基于KASP技术用于水稻整个生育期耐冷基因分型的引物组合及应用的制作方法

基于kasp技术用于水稻整个生育期耐冷基因分型的引物组合及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及作物分子标记育种技术领域，具体涉及基于kasp技术用于水稻整个生育期耐冷基因分型的引物组合及应用。


背景技术：

[0002]
水稻是最重要的农作物之一，起源于热带和亚热带地区，对冷胁迫反应敏感。在高纬度、高海拔地区，冷胁迫严重制约了水稻的生长和生产。
[0003]
在水稻整个生长发育时期都会受到低温胁迫，发芽时期的低温胁迫使水稻发芽率下降，进而影响成苗率；幼苗时期是水稻对低温最敏感的时期，期间的低温胁迫会导致幼苗直接死亡；孕穗期的低温胁迫则会使水稻花粉败育，进而直接导致产量下降。因此，提高水稻耐冷性不能仅仅提高水稻某一时期的耐冷性，而是需要考虑提高其整个生育期的耐冷性，包括水稻苗期、芽期、孕穗期的耐冷性。
[0004]
水稻耐冷性是受多种遗传因素和环境共同调控的数量性状。近些年，已克隆了一些水稻耐冷性基因，但只有具有优异自然等位变异的耐冷基因可以直接用于水稻品种改良，即将耐冷等位基因直接导入至目标品种中便可提高其耐冷性。如cold1(loc_os04g51180)、han1(loc_os11g29290)、bzip73(loc_os09g29820)、osltpl59(loc_os10g36160)、ltg1(loc_os02g40860)、qpsr10(loc_os10g34840)和ctb4a(loc_os04g04330)，这些基因序列均存在广泛的自然变异。ltg3-1(loc_os03g01320)是植物特有的基因，该基因可以显著增强水稻芽期耐冷性，在自然界中存在一些变异位点，其中编码区第46-116位indels：ctccacttcttcaccttctccgacgcgtgcggctgccagtgcggctcatgccctagtcccggcggaggagg/-变异直接导致基因功能差异；大部分籼稻缺失该区段，其低温发芽率相对于包含该区段的粳稻显著下降。cold1(loc_os04g51180)编码区第1091位的碱基变异导致氨基酸的变化，依据该单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)可将核心种质材料cold1分作两种单倍型，二者存在极显著的苗期耐冷性差异。han1启动子区atg上游第1543位的碱基变异导致一个myb转录因子结合元件的变化，该snp可将核心种质材料han1分作两种单倍型，且二者在耐冷性表型上存在极显著的差异。bzip73编码区第511位的碱基变异导致氨基酸的变化，依据该snp可将核心种质材料bzip73分作两种单倍型，二者存在极显著的苗期与孕穗期耐冷性差异。
[0005]
随着人口的增长，对于粮食的需求也越来越高，水稻作为主要的粮食作物之一，保证其高产稳产至关重要。低温胁迫严重威胁着水稻的高产稳产，充分利用水稻耐冷等位基因提高水稻耐冷性至关重要。因此，利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记，筛选野生稻中的有利等位变异，为培育水稻耐冷品种具有重要意义。然而，传统的连锁标记主要是基于与基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，并且操作复杂、通量小、劳动力消耗量大。因此，开发水稻重要耐冷基因标记，利用基因功能标记辅助选择耐冷性较好的目标单株，可以大大提高选
择效率，加快育种进程。
[0006]
kasp基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性pcr，可对各种基因组核酸样品进行snps和indels(insertion deletion)高精度双等位基因分型。kasp技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低。水稻基因组大小约400mb，经探索发现20-50ng dna为最适宜的模板用量，利用上述8个基因功能位点开发的分子标记，对野生稻资源及水稻种质进行有利等位基因的鉴别及不同基因有利单倍型组合筛选，进行特定有利基因的转移和聚合，提水稻耐冷性，可以极大地节省成本，增加选择的准确性和效率，提高育种效率。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种基于kasp技术的稳定、结果准确，可高通量用于水稻耐冷基因分型方法，本发明的另一目的在于提供准确对水稻品种耐冷基因分型的引物组合及应用。
[0008]
本发明所述水稻耐冷基因包括ltg3-1(loc_os03g01320)、cold1(loc_os04g51180)、han1(loc_os11g29290)、bzip73(loc_os09g29820)、osltpl59(loc_os10g36160)、ltg1(loc_os02g40860)、qpsr10(loc_os10g34840)和ctb4a(loc_os04g04330)的基因功能标记。
[0009]
基于本发明的上述技术方案，本发明提供一种用于水稻耐冷基因分型的分子标记组合，该组合含有8个分子标记，所述8个分子标记的信息如表1：
[0010]
表1
[0011][0012][0013]
基于kasp技术开发的用于检测上述功能性分子标记的引物，所述引物的信息见表2：
[0014]
表2
[0015]
[0016][0017]
其中，表2中fam标签序列为gaaggtgaccaagttcatgct，hex标签序列为gaaggtcggagtcaacggatt。上述引物序列分别对应于seq id no:1-24。
[0018]
本发明的分子标记组合中，所述8个分子标记m1-m8分别通过8个特异性引物组依次扩增得到，所述特异性引物组含有2条上游引物，1条下游引物；所述8个特异性引物组含有的引物的核苷酸序列分别如seq id no.1-3，seq id no.4-6，seq id no.7-9，seq id no.10-12，seq id no.13-15，seq id no.16-18，seq id no.19-21，seq id no.22-24所示。
