸钙5.3g，泡敌1ml，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。1.2仪器和试剂仪器：常压室温等离子体诱变仪artp-iis型(北京思清源生物技术公司)：artp诱变；5l反应器(上海国强生化工程装备有限公司)：发酵培养；高效液相色谱(美国agilenttechnologiesinc.agilent1100series)：尾气质谱仪(上海舜宇恒平仪器有限公司):气体中o2、co2检测；发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司15l和50l自动发酵罐；国家生化工程中心biostar软件包；722型紫外一可见分光光度计；旋转式摇床。无水亚硫酸钠：上海国药化学试剂有限公司。二氧化碳培养箱：在四台不同的二氧化碳培养箱中，通过调节空气和二氧化碳的比例，控制氧浓度为12％的浓度。1.3培养方法1.3.1arpt处理方法：artp诱变仪采用99.99％以上的高纯度氦气作为工作气体，工作时可变参数载气量10slm(l/min)，工作时间(0、10、15、20、25、30、35和40s)进行诱变处理。吸取10μl菌悬液均匀涂抹在无菌金属载片上，用镊子将载片准确放置于载物台的凹槽中，把装有990μl无菌水的ep管卡入对应的载片下方。关闭舱门，设置好工作条件，进行诱变。待照射结束后，金属载片会自动落入下方的ep管中。将ep管置于旋涡振荡器上剧烈震荡1min，使载片上的菌液洗脱完全，即得诱变后的菌悬液。将不同处理时间得到的菌液进行梯度稀释(一般稀释至10-4倍)，取100μl涂布于固体平板上，每个样品做3个平行，29℃避光培养6～7d，根据平板上的菌落数目绘制致死率曲线。1.3.2氧限制模型：将过滤除菌的无水亚硫酸钠溶液按照不同的设计浓度加入到热的固体培养基中摇匀，再倒入培养皿(直径90mm，装培养基25ml)上制备不同浓度的氧限制平板，添加浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0g/l。将诱变处理后的菌悬液涂布于不同浓度的氧限制平板上，每个浓度做5个平行，29℃避光培养6～7d，统计各浓度平板上的菌落个数计算致死率，并挑选不同形态的菌株。1.3.324孔板培养无菌条件下，从培养6～7d的新鲜平板上挑取外观饱满、孔板种子培养：用接种铲从挑取单菌落菌苔，直接打入24孔板中，29℃，240rpm振荡培养28h。将种子液接入按照15％的接种量接种到孔板发酵培养基中进行发酵，29℃，240rpm振荡培养136h。1.3.4种子培养用无菌竹签从新鲜培养的平板上挑取2～3个单菌落，接于装有50ml种子培养基的50ml三角摇瓶中，32℃、振荡(220r/min)培养28h。当种子液od700达到6时，转接至发酵培养基中。1.3.5发酵培养发酵摇瓶：按16％的接种量将种子液转接到500ml三角摇瓶或5l反应器中，摇瓶培养基装液量45ml，32℃、振荡(220r/min)避光培养48h，5l反应器培养基装液量2l，32℃避光培养100h。种子罐：15l种子罐中装量8l，将母瓶种子按10％-15％接种量接种，培养温度29℃，用转速和通气量控制溶氧水平不低于15％，自然ph控制，培养周期约50小时。发酵罐：50l发酵罐装量30l，用经过蒸气灭菌的一种管道从15l种子罐中移种5l，温度控制在29℃，用转速和空气空气控制溶氧水平不低于10％，自然ph控制，过程中补加葡萄糖和水，培养周期约136小时。1.4测定方法：还原糖测定：dns方法。生物量测定：离线测定采用湿体积法，将10ml发酵液置于离心管，4000rpm离心15min，将离心上清倒入量筒，根据上清的体积计算出发酵液的体积。孔板发酵菌浓测定，取1ml发酵液到ep管，4000rpm离心15min后，将上清倒出计量体积得到菌体离心体积浓度。效价测定：向孔板发酵后离心得到的发酵清液中吸取0.3ml样品，用ph＝4.6的乙酸缓冲液稀释至约150μg/ml，离心后吸取0.3ml滤液于两试管中，分别加入氧化剂(0.1％亚硝酸钠)、还原剂(0.1％抗坏血酸)各2.7ml，摇匀后放置5min，在455nm处以氧化剂为空白对照，测得还原剂的吸光度经计算即得发酵液的效价。温度：铂温度电极在线测定。进气和尾气中氧和二氧化碳的测定:采用美国extrel过程质谱max300-lg对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析。氧消耗速率our和二氧化碳生成速率cer测定：our和cer的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。以进气和尾气中惰性气体n2维持恒定建立平衡方程，求得our和cer甜菜碱的测定方法：高压液相色谱条件：色谱柱：菲罗门(lunascx,250mm×4.6mm×5um)，流动相：甲醇:乙酸铵水溶液(0.01mol/l)＝100：900，流速：1.0ml/min，检测波长：220nm，柱温：45℃，进样量：20μl。