RNF138作为预测结直肠癌对SC75741治疗敏感性的生物标志物的应用的制作方法

rnf138作为预测结直肠癌对sc75741治疗敏感性的生物标志物的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及rnf138作为预测结直肠癌对sc75741治疗敏感性的生物标志物的应用。


背景技术：

[0002]
结直肠癌(colorectal cancer，crc)是常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织最新的有关全球癌症状况的数据显示，结直肠癌的死亡率为实体肿瘤的第三位。近年来，随着经济的发展和生活水平的提高，我国发病率的上升速度达到国际平均增速的2倍，在上海等东部沿海城市，发病率达到实体肿瘤的第二位，成为导致人死亡的主要疾病之一。
[0003]
结直肠癌的化疗方案也受肿瘤耐药问题的困扰。据美国癌症协会估计，死于不同程度的耐药的肿瘤患者占90％以上，肿瘤的耐药问题已经成为肿瘤化疗成功与否的关键因素。患者的化疗敏感性对于化疗效果具有重要的影响作用。
[0004]
肿瘤耐药机制包括低效的细胞药物积累，增加dna修复，增强抗凋亡途径，并激活抗氧化谷胱甘肽系统进行解毒。最近的研究表明，结直肠癌含有肿瘤干细胞(cscs)，它是肿瘤化疗耐药的主要参与者。多细胞表面蛋白被认为是肿瘤干细胞的标志物，包括cd44，cd133，lgr5，epcam和aldh。许多信号通路参与调节cscs，包括hedgehog通路，notch通路，nf-κb通路，pi3k/akt通路和wnt/β-catenin通路。
[0005]
因此，全面分析其耐药性产生的机制，必将对恶性肿瘤临床化疗和药物耐受逆转的深入研究发挥重要的指导作用。
[0006]
为了克服及逆转结直肠癌治疗药物耐受，需要使用准确、灵敏、特异性强的生物标记物辅助尽早判断结直肠癌是否药物耐受及耐受程度，指导临床用药，以提高临床疗效，改善患者预后。


技术实现要素：

[0007]
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测rnf138表达的试剂和/或检测p-p65表达的试剂在制备预测结直肠癌患者预后的产品中的应用。
[0008]
进一步，所述检测p-p65表达的试剂包括检测p-p65在胞浆中表达的试剂、和/或检测p-p65在胞核中表达的试剂。
[0009]
所述检测rnf138表达的试剂包括与rnf138基因结合的核酸或与rnf138蛋白结合的物质，所述检测p-p65表达的试剂包括与p-p65基因结合的核酸或与p-p65蛋白结合的物质。
[0010]
所述与rnf138基因结合的核酸包括扩增rnf138基因的引物，所述与rnf138蛋白结合的物质包括与rnf138蛋白特异性结合的抗体；所述与p-p65基因结合的核酸包括扩增p-p65基因的引物，所述与p-p65蛋白结合的物质包括与p-p65蛋白特异性结合的抗体。
[0011]
根据本发明的另一个方面，本发明提供了rnf138和/或p-p65在制备改善结直肠癌
患者预后的药物中的应用。
[0012]
进一步，所述药物包括促进rnf138表达的试剂和/或抑制p-p65核质比的试剂。
[0013]
抑制p-p65核质比的试剂是指抑制p-p65在胞核和胞浆中表达比值的试剂。这样的试剂包括lkb蛋白、吡咯烷二硫代甲酸铵、羟基红花黄色素a。
[0014]
促进rnf138表达的试剂的种类不受限制，只要是促进rnf138表达即可，这样的例子如rnf138基因过表达载体。
[0015]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了检测rnf138表达的试剂在制备预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的产品中的应用。
[0016]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0017]
更进一步，所述检测样品中rnf138的表达量的试剂包括能够定量样品中rnf138的mrna的试剂，和/或能够定量样品中rnf138蛋白的试剂。
[0018]
本发明的定量样品中mrna的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0019]
进一步，所述试剂包括与rnf138基因结合的核酸。
[0020]
包含在上述试剂中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0021]
进一步，所述pcr方法为已知方法，例如，arms(amplification refractory mutation system，扩增不应突变系统)法、rt-pcr(逆转录酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特异性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可扩增片段长度多态性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(单链构象多态性)法来检测。
[0022]
更进一步，所述核酸包括实时定量pcr中使用的特异扩增rnf138基因的引物。
[0023]
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
[0024]
如本文使用的，术语“引物”是指具有短的游离3
′-