[0019]
本发明提供一种引物组合，含有8个特异性引物组，所述8个特异性引物组中，每组含有2条上游引物，1条下游引物，称为上游引物1,上游引物2,下游引物；8个特异性引物组中含有引物的核苷酸序列分别如seq id no.1-3，seq id no.4-6，seq id no.7-9，seq id no.10-12，seq id no.13-15，seq id no.16-18，seq id no.19-21，seq id no.22-24所示。
[0020]
本发明提供含有所述引物组合的检测试剂盒。
[0021]
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合或含有引物组合的检测试剂盒在水稻整个生育期耐冷基因分型中的应用。
[0022]
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合或含有引物组合的检测试剂盒在水稻整个生育期鉴定耐冷水稻品种、或在水稻耐冷基因有利等位基因鉴别、或水稻不同耐冷基因有利单倍型组合筛选中的应用。
[0023]
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合或含有引物组合的检测试剂盒在基因型辅助选择水稻育种改良中的应用。
[0024]
本发明还提供一种水稻耐冷基因分型方法，采用本发明所述的特异性引物组合，以待测水稻样品的dna为模板，基于kasp技术进行pcr扩增，采用荧光检测仪分析pcr扩增产物的基因型；8个引物组的上游引物1均标记相同的荧光基团，8个引物组的上游引物2均标
记相同的荧光基团，且每组中两条上游引物标记的荧光基团不同。
[0025]
所述pcr扩增的反应体系中，引物混合液含有8个引物组的引物，且每组两条上游引物的终浓度均为12μm，下游引物终浓度为30μm；
[0026]
或所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：利用本发明提供的整套kasp功能标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中耐冷基因的功能等位基因的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。(二)本发明方法能够实现水稻育种材料的重要耐冷功能基因的检测，为水稻耐冷新品种选育、改良提供科学指导。
附图说明
[0028]
图1-图8分别为本发明实施例2中8个基因功能位点标记cold1_kasp、han1_kasp、bzip73_kasp、osltpl159_kasp、ltg1_kasp、qpsr10_kasp、ctb4a_kasp和qltg3-1_kasp在12份水稻材料间的基因型簇图。
具体实施方式
[0029]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0030]
实施例1水稻重要耐冷基因功能标记的开发
[0031]
1、根据文献ma y,dai x,et al.cold1 confers chilling tolerance in rice[j].cell,2015,160:1209-1221的报道。cold1对应于msu基因编号：loc_os04g51180，该基因编码区第1091位snp：t/a变异直接导致基因功能差异。粳稻中该位点为a而籼稻中主要为t，在粳稻中突变cold1可是其苗期耐冷性下降，同时将粳稻中的cold1导入到籼稻中可以显著提高其苗期耐冷性。从msu网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载loc_os04g51180的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.1)依次为fam标签序列和loc_os04g51180有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.2)依次为hex标签序列和loc_os04g51180无功能基因dna序列，下游引物(seq id no.3)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻苗期耐冷性。
[0032]
2、根据文献mao d,xin y,et al.natural variation in the han1 gene confers chilling tolerance in rice and allowed adaptation to a temperate climate[j].proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,2019,116:3494-3501的报道。han1对应于msu基因编号：loc_os11g29290，该基因启动子区，起始密码子atg上游第1543位snp：g/a变异直接导致基因功能差异。该位点的突变直接影响han1的表达，han1的表达直接影响水稻苗期耐冷性。a等位基因表达下降而耐寒性增强，而g等位基因表达升高而耐寒性减弱。从msu网站下载loc_os11g29290的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.4)依次为fam标签序列和loc_os11g29290有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.5)依次为hex标签序列和loc_os11g29290无功能基因
dna序列，下游引物(seq id no.6)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻苗期耐冷性。
[0033]