2.结果与讨论2.124孔板高通量培养和检测方法的确定地中海拟分支杆菌生产利福霉素sv是好氧发酵，使用24孔板培养时，不同的培养基装量会引起供氧水平的差异，从而影响产物合成。分别选取每孔1、1.5、2、2.5和3ml的装液量，以同一瓶种子瓶进行接种，接种量10％，发酵136h，考察孔板最适合的供氧水平。由表1可以看出，随着装液量的增加，菌体浓度pmv呈现不断降低的趋势。装液量为1ml时，孔板发酵过程中蒸发量大，发酵液粘度较高，产物发酵单位较低，单位菌体的产量最低。当装液量增加到2.0ml时，菌体保持了较好的生长，发酵结束时的pmv达到了25.2±1.2％，利福霉素sv合成量最高，达到了5408±38mg/l。但随着装液量的提高，菌体量明显下降，菌体生长速率收到限制，氧传递效果的降低也显著限制了利福霉素的生成。单位菌体的比产量对比结果显示，装液量为2ml时，比产量最高达到了214.6±19mg/pmv。因此，在24孔板代替摇瓶进行利福霉素突变菌株的高通量筛选过程中，选择2ml的孔板装液量作为最佳的工作体积。表1初始菌株不同孔板装液量条件下利福霉素的发酵情况装液量(ml)11.522.53摇瓶菌浓(pmv)28.2±1.326.6±1.125.2±1.223.0±0.918.1±1.126.4±1.4单位(mg/l)4920±465265±325408±384739±412953±395620±47比产量(mg/pmv)174.5±13197.9±18214.6±19206.4±16163.1±21212.9±182.1不同artp处理时间对生产菌致死率的影响artp诱变时，固定功率为100w，载气量为10slm，设定不同的处理时间0、5、15、25、35、45、和60s，考察等离子体作用时间对地中海拟分支杆菌致死率的影响。将不同处理时间的菌悬液稀释涂布后，28℃培养5-6d，统计长出的菌落数量，计算得到致死率曲线见图1。从得到的菌体致死率的检测结果可知，该生产菌对等离子体诱变较为敏感，随着处理时间的增长，菌体的致死率显著上升，照射处理时间25秒时的致死率已达到81％以上。照射处理60秒时菌体几乎全部死亡。因此，对于利福霉素sv生产菌菌来说，最佳的artp处理时间为25秒。2.2氧限制条件下地中海拟分支杆菌的筛选模型生产过程中，供氧不足引起的期菌体生长缓慢和产物合成受到限制是影响利福霉素sv发酵生产效率的关键。为了筛选能够耐受低氧环境的突变菌株，本项目采用了以驱氧剂无水亚硫酸钠制作低氧环境培养平皿，来筛选出氧限条件下能够快速生长和合成产物的突变菌株。首先，考察了初始菌株的低氧耐受能力。将初始菌株的菌悬液100万倍后涂布于含有不同无水亚硫酸钠浓度的平皿上，每个浓度做5个平行，封口膜封闭边缘后，28℃避光培养6～7d。从菌落的长出情况来看表2中可以看出，平皿中无水亚硫酸钠的浓度达到1.0g/l时，生产菌几乎没有菌落长出。而且随着无水亚硫酸钠添加量的增加，菌落长出的直径逐渐变小，菌落的色素合成也明显减弱。本研究采取1.0g/l的添加浓度作为筛选压力筛选能够快速生长和合成产物的突变株。表2不同无水亚硫酸钠添加环境对菌落生长情况的影响table4effectsofdifferentconcentrationsofsodiumsulfiteoncolonyformingunits(cfu)2.3artp诱变氧限制模型高产菌株选育结果制备利福霉素的菌体悬浮液，然后进行artp诱变处理，处理的功率为100w，载气量为10slm，处理时间分别为0、5、15、25和35秒。稀释涂布到添加有1.0g/l的无水亚硫酸钠平皿上进行培养7天(同时选择将处理25秒后的稀释菌悬液涂布在没有添加无水亚硫酸铵的平皿上作为对照)。分别在每种处理方式的平皿上挑选长出突变株110株以上，进行孔板初筛，对初筛得到的结果进行突变率统计(表3)。实验结果显示，在氧限制模型条件下，随着诱变处理时间增长到25秒，正突变率呈现明显的增强趋势，随机挑选菌株的最高的正突变率达到了21.3±2.0％，但当处理时间增加大35秒时，正突变率呈现显著下降。负突变率随着处理时间的延长，呈现了明显的升高趋势，而且负突变率明显高于对应的正突变率。总体变异率随着artp处理时间的增长呈现增加趋势。同样的诱变处理时间的情况下，利用氧限制模型的正突变率(21.3±2.0％)显著高于正常平皿培养模型的正突变率(6.1±1.5％)。表3不同处理时间对氧限制模型条件下正突变率的影响注：与出发对照菌株相比发酵单位高出8％以上标记为正突变率，低于5％标记为负突变率。氧限制筛选模型：筛选培养平皿添加0.8g/l的无水亚硫酸钠。正常培养平皿：没有无水亚硫酸钠添加。通过该氧限制模型诱变筛选获得了高产菌株nsmxg-m126，每隔两个月进行一次传代稳定性评测，摇瓶发酵结果显示，该高产菌株能够保持长期稳定的发酵单位在6213mg/l，平均比产量达到了236.6mg/pmv，两项指标分别比对照菌株提高了10.6％和11.1％。能够用于生产应用。