末端羟基的核酸序列，其是短的核酸序列，可以与互补模板形成碱基对并用作模板链复制的起始点。在合适的缓冲液在合适的温度在存在用于聚合的试剂(例如，dna聚合酶或反转录酶)和四种三磷酸核苷的情况下，引物可以起始dna合成。pcr条件和有义和反义引物的长度可以根据本领域中已知技术适当选择。
[0025]
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
[0026]
在本文使用的术语“基因”指编码功能蛋白质、多肽或者肽的单元。如本领域的技术人员所理解的，这一功能性的术语包括两个基因组序列、cdna序列或者其片段或组合，以及基因的产物，包括可以经人工改变的那些。经纯化的基因、核酸、蛋白质等等用于指从至少一种通常与其相关的污染核酸或者蛋白质中鉴定并分离出来的这些实体。术语“等位基
因”或者“等位基因形式”指编码同样的功能性蛋白的基因的可选择的形式，但是含有与同一基因的其他形式相关的核苷酸序列上的差异。
[0027]
如本文所使用的，“核酸”或者“核酸分子”指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(dna)或者核糖核酸(rna)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(pcr)所产生的片段以及通过任意的连接、剪切、核酸内切酶和核酸外切酶活动产生的片段。核酸分子可以由天然产生的核苷酸的单体组成(例如dna和rna)，或者由天然产生的核苷酸的类似物组成(例如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)，或者两者的组合组成。经修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤碱基部分上有改变。糖的修饰包括，例如将一个或者多个羟基以卤素、烷基、胺和叠氮基团替代，或者可以将糖功能化成为醚或者酯。除此之外，整个的糖部分可以用空间上和电子上类似的结构替换，如阿扎糖以及碳环的糖类似物。在碱基部分上修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或者其他公知的杂环替代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者该连接的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺骨架上的天然产生的或者经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或者双链的。
[0028]
本发明的定量样品中rnf138蛋白通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(facs)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。
[0029]
作为实例，本发明的定量样品中rnf138蛋白的试剂包括特异性结合rnf138蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab
′
)2、fab
′
、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。本发明的定量样品中rnf138蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0030]
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的分子标志物蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对分子标志物蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0031]
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用dmso、缓冲剂、等准
备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-nh2、生物素标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-nh2、碱性磷酸酶标记试剂盒-sh(dojindo laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-nh2、过氧化物酶标记试剂盒-nh2(dojindo laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-nh2、藻胆蛋白标记试剂盒-sh、b-藻红蛋白标记试剂盒-nh2，b-藻红蛋白标记试剂盒-sh、r-藻红蛋白标记试剂盒-nh2、r-藻红蛋白标记试剂盒sh(dojindolaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-nh2、hilyte fluor(tm)555标记试剂盒-nh2、hilyte fluor(tm)647标记试剂盒-nh2(dojindo laboratories)；及dylight 547和dylight647(techno chemical corp.)、zenon(tm)、alexa fluor(tm)抗体标记试剂盒、qdot(tm)抗体标记试剂盒(invitrogen corporation)和ez-标记物蛋白质标记试剂盒(funakoshi corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
[0032]
作为依照本发明的检测方法中使用的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液。
