一种油溶性光敏剂、其制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物医学新材料领域，具体涉及一种油溶性光敏剂、其制备方法及应用，以及其通过近红外光作用产生光动力与光热效果，从而达到抗肿瘤的目的。


背景技术：

2.染料在肿瘤治疗中有着广泛的应用，如bodipy染料、罗丹明、荧光素、香豆素、萘酰亚胺类染料、菁类染料和酞菁类染料，酞菁类染料从无金属到金属配位，从对称到不对称，从无取代到取代再到不对称多取代，大大丰富了酞菁类化合物的种类。
3.酞菁(pc)是一种染料光敏剂，由于其吸收波长长(λ
max
660nm)，消光系数高(λ
max
>105l mol
‑1·
cm
‑1)，已被广泛用作光动力疗法(pdt)的光敏剂。以及通过简便的化学修饰可调节的光物理和光化学性质。迄今为止，alpc，sipc，znpc目前已经达到临床测试的水平。抗磁性离子(例如zn
2+
，si
4+
和al
3+
)与pc配合物具有较高的系统间交叉效应和较长的三重态寿命。因此，这些配合物(znpc，sipc和alpc)通常显示出很强的光化学性质和相反，光动力学活性成为临床光动力治疗的主要候选对象。相反，顺磁性离子(如cu
2+
，co
2+
或ni
2+
)是系统间交叉效应低且三重态寿命短的mpc化合物，导致弱光动力活性，后者的配合物(cupc，copc和nipc)预计会在适当的激光激发下产生较强的热效应。铜酞菁是最常见的一种青色染料，由于其很好的光热效果，在肿瘤治疗中也有着一定的研究。
4.白蛋白是血液中含量最多的血清蛋白，由于其稳定性好，生物相容性高，能够有效的穿透细胞膜所以尝尝被选作为药物、rna和光敏剂的载体。最为常见的血清蛋白为牛血清白蛋白(bsa)以及人血清白蛋白(hsa)，通过与药物相结合形成纳米粒子，可有效降低药物以及光敏剂的毒性，提高疏水药物，光敏剂的水溶性，生物相容性，通过高通透性和滞留效应增强被动靶向能力，提高药物在肿瘤处的富集。
5.由于合成的铜酞菁光敏剂疏水性，使其穿透细胞膜有较大阻力，而白蛋白很好解决了其生物相容性，以及穿透细胞膜的目的。
6.在chem.sci.，2018.9.2098的文章中设计了两种以铜酞菁为母体，周围修饰不同基团的化合物，并且检测出它们具有良好的光热效果，在加入表面活性剂后，光热效果明显的提升，但只测试了其光热效果，并没有测定其光动力效果，结构如下所示
[0007][0008]
在2019年，华东师范大学tian教授等人开发了一个多功能cupc@hg@bn诊断治疗平台组成的六方氮化硼纳米片(h
‑
bnns)、共轭dna寡核苷酸，和铜(ii)酞菁(cupc)分子在光动力疗法(pdt)双关键角色以及对mir
‑
21表面增强拉曼光谱(sers)原位监测和成像。但其合成复杂，成本较高，操作测试复杂，并且没有检测铜酞菁的光热效果。
[0009]
尽管有这些研究进展，但铜酞菁作为光敏剂治疗肿瘤的研究较少，可以作为光热光动光敏剂从而达到抗肿瘤的目的。


技术实现要素：

[0010]
为克服现有技术中存在的问题，本发明合成了一种在有机溶剂中溶解性较高的油溶性光敏剂的方法，并且研究了该油溶性光敏剂的应用，具体为以白蛋白通过疏水作用、氢键作用以及范德华力包覆该油溶性光敏剂形成纳米粒子；该纳米粒子具有粒径分布均匀，稳定的特点，在近红外光作用下，纳米粒子可产生光动力与光热效果，从而达到抗肿瘤的目的。
[0011]
在本发明的第一方面，涉及到一种油溶性光敏剂，具体通过在酞菁分子上引入一些亲脂性取代基获得。这些取代基的空间位阻比较大，就会破坏酞菁分子间的聚集作用，从而增加光敏剂在有机溶剂中的溶解性，并且具有苯环结构的胺类化合物可以增加光敏剂的耐候性。以下对本发明的技术方案和保护范围描述如下：
[0012]
本发明的第一方面在于保护一种油溶性光敏剂，该光敏剂分子结构为c
‑
so2‑
a，其中c为酞菁光敏剂的发色母体，a为碳数至少为4的长碳链、支链或苯环的胺类化合物，a与发色母体c相连，组成c