3、根据文献liu c,ou s,et al.early selection of bzip73 facilitated adaptation of japonica rice to cold climates[j].nature communications,2018,9:3302-3313的报道。bzip73对应于msu基因编号：loc_os09g29820，该基因编码区第511位snp：g/a变异直接导致基因功能差异。粳稻中该位点为g而籼稻中主要为a，在粳稻中突变bzip73可是其苗期耐冷性下降，同时将粳稻中的bzip73导入到籼稻中可以显著提高其苗期耐冷性。从msu网站下载loc_os09g29820的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物(seq id no.7)依次为fam标签序列和loc_os09g29820有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.8)依次为hex标签序列和loc_os09g29820无功能基因dna序列，下游引物(seq id no.9)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0034]
4、根据文献zhao j,wang s,et al.the lipid transfer protein osltpl159 is involved in cold tolerance at the early seedling stage in rice[j].plant biotechnology journal,2020,18:756-769的报道。osltpl159对应于msu基因编号：loc_os10g36160，该基因编码区第40-54位indels：gtggcggtggcggtg/-变异直接导致基因功能差异。绝大部分粳稻该位点为缺失型基因型，而大部分籼稻对应插入型基因型，粳稻该位点为g而籼稻中主要为a，在粳稻中突变bzip73可是其苗期耐冷性下降，同时将粳稻中的bzip73导入到籼稻中可以显著提高其苗期耐冷性。从msu网站下载loc_os10g36160的基因序列，截取该indels上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.10)依次为fam标签序列和loc_os10g36160无功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.11)依次为hex标签序列和loc_os10g36160有功能基因dna序列，下游引物(seq id no.12)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0035]
5、根据文献lu g,wu f,et al.rice ltg1 is involved in adaptive growth and fitness under low ambient temperature[j].plant journal,2014,78:468-480的报道。ltg1对应于msu基因编号：loc_os02g40860，该基因编码区第1070位snp：t/a变异直接导致基因功能差异。绝大部分粳稻该位点为t基因型，而大部分籼稻对应a基因型，将粳稻基因型导入至籼稻中可以提高籼稻整个生育时期的耐冷性。从msu网站下载loc_os02g40860的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.13)依次为fam标签序列和loc_os02g40860有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.14)依次为hex标签序列和loc_os02g40860无功能基因dna序列，下游引物(seq id no.15)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0036]
6、根据文献xiao n,gao y,et al.identification of genes related to cold tolerance and a functional allele that confers cold tolerance[j].plant physiology,2018,177:1108-1123的报道。qpsr10对应于msu基因编号：loc_os10g34840，该基因编码区第343位snp：g/a变异直接导致基因功能差异。绝大部分粳稻该位点为g基因型，而大部分籼稻对应a基因型，将粳稻基因型导入至籼稻中可以提高籼稻幼苗时期的耐冷性。从msu网站下载loc_os10g34840的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.16)依次为fam标签序列和loc_
os10g34840有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.17)依次为hex标签序列和loc_os10g34840无功能基因dna序列，下游引物(seq id no.18)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0037]
7、根据文献zhang z,li j,et al.natural variation in ctb4a enhances rice adaptation to cold habitats[j].nature communication,2017,8:14788-14800的报道。ctb4a对应于msu基因编号：loc_os04g04330，该基因启动子区，起始密码子atg上游第1930位snp：g/c变异直接导致基因功能差异。粳稻中该位点为g基因型，表达量高于籼稻(c基因型)，将粳稻基因型导入至籼稻中可以提高籼稻孕穗时期的耐冷性。从msu网站下载loc_os04g04330的基因序列，截取该snp上下游100bp的序列设计kasp引物：引物19、引物20和引物21；引物19(seq id no.19)依次为fam标签序列和loc_os04g04330有功能基因dna序列，引物20(seq id no.20)依次为hex标签序列和loc_os04g04330无功能基因dna序列，引物21(seq id no.21)为共用序列，其中引物19为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0038]