[0033]
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的产品，所述产品包括检测样品中rnf138的试剂。
[0034]
上述产品可用于检测样品中rnf138的表达量。
[0035]
在其中一个实施例中，该产品包括检测样品中rnf138的mrna表达水平的试剂。这样的产品可用于检测样品中mrna的含量，该检测可以为定量检测、半定量检测或定性检测均可。
[0036]
进一步，本发明的产品可以是试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用前面所述试剂的高通量测序平台。
[0037]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0038]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将rnf138作为检测的靶目标，当结直肠癌患者体内rnf138高表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有耐药性；当结直肠癌患者体内rnf138低表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有敏感性。
[0039]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将p-p65作为检测的靶目标，当结直肠癌患者体内p-p65低表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有耐药性；当结直肠癌患者体内p-p65高表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有敏感性。
[0040]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将rnf138和p-p65作为检测的靶目标，当结直肠癌患者体内rnf138高表达同时p-p65低表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有耐药性；当结直肠癌患者体内rnf138低表达同时p-p65高表达时，预测结直肠癌患者对nf-κb抑制剂具有敏感性。
[0041]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0042]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种提高结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将rnf138作为靶目标，抑制rnf138表达，以提高结直肠癌患者对nf-κb抑制剂的敏感性。
[0043]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0044]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了rnf138在制备提高结直肠癌患者对nf-κb抑制剂敏感性的药物中的应用。
[0045]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0046]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了抑制rnf138的试剂在制备提高结直肠癌患者对nf-κb抑制剂敏感性的药物中的应用。
[0047]
优选地，所述试剂包括抑制rnf138表达或抑制rnf138活性的试剂。
[0048]
更优选地，所述抑制rnf138表达的试剂包括反义核酸、dsrna、核酶、适体、rnf138结合蛋白片段、或抗体或其片段。
[0049]“dsrna”指含有双链rna结构，通过rna干扰(rnai)来抑制基因表达的rna，包括sirna(短干扰rna)和shrna(短发夹rna)。dsrna不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsrna的一部分用dna替代。优选的是，sirna是21-23个碱基的双链rna。sirna可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在rna的类似物。shrna是具有发夹转角(hairpin turn)结构的短链rna。shrna可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shrna的dna引入细胞并表达dna。
[0050]
更优选地，所述抑制rnf138活性的试剂包括抑制rnf138上游蛋白分子活性的试剂、抑制rnf138蛋白活性的试剂、抑制rnf138下游蛋白分子活性的试剂；优选地，所述rnf138下游蛋白分子包括nf-κb信号通路上的分子，更优选地，所述nf-κb信号通路上的分子包括p-p65、icam1、cox2、ki67。
[0051]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0052]
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括抑制rnf138的试剂和nf-κb抑制剂。
[0053]
进一步，所述抑制rnf138的试剂包括所述试剂包括抑制rnf138表达或抑制rnf138活性的试剂。
[0054]
优选地，抑制rnf138表达的试剂包括反义核酸、dsrna、核酶、适体、rnf138结合蛋白片段、或抗体或其片段。