‑
so2‑
a光敏剂分子。
[0013]
进一步的，优选的技术方案中，所述的c
‑
so2‑
a光敏剂为金属络合酞菁，所述金属
络合酞菁是具有通式i的化合物或其混合物：
[0014][0015]
其中：
[0016]
m选自氢原子、金属原子、金属氧化物、羟基化合物或卤化物中的至少一种；
[0017]
pc为酞菁母体环；
[0018]
k’选自h、金属离子、铵盐，有机铵盐中的至少一种；
[0019]
a选自碳数至少为4的长碳链、支链或带有苯环的胺类化合物中的至少一种；
[0020]
a、b分别取值0、1、2、3或4；且a和b的总和为3或4；优选0≤a≤2，更优选0≤a≤1；0≤b≤3，优选2≤b≤3；a值越小光敏剂的水溶性越小，b值越大光敏剂的油溶性越大。
[0021]
即mpc为酞菁母体，mpc酞菁母体中的pc为酞菁母体环；所述取代基so3k’和so2a分别连接于pc的酞菁苯环上。
‑
so2a基团对光敏剂油溶性有很大作用，是除光敏剂母体的主要结构，
‑
so3k’基团对光敏剂的水溶性具有一定影响。
[0022]
进一步的，优选的技术方案中，在本发明通式i中，所述a为
‑
nr1r2，其结构通式如ⅱ所示；
[0023][0024]
其中：r1和r2分别选自h、c2‑
20
的烷基、c
6,12,18,24
的芳基(所述c
6，12,18，24
的芳基优选c
18,24
)、或具有取代基选自b的苯基或萘基、或(cr3r4)
n
b中的至少一种；其中，所述的c2‑
20
的烷基中c个数2
‑
20为整数；优选的，所述r1和r2分别选自c5‑
20
的烷基，更优选c8‑
20
，再优选c
10
‑
20
，烷基的碳原子数越多，光敏剂的油溶性越好，其中，所述的c个数2
‑
20、5
‑
20、8
‑
20、10
‑
20均为整数。当r1和r2各自选自c6‑
c
18
的芳基，具有取代基为b的苯基或萘基，光敏剂的油溶性会变差。
[0025]
所述(cr3r4)
n
b中，r3或r4分别选自h、c2‑
c
12
中的一种；n选自1
‑
20中的整数；n优选5
‑
20，更优选8
‑
20，再优选10
‑
20，n值越大，光敏剂的油溶性越好；
[0026]
所述(cr3r4)
n
b中，取代基b选自cl、br、i、no2、ch＝ch2、
‑
och3、羟酸酯基中的一种。
[0027]
进一步的，优选的技术方案中，所述金属原子选自li、na、k、mg、ti、zr、v、nb、ta、cr、mo、w、mn、fe、co、ni、ru、rh、pd、os、ir、pt、cu、ag、au、zn、cd、hg、al、ga、in、si、ge、sn、pb、sb、bi中的至少一种；优选铜、铁、镍、锌、铝和硅中的至少一种，更优选铜。金属氧化物选自mgo、al2o3、fe2o3、cuo、zno；羟基化合物选自zn(oh)2、mg(oh)2、cu(oh)2、al(oh)3、agoh中的至少一种；卤化物选自zncl2、fecl2、alcl3、cucl2、mgcl2、sncl2、pbcl2中的至少一种。
[0028]
进一步的，优选的技术方案中，在本发明通式i中，所述的k’选自h、li、na、k、nh4、n
(ch3)4、nh(ch3)3、nh2(ch3)2、nh3ch3中的至少一种，更优选h、li、na、k、nh4、n(ch3)4中的至少一种。
[0029]
进一步的，优选的技术方案中，所述的mpc的结构式如通式ⅲ的酞菁：
[0030][0031]
进一步的，优选的技术方案中，所述的通式i的化合物如通式ⅳ所示：
[0032][0033]
本发明的第二个方面在于公开所述油溶性光敏剂的制备方法，其包括如下步骤：先将mpc进行氯磺化或引入反应性的磺酰氯，形成酞菁磺酰氯中间体1：[mpc(so3h)
p
(so2cl)q]；通过与酞菁磺酰氯中间体1反应时加入碱性试剂实现阳离子k’的调控。
[0034]
进一步的，优选的制备方法的技术方案中，所述制备方法包括如下步骤：
[0035]
