1.本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种培养硝化细菌的双微载体及其制备方法和应用。
背景技术：
2.硝化细菌属于好氧自养型微生物，在供养充分的条件下，从氧化氨和亚硝酸盐过程中获得能量进而同化co2而生长，因此自身生长缓慢，世代时间长，特别是在生长过程中还容易受到底物浓度、溶解氧浓度、ph等多种因素的影响，因此增殖速度慢，不容易快速培养，在工业上大规模应用存在难度。
3.硝化细菌通常贴壁生长，在观赏鱼养殖及污水处理中使用移动床生物流化床填料及生化毯等提供较大的附着表面积以利于硝化细菌的附着及生长。与传统载体相比，微载体通常具有更大的比表面积及更好的底物扩散效果，早年在动物细胞悬浮培养方面获得了广泛的应用。壳聚糖可以作为一种微载体使用，但由于壳聚糖是表面带有正电荷的聚合物，具有一定的抗菌性，因此直接用作微载体可能会影响菌体生长。
4.cn109095623a公开了一种提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体及其制备方法，采用以下方法制备：配置na2co3溶液和cacl2溶液；分别加入聚丙烯酸溶液；在混合溶液a中加入十二烷基硫酸钠溶液，制得混合溶液c，然后将混合溶液b倒入混合溶液c中进行反应生成沉淀；将沉淀过滤并洗涤后真空干燥；将壳聚糖溶液溶解于醋酸溶液中，加入碳酸钙纳米颗粒、食用油、司班-80后搅拌，再加入京尼平持续搅拌；或者加入戊二醛溶液，搅拌后继续加入硼氢化盐或乙酰基硼氢化盐继续反应；将沉淀离心分离后并清洗、脱水并晾干后，制得微黄色粉末，即为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。将包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体混悬于水中，逐滴加入至海藻酸钠溶液中，搅拌，离心分离沉淀后清洗，再将沉淀放入质量浓度1～10%盐酸溶液中浸泡处理，处理完毕后离心分离并清洗，离心分离沉淀，最后用丙酮脱水并在室温下晾干，得表面电荷改性的壳聚糖微载体，即为提高好氧硝化菌及亚硝化菌培养密度的微载体。上述微载体可提高硝化菌的培养密度，提高硝化菌扩大培养的经济性。该发明将交联壳聚糖微球滴加入带负电聚合物海藻酸钠溶液中，利用交联壳聚糖进行表面电荷改性制备微载体，微载体表面形成了一层带负电的壳，虽然消除了壳聚糖对硝化菌生长的影响，但降低了与微生物的静电吸附，实际上不利于带负电硝化菌在载体上附着生长。
技术实现要素：
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种培养硝化细菌的双微载体及其制备方法和应用。本发明提供的双微载体可以消除壳聚糖对微生物的不良影响，有利于硝化菌与载体的结合，从而提高硝化细菌培养密度。
6.本发明提供的一种培养硝化细菌的双微载体的制备方法，包括如下内容：制备包埋碳酸钙的交联壳聚糖载体；将包埋碳酸钙的交联壳聚糖载体投加到利用有机
碳源的异养菌培养体系进行吸附生长，培养至对数生长后期停止，取出固体物干燥得到双微载体。
7.本发明中，所述的包埋碳酸钙的交联壳聚糖载体可以采用本领域常规的制备方法获得。交联的方法主要可以采用直接交联、交联中进行化学修饰等。直接交联法使用的交联剂有环氧氯丙烷、戊二醛﹑甲醛﹑冠醚类和京尼平等中至少一种，优选京尼平。交联是壳聚糖与交联剂分子之间发生交联反应，使壳聚糖分子由直链变成网状结构，通过交联可以改善壳聚糖的比表面积和孔结构等物理性能，有效地提高壳聚糖的稳定性。
8.本发明中，所述的异养菌可以是酵母菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌等利用有机碳源的异养菌中的至少一种，优选酵母菌。所述的酵母菌可以选自假丝酵母、隐球酵母、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母、红酵母、球拟酵母或丝孢酵母等中的至少一种，优选热带假丝酵母菌。所述的乳酸菌可以选自乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌等中的至少一种。所述的硫酸盐还原菌可以选自脱硫单胞菌、脱硫线菌等中的至少一种。
9.本发明中，所述的有机碳源根据选择的具体菌种确定，一般为所选择异养菌常规培养采用的糖类、蛋白质、有机酸等含碳有机物，如可以是葡萄糖、己糖、木糖、蔗糖、淀粉等中的至少一种。有机碳源按照加入后体系中质量浓度为1-5g/l进行投加。
10.本发明中，所述的异养菌的培养条件为：温度20-38℃，优选20-30℃，ph为6.0-8.5，优选6.0-7.0；静置发酵或者摇床培养，静置发酵培养每隔30-60min进行搅拌，摇床培养转速为200-600r/min。培养至对数生长后期，一般是培养24h-80h。
11.本发明中，所述的干燥温度为25-50℃，干燥时间为1-5h。
12.本发明所述的培养硝化细菌的双微载体是采用上述本发明方法制备的。所制备的双微载体是以交联壳聚糖为基体，其上吸附生长有异养菌，其中异养菌占载体的5%-50%，优选10%-30%。
13.本发明还提供了一种提高硝化细菌培养密度的培养方法，采用上述本发明提供的培养硝化细菌的双微载体，投加到硝化细菌富集培养体系中。
14.本发明培养方法中，所述的双微载体加入量与硝化细菌富集培养体系中培养液的配比为1-5g/l。
15.本发明培养方法中，所述的硝化细菌加入量与硝化细菌富集培养体系中培养液的体积比为0.5-5%。