8、根据文献fujino k,sekiguchi h,et al.molecular identification of a major quantitative trait locus,qltg3-1,controlling low-temperature germinability in rice[j].proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,2008,105:12623-12628的报道。qltg3-1对应于msu基因编号：loc_os03g01320，该基因编码区第46-116位indels：ctccacttcttcaccttctccgacgcgtgcggctgccagtgcggctcatgccctagtcccggcggaggagg/-变异直接导致基因功能差异。绝大部分籼稻由于该位点的缺失而功能丧失，将包含该片段的粳稻基因型导入到籼稻中可以显著提高籼稻的发芽时期耐冷性。从msu网站下载loc_os03g01320的基因序列，截取该indels上下游100bp的序列设计kasp引物：上游引物1、上游引物2和下游引物；上游引物1(seq id no.22)依次为fam标签序列和loc_os03g01320有功能基因dna序列，上游引物2(seq id no.23)依次为hex标签序列和loc_os03g01320无功能基因dna序列，下游引物(seq id no.24)为共用序列，其中上游引物1为有利单倍型，可增强水稻耐冷性。
[0039]
本发明在对上述8组引物的引物设计过程中，参考水稻种质的自然变异(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/)，将引物序列位点设计在保守区避开水稻变异位点，以提高引物对所有水稻适用性。同时发现设计的特异针对靶标的引物组能在单独pcr体系中完成对目标分子标记的鉴定和基因分型工作，但将24条引物在一个kasp体系中进行鉴定，检测效果并不理想，出现由于众多引物的gc含量相差较大从而导致pcr扩增时最佳退火温度相差较大从而导致检测不准确的问题，为解决检测不准确这个问题，发明人通过大量筛选，摸索，对比后，发现最终选用上述设计的这24条引物，在同一反应的pcr程序下，是能最大限度降低体系中多个引物互相干扰的问题，并实现对目标分子标记的准确鉴定和分型。
[0040]
引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用高纯度page方式纯化。引物信息见表3，引物自上而下分别对应seq id no.1-24。
[0041]
表3功能性分子标记的引物序列
[0042][0043]
所述标签fam的核苷酸序列为gaaggtgaccaagttcatgct；所述标签hex的核苷酸序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
[0044]
实施例2水稻重要耐冷基因功能标记的多态性筛选
[0045]
针对8个水稻重要耐冷基因的功能位点分子标记，对包括8份野生稻(包含福建、广东、广西、海南、湖南、云南、江西地方野生稻)2份籼稻(黄华占和玉香丝苗)和2份粳稻(龙粳31和龙粳46)在内的12份水稻材料进行kasp反应，测试标记分型情况。
[0046]
pcr扩增反应使用的体系为5μl：模板dna 2.5μl，引物混合液0.07μl，2
×
asp master mix 2.5μl，引物fam-f、引物hex-f终浓度均为12μm，引物r终浓度为25μm。
[0047]
pcr扩增反应的条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。
[0048]
pcr反应结束后，利用bio-rad cfx荧光定量pcr仪对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果导出成列表格式，即得到表4中基因分型结果。
[0049]
8个耐冷基因功能位点标记在12份材料间基因型簇图分别见图1-图8。针对野生稻及生产上广泛推广的水稻品种黄华占、玉香丝苗、龙粳31和龙粳46进行7个耐冷基因有利等位变异分析，发现野生稻含有的有利耐冷等位基因并不多，说明在野生稻资源中还有其他重要的耐冷基因。同时，黄华占只含有ltg1一个优异的耐冷等位基因，可以定向增加osltpl159有利等位变异，提高芽期低温发芽力，定向增加cold1、qpsr10、han1有利等位变异，提高苗期低温存活率，定向增加ctb4a、bzip73有利等位变异，提高孕穗期低温结实率，达到稳产的目的。同样，对于玉香丝苗、龙粳31、龙粳46等主推品种也可以定向增加耐冷基因的有利等位变异，提高其对低温的适应性，达到稳产的目的。
[0050]
表4测试种质材料分型结果
[0051][0052]
注：表4中cold1_kasp对应的allele 1、2分别为a、t，han1_kasp对应的allele 1、2分别为a、g，bzip73_kasp对应的allele 1、2分别为g、a，osltpl159_kasp对应的allele 1、2分别为gtggcggtggcggtg、-，ltg1_kasp对应的allele 1、2分别为t、a，qpsr10_kasp对应的allele 1、2分别为g、a，ctb4a_kasp对应的allele 1、2分别为g、c,qltg3-1_kasp对应的allele 1、2分别为ctccacttcttcaccttctccgacgcgtgcggctgccagtgcggctcatgccctagtcccggcggaggagg/-。
[0053]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在
本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。