(1)使mpc与不同分子比的氯磺酸反应；
[0036]
(2)使mpc与不同分子比的氯磺酸以及不同分子比的化合物v进行反应得mpc磺化物；所述的化合物v选自氯化亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷或光气；
[0037]
(3)将mpc磺化物与不同分子比的化合物v进行反应获得mpc磺酰氯1；
[0038]
步骤(1)(2)(3)的反应式如下：
[0039]
mpc+dhso3cl
→
mpc(so3h)
p
(so2cl)q
[0040]
mpc+ehso3cl+fso2clpcl3/pcl5/pocl3cocl2→
mpc(so3h)
p
(so2cl)q
[0041]
mpc(so3h)
p+q
+ghso3cl+hso2cl/pcl3/pcl5/pocl3/cocl2→
mpc(so3h)
p
(so2cl)q 1
[0042]
其中：1≤d≤500；0≤e、f、g、h≤500；且d、e、f、g、h均为整数；
[0043]
(4)mpc磺酰氯1在碱性试剂的作用下与nhr1r2反应，形成结构2；
[0044]
步骤(4)的反应式如下：
[0045][0046]
上述分子比d、e、f、g、h、i可根据p、q的需要调整，而p、q根据目标产物1中a、b的需要进行确定。
[0047]
在实际应用中，上述合成的化合物通常为混合物，混合物的分离和单一化合物的纯化，可以采用柱层析分离，此外，所合成的光敏剂如果分离后紫外可见光谱的性质大致相同，可以不分离。
[0048]
对于上文所述的制备方法的技术方案中，具体优选的情况下，步骤(4)所述的碱性试剂选自氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、三乙胺中的一种。
[0049]
对于上文所述的制备方法的技术方案中，具体优选的情况下，当通式i化合物为铜酞菁青色染料光敏剂的时候，当通式i化合物为铜酞菁青色染料光敏剂时，对cupc而言，其合成步骤与mpc合成步骤相同，可先氯磺化或引入反应性的磺酰氯，形成酞菁磺酰氯中间体3：[cupc(so3h)
p
(so2cl)q]，而阳离子k’的调控，可以通过反应时加入碱性试剂来实现，即步骤(1)中的mpc为cupc；所述的化合物v为氯化亚砜。具体操作步骤如下：
[0050]
(1)使cupc与不同分子比的氯磺酸反应；
[0051]
(2)使cupc与不同分子比的氯磺酸加不同分子比的氯化亚砜进行反应；
[0052]
(3)将cupc磺化物与不同分子比的氯化亚砜进行反应；
[0053]
cupc+dhso3cl
→
cupc(so3h)
p
(so2cl)q
[0054]
cupc+ehso3cl+fso2cl
→
cupc(so3h)
p
(so2cl)q
[0055]
cupc(so3h)
p+q
+ghso3cl+hso2cl
→
cupc(so3h)
p
(so2cl)q 3
[0056]
其中d为1
‑
500；e、f、g、h为0
‑
500，数值相同或不同，且d、e、f、g、h均为整数。
[0057]
cupc磺酰氯3可首选在碱性试剂的作用下与nhr1r2反应，形成最终结构4
[0058][0059]
上述分子比d、e、f、g、h、i可根据p、q的需要调整，而p、q根据目标产物1中a、b的需要进行确定。
[0060]
本申请的另一方面在于保护一种由白蛋白包覆上文所述的油溶性光敏剂形成的纳米粒子，所述的纳米粒子是油溶性光敏剂进入白蛋白分子的空腔中形成，其中，油溶性光敏剂的疏水基团与白蛋白的疏水空腔发生疏水作用；白蛋白通过氢键作用以及范德华力包覆油溶性光敏剂。
[0061]
对于上文所述的技术方案中，进一步的，所述白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或动物血清白蛋白中的至少一种。
[0062]