16.本发明培养方法中，所述的硝化细菌富集培养可以采用批次换排水也可以采用批次补料的方式。
17.本发明培养方法中，所述的硝化细菌富集培养条件为：温度28-35℃，ph为7.2-8.2，溶解氧为1-5mg/l。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明是采用带有正电荷的交联壳聚糖与利用有机碳源的异养菌作为双微载体，不仅可以消除交联壳聚糖对硝化菌的不利影响，而且可以使硝化菌吸附到双微载体上进行快速生长，提高硝化菌的培养密度。
19.（2）本发明提供的双微载体中的异养菌在用于培养硝化细菌时，在未投加有机碳源及曝气条件下生物活性会逐渐丧失最终细胞死亡，硝化细菌可以逐级取代原异养菌的结合位，吸附到载体上进行快速适应性生长，有助于提高培养密度。
具体实施方式
20.下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
21.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
22.本发明硝化细菌培养密度是指单位体积内硝化细菌的数量。
23.实施例1包埋碳酸钙的壳聚糖微载体的制备具体过程为：首先将2%(w/v)的壳聚糖溶解于1% (v/v)的醋酸溶液共计500ml，加入caco3纳米颗粒 10g，加入5倍体积食用油，加入10ml司班-80激烈搅拌。加入京尼平至其在水相中终浓度为 20mm，持续搅拌24小时，离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，即为包埋碳酸钙的壳聚糖微载体。
24.将上述壳包埋碳酸钙的壳聚糖微载体投加到利用木糖的热带假丝酵母的培养体系进行吸附生长，木糖加入后的质量浓度为2mg/l。培养条件为：温度25℃，ph为6.0-7.0，摇床发酵培养，摇床培养转速为200r/min。培养48h停止，取出固体物，在40℃干燥时间为3h，制得双微载体。经检测，异养菌占载体的30%。
25.实验室配置硝化细菌富集培养液100ml，分装到2个200ml的摇瓶中，其中一个摇瓶按照与硝化细菌培养体系中培养液的配比3g/l加入上述载体，一个摇瓶为不加载体的对照组；然后将活化的硝化细菌按照与硝化细菌富集培养体系中培养液的体积比为5%接种到两个摇瓶中，采用批次换排水的方式进行硝化细菌的富集培养硝化细菌。硝化细菌富集培养条件为：温度32℃，ph为7.8，摇床震荡培养，控制溶解氧浓度为2mg/l。培养30天后分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的5倍。
26.实施例2包埋碳酸钙的壳聚糖微载体的制备具体过程为：首先将重量体积比 2%的壳聚糖溶解于体积比1%的醋酸溶液共计500ml，加入caco3纳米颗粒10g，加入5倍体积食用油，加入10ml司班-80激烈搅拌。加入10ml 25%戊二醛，持续搅拌2小时，加入5g硼氢化钠反应2小时离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，为包埋碳酸钙的壳聚糖微载体。
27.将上述包埋碳酸钙的壳聚糖微载体投加到利用木糖的热带假丝酵母的培养体系进行吸附生长，木糖加入后的质量浓度为3g/l。培养条件为：温度25℃，ph为6.0-7.0，摇床发酵培养，摇床培养转速为200r/min。培养48h停止，取出固体物，在40℃干燥时间为3h，制得双微载体。经检测，异养菌占载体的26%。
28.实验室配置硝化细菌富集培养液100ml，分装到2个200ml的摇瓶中，其中一个摇瓶按照与硝化细菌培养体系中培养液的配比3g/l加入上述载体，一个摇瓶为不加载体的对照组；然后将活化的硝化细菌按照与硝化细菌富集培养体系中培养液的体积比为5%接种到两个摇瓶中，采用批次换排水的方式进行硝化细菌的富集培养硝化细菌。硝化细菌富集培养条件为：温度32℃，ph为7.8，摇床震荡培养，控制溶解氧浓度为2mg/l。培养30天后分析微生
物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的4.5倍。
29.实施例3同实施例1，不同在于：有机碳源采用葡萄糖，异养菌为乳杆菌。经检测，异养菌占载体的10%。将载体用于硝化细菌富集培养30天后分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的4.7倍。
30.实施例4同实施例1，不同在于：有机碳源采用蔗糖，异养菌为脱硫单胞菌。经检测，异养菌占载体的20%。将载体用于硝化细菌富集培养30天后分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的4.3倍。
31.实施例5同实施例1，不同在于：培养条件为静置培养，静置培养每隔60min进行搅拌。经检测，异养菌占载体的25 %。将载体用于硝化细菌富集培养30天后分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的4.8倍。
32.比较例1同实施例1，不同在于：直接采用制备的交联壳聚糖富集培养。将载体用于硝化细菌富集培养30天后，分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的1.4倍。
33.比较例2同实施例1，不同在于：采用异养反硝化菌代替酵母菌。经检测，异养菌占载体的15%。将载体用于硝化细菌富集培养30天后，分析微生物数量，使用双微载体培养密度是未使用双微载体的1.5倍。