表4高产菌株nsmxg-m126六次传代稳定性结果2.450l发酵罐中不同供氧条件下的发酵工艺在50l发酵罐中考察了低供氧和高供氧条件下出发菌株和耐受低氧的高产菌株nsmxg-m126，对利福霉素发酵的影响，发酵总体情况对比见表5。实验结果显示：在低供氧条件下(发酵罐转速380rpm)，筛选到的菌株nsmxg-m126呈现出更高的氧亲和力，our达到了20.7±2.2mmol/l/h，比出发菌株的氧消耗速率(16.5±2.0)高出了25.5％，发酵的最低溶解氧浓度也低于处发酵菌的发酵最低溶氧；菌体浓度pmv达到了30.7±0.8％，明显高于对照出发菌株，该菌浓达到了出发菌株高供氧条件下的菌体浓度(30.9±1.1％)水平。同时，该低氧耐受菌株nsmxg-m126在低供氧条件下利福霉素sv的发酵效价为7656±41mg/l，与出发菌株低供氧条件下的发酵效价相比显著提升，并优于高供氧条件下(510rpm)的出发菌株的发酵效价(7462±47mg/l)；并且生产菌株nsmxg-m126在高供氧条件下利福霉素sv的发酵效价为7935±38mg/l。低供氧条件下，单位菌体的产物合成效率也明显高于出发菌株。可见，该氧限制诱变筛选模型能够高效获得耐受低氧条件的利福霉素高产菌株，其发酵性能明显较出发菌株显著提升。表550l发酵罐不同供氧条件对出发菌株和nsmxg-m126发酵的影响通过上述实验，本发明的方法是一种基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，在筛选培养基中添加0.8～1.2g/l的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，将artp诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，高模型能够显著提升筛选菌株的正突变率，并实现在设备氧限制条件下大幅度提升发酵水平。附图说明图1为菌体致死率曲线。具体实施方式为使本发明的发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。实施例1～3为本发明所述的清洁环保的2-氯-5-氯甲基噻唑的生产工艺。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如图1所示，图1为菌体致死率曲线。实施例1：本发明所述的氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法，是基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，所述方法包括如下工艺步骤：在利福霉素sv的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株。在筛选培养基中添加1.0g/l的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在1.0g/l，将低温等离子体artp诱变处理时间为25秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天(选择6天)，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率(21.3±2.0％)。所述的耐受氧限制的高产菌株在低氧供应水平下利福霉素sv的产物合成量≥7900mg/ml。实施例2：本发明所述的氧胁迫诱变筛选利福霉素sv高产菌株的方法，是基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，所述方法包括如下工艺步骤：在利福霉素sv的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株。在筛选培养基中添加1.2g/l的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在1.2g/l，将低温等离子体artp诱变处理时间为27秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天(选择7天)，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率(21.3±2.0％)。所述的耐受氧限制的高产菌株在低氧供应水平下利福霉素sv的产物合成量≥7900mg/ml。综上所述，本发明的以上各实施例是一种基于氧限制模型和低温等离子体artp诱变处理相结合获得利福霉素sv低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，在筛选培养基中添加0.8～1.2g/l的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，将artp诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，高模型能够显著提升筛选菌株的正突变率，并实现在设备氧限制条件下大幅度提升发酵水平。当前第1页12当前第1页12