本申请的另一方面在于保护上文所述的纳米粒子的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0063]
(1)将油溶性光敏剂溶于有机溶剂中；再配制白蛋白水溶液；
[0064]
(2)将含有油溶性光敏剂的有机溶剂逐渐滴加到白蛋白水溶液中，至少搅拌30min，加入碱性物质调节溶液的ph为7
‑
10.5、优选ph为8
‑
10，再在5
‑
50℃、优选20
‑
40℃搅拌至少12h，优选至少18h，再进行透析脱水处理得终产品。
[0065]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，步骤(1)中，白蛋白分子在水溶液中的浓度为1
‑
200mg/ml、优选为30
‑
100mg/ml。
[0066]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，步骤(1)中所述油溶性光敏剂的浓度为1
‑
50mg/ml、更优选的浓度为1
‑
10mg/ml。
[0067]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，步骤(1)中，加入有机溶剂的体积与白蛋白水溶液的体积比为(0.1
‑
10)：10；进一步优选的体积比为(1
‑
3)：10。
[0068]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，所述步骤(1)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、异丁醇、和四氢呋喃中的至少一种。
[0069]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，步骤(2)中加入的碱性物质选自三乙胺、碳酸钠、碳酸钾和碳酸氢钠中的至少一种。
[0070]
对于上文所述的纳米粒子制备方法的技术方案中，进一步的，所述透析处理的温度为0
‑
40℃，优选为20
‑
30℃；所述透析的截留分子量为500da
‑
100kda；优选为3000da
‑
12kda；脱水处理方法选自高速离心、冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥或减压蒸馏。
[0071]
对于上文所述的应用的技术方案中，所述油溶性光敏剂在近红外光的照射下产生光动力与光热治疗效果，并且经白蛋白包覆后提升了其光动力与光热治疗效果，所述的近红外光的波长为671nm，功率为0.5
‑
2.5w/cm2，优选功率为0.8
‑
1.5w/cm2。
[0072]
本发明的有益效果：
[0073]
1、本发明所述的油溶性光敏剂可以作为光动与光热治疗的光敏剂，在近红外光的照射下产生光动力与光热效果，其具有很好的治疗效果，同时也具有光动力治疗与光热治疗联合的优势。
[0074]
2、本发明所述的光敏剂以白蛋白作为运输载体，形成一种由白蛋白包覆的油溶性光敏剂纳米粒子，白蛋白增加了其水溶性以及生物相容性，增强了通透性和滞留效应从而提高了被动靶向癌细胞的能力，增加药物在肿瘤处的富集。
附图说明
[0075]
图1：不同浓度下光敏剂在dmf中的紫外吸收光谱；
[0076]
图2：cupc
‑
bsa nps的透射电镜图；
[0077]
图3：cupc
‑
bsa nps在pbs中的粒径分布；
[0078]
图4：在波长为671nm功率为800mw
·
cm
‑2激光照射10mincupc
‑
bsa nps的温度变化；
[0079]
图5：在波长为671nm功率为800mw
·
cm
‑2激光照射10mincupc的温度变化；
[0080]
图6：以dpbf作为亚甲基蓝活性氧检测的紫外吸收光谱；
[0081]
图7：以dpbf作为cupc的活性氧检测的紫外吸收光谱；
[0082]
图8：以dpbf作为cupc
‑
bsa nps的活性氧检测的紫外吸收光谱；
[0083]
图9：dpbf的时间与吸收的线性关系；
[0084]
图10：cupc的mtt细胞毒性实验；
[0085]
图11：cupc
‑
bsa nps的mtt细胞毒性实验。
具体实施方式
[0086]
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。以下通过实施例(但不限于此实施例)来说明本发明光敏剂的合成，
选取其中一种铜酞菁光敏剂作为光热光动试剂，进行生物试验。
[0087]
实施例1
[0088]
5.8g铜酞菁分批加入到11.4ml氯磺酸中，在145℃左右下搅拌反应5小时，冷却到50℃，然后在加入3ml氯化亚砜，在70
‑
80℃温度下回流反应1小时，然后冷却至室温，倒入冰水中，过滤，滤饼用冰水水洗三次。
[0089]
加入3g pc
‑
so2cl到20ml四氢呋喃溶剂中，逐滴加入二异辛胺2.3ml，60℃温度下搅拌反应5h，旋蒸去除四氢呋喃溶液。薄层色谱法检测反应产物，柱层析分离v(甲醇)：v(二氯甲烷)1：1，得到三种产物。
[0090][0091]
实施例2
[0092]
选取dye1
‑
1制备铜酞菁
‑
牛血清白蛋白纳米粒子(cupc
‑
bsa nps)：将2mg的cupc分散在1ml甲醇中。将cupc/甲醇溶液1ml与11ml bsa(30mg)水溶液搅拌12h后，用透析法透析除去铜酞菁小分子，离心后冷冻干燥得到cupc
‑
bsa nps。如图1所示cupc
‑
bsa nps紫外可见分光光度计进行吸收测试，证明最大吸收波长在672nm处；通过透射电子显微镜对纳米粒子进行形貌以及粒径表征，结果如图2、图3所示粒径在110nm左右；证明纳米粒子制备成功，并且分散均匀，粒径均一。
[0093]
实施例3
[0094]
采用热红外摄像机记录样品的实时热成像：cupc
‑
bsa nps在pbs中的浓度分别为20、30和40μm，以pbs作为对比，采用波长671nm，功率为800mw
·
cm
‑1的激光照射每1min记录实时温度，观察温度变化，共照射10min，其结果如图4所示；如图显示了40μm的cupc
‑
bsa nps温度升到48.9℃，而pbs的温度只升到32℃；证明了cupc
‑
bsa nps有明显的光热效果，能通过热杀死肿瘤。
[0095]
实施例4
[0096]
采用单线态氧(1o2)响应探针dpbf评价cupc
‑
bsa nps的1o2生成能力，mb作为标准光敏剂，它在dmf中的单线态氧量子产率为0.52。将dpbf(30μm)与cupc
‑
bsa nps的dmf溶液混合。混合溶液在波长671nm光功率密度为2mw
·
cm
‑1光照射每10s一次，在照射过程中记录不同时间的吸收变化。此外，还记录了dpbf和cupc
‑
bsa nps溶液的吸收光谱变化。单线态氧量子产率计算公式如下：
[0097]
φ
δ
＝φ
mb
×
k
ps
×
f
mb
/(k
mb
×
f
ps
)
[0098]
ps表示待测光敏剂。φ表示单线态量子产率，k表示dpbf随时间增加吸光度值逐渐减小的斜率，f表示吸光度校正因子(f＝1
‑
10
‑
od od表示光敏剂的吸光度值)。其结果如图6、8所示；图中显示cupc
‑
bsa nps单线态氧的量子产率为15.1％；证明了cupc
‑
bsa nps能有效的产生1o2。
[0099]
实施例5
[0100]
mtt细胞活死实验：先将1
×
105个/ml密度的mcf
‑
7细胞(100μl)接种到96孔细胞培养板，置于5％co2，95％湿度，37℃的培养箱内进行培养24h，之后倒掉培养基，再将含有不同浓度梯度的cupc
‑
bsa nps光敏剂的培养基加入孔内继续放入培养箱内培养4h，800mw的激光照射10min后继续放入培养箱培养，12h后移走每个孔内的培养基，然后再加入含有5mg/ml mtt(100μl)的培养基继续培养4h，有大量蓝紫色的结晶生成，小心移走培养基后，加入100μl dmso后轻轻摇晃，之后用酶标仪分别检测570nm和630nm的吸光度值，依据公式计算细胞活性：
[0101][0102]
其结果如图11所示；如图显示了cupc
‑
bsa nps治疗的细胞的活性为31％；证明了cupc
‑
bsa nps对肿瘤治疗有很好的的效果。
[0103]
对比例1
[0104]
采用热红外摄像机记录样品的实时热成像：cupc在pbs中的浓度分别为20、30和40μm，采用波长671nm，功率为800mw
·
cm
‑1的激光照射每1min记录实时温度，观察温度变化，共照射10min，其结果如图5所示；如图显示了40μm的cupc温度升到45.9℃，；证明了cupc有明显的光热效果，能通过热杀死肿瘤，但其热效果低于cupc
‑
bsa nps。
[0105]
对比例2
[0106]
采用单线态氧(1o2)响应探针dpbf评价cupc的1o2生成能力，将dpbf(30μm)与cupc的dmf溶液混合。混合溶液在波长671nm光功率密度为2mw
·
cm
‑1光照射每10s一次，在照射过程中记录不同时间的吸收变化。此外，还记录了dpbf和cupc溶液的吸收光谱变化。单线态氧量子产率计算公式如下：
[0107]
φ
δ
＝φ
mb
×
k
ps
×
f
mb
/(k
mb
×
f
ps
)
[0108]
ps表示待测光敏剂。φ表示单线态量子产率，k表示dpbf随时间增加吸光度值逐渐减小的斜率，f表示吸光度校正因子(f＝1
‑
10
‑
od od表示光敏剂的吸光度值)。其结果如图7所示；图中显示cupc单线态氧的量子产率为13.4％；证明了cupc能有效的产生1o2，但其1o2的产率低于cupc
‑
bsa nps。
[0109]
mtt细胞活死实验：先将1
×
105个/ml密度的mcf
‑
7细胞(100μl)接种到96孔细胞培养板，置于5％co2，95％湿度，37℃的培养箱内进行培养24h，之后倒掉培养基，再将含有不同浓度梯度的cupc光敏剂的培养基加入孔内继续放入培养箱内培养4h，800mw的激光照射10min后继续放入培养箱培养，12h后移走每个孔内的培养基，然后再加入含有5mg/ml mtt(100μl)的培养基继续培养4h，有大量蓝紫色的结晶生成，小心移走培养基后，加入100μl dmso后轻轻摇晃，之后用酶标仪分别检测570nm和630nm的吸光度值，依据公式计算细胞活性：
[0110][0111]
其结果如图10所示；如图显示了cupc治疗的细胞的活性为39％；证明了cupc对肿瘤治疗有明显的效果，但其治疗效果低于cupc
‑
bsa nps。
[0112]
综上，通过本申请实施例3
‑
5和对比例1
‑
3的对比可知，随着时间的增加，温度不断上升，经激光照射后，cupc
‑
bsa nps在10min内温度升到48.9℃左右，而cupc在10min内升温到45.9℃，说明铜酞菁光敏剂具有很好的光热治疗效果，cupc
‑
bsa nps升温效果明显大于cupc，这是由于bsa促进了铜酞菁的分散进而增加了光热效果。通过图9计算得出cupc
‑
bsa nps单线态氧量子产率为15.1％，cupc单线态氧量子产率为13.4％，说明铜酞菁可以通过光激发产生活性氧，并杀死肿瘤，具有一定的光动力治疗效果，并且cupc
‑
bsa nps的治疗效果优于cupc的治疗效果。在不同浓度的cupc
‑
bsa nps与cupc孵育下，细胞没有表现出明显的毒性。但cupc
‑
bsa nps的暗毒性低于cupc的暗毒性，经波长671nm，功率为800mw
·
cm
‑1光照射10min后，cupc与cupc
‑
bsa nps c对细胞造成了明显的光敏化损伤，但cupc
‑
bsa nps效果较好，在浓度为32μm时，最优为31％的细胞活性。
[0113]
综上，铜酞菁光敏剂可以作为良好的肿瘤的光动与光热治疗试剂，白蛋白可以有效的包覆铜酞菁光敏剂进而增强生物相容性以及穿透细胞膜的能力，从而增强抗肿瘤效果。
[0114]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。