[0055]
优选地，抑制rnf138活性的试剂包括抑制rnf138上游蛋白分子活性的试剂、抑制rnf138蛋白活性的试剂、抑制rnf138下游蛋白分子活性的试剂。
[0056]
所述rnf138下游蛋白分子包括nf-κb信号通路上的分子，最优选地，所述nf-κb信号通路上的分子包括p-p65、icam1、cox2。
[0057]
进一步，所述nf-κb抑制剂包括ng25、ikk16、bay 11-7082、tomatidine、ptl、jsh-23、sc75741、qnz、cape；优选地，所述nf-κb抑制剂是sc75741。
[0058]
本发明的抑制rnf138表达的试剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制rnf138表达的试剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制rnf138表达的试剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0059]
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0060]
本发明的药物的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
[0061]
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。
附图说明
[0062]
图1显示rnf138基因敲除细胞的western blot结果图，其中，a：hct15；b：hct116；
[0063]
图2显示后续实验所用到的rnf138敲除细胞系的western blot验证图；
[0064]
图3显示sc75741的ic50检测统计图，其中a：hct116；b：hct15；
[0065]
图4显示sc75741处理结直肠癌细胞后生长曲线图，其中，a：hct116；b：hct15；
[0066]
图5显示体内实验结果图，其中，a.：小鼠给药模式图；b：小鼠肿瘤体积记录曲线图，n＝7；c：细胞接种裸鼠18天后取出的肿瘤实物图，n＝7；d：细胞接种裸鼠18天后取出肿瘤并称重的统计图，n＝7；e：肿瘤组织的免疫组化染色图；
[0067]
图6显示rnf138表达量与p-p65核质比对结直肠癌患者生存期影响的结果图，其中，a：rnf138表达量与p-p65核质比相关性分析曲线图；b：rnf138高表达与低表达组结直肠癌患者组织芯片p-p65核质比统计图；c：rnf138表达量与p-p65核质比对结直肠癌患者dfs影响的结果图；d：rnf138表达量与p-p65核质比对结直肠癌患者os影响的结果图；
[0068]
图7显示rnf138
low p-p65 n/c
high
，rnf138
high p-p65 n/c
low
组在结直肠癌患者的临床tnm分期中阳性率百分比统计图，其中，a：tnm；b：t；c：n；d：m；
[0069]
图8显示结直肠癌患者不同临床tnm分期中，p-p65核质比(p-p65 n/c)的统计图，其中，a：tnm；b：t；c：n；d：m；
[0070]
图9显示rnf138
low p-p65 n/c
high
，rnf138
high p-p65 n/c
low
组结直肠癌患者在不同tnm病理分期所占百分比统计图，其中，a：tnm；b：t；c：n；d：m；
[0071]
图10显示mrna水平分析rnf138与cox2、icam1的表达相关性，其中，a：cox2；b：icam1；
[0072]
图11显示利用免疫组化检测rnf138与p-p65、icam1和cox2的表达的染色图；
[0073]
图12显示癌细胞接种小鼠后腹腔注射给药的流程图；
[0074]
图13显示rnf138表达对结直肠癌病人对sc75741敏感性的影响结果图，其中a：肿瘤体积变化曲线；b：肿瘤实物图；c：肿瘤重量结果图；
[0075]
图14显示利用免疫组化检测小鼠肿瘤组织中rnf138、p-p65、ki67、icam1、cox2的表达的染色图。
[0076]
具体的实施方式
[0077]
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0078]
实施例1细胞水平上研究rnf138基因表达对结直肠癌药物治疗的敏感性的影响
[0079]
1、细胞培养
[0080]
hct116和hct15在rmpi1640培养基(添加10％胎牛血清)中培养。6孔板细胞培养板隔天传代扩增细胞，取对数生长期的细胞进行后续实验。
[0081]
2、rnf138基因敲除细胞系构建
[0082]
1)细胞对puromycin最低致死剂量的摸索：细胞铺12孔板，16-24h后加不同浓度梯度的puromycin(0，0.5，1，2，4，8μg/ml)，选择2-3天能使细胞全部致死的最低剂量；
[0083]
2)设计grna序列：选择coding gene的第一个外显子，或选择蛋白质的特定结构域的编码区(cds)作为打靶部位；将基因序列提交至在线设计网站，以mit张锋实验室网址为例，网站为：http://crispr.mit.edu/，选择相应的物种提交即可；根据score的高低选择合适的grna序列，同时在序列的上下游各设计一条引物，用于后续pcr或序列检测；grna序列如下所示：
[0084]
编号1：
[0085]
f1:5
’-
caccgcaaaacgcccgtgcggacca-3’(seq id no.1)，
[0086]
r1:5
’-
aaactggtccgcac gggcgttttgc-3’(seq id no.2)；
[0087]
编号2：
[0088]
f2:5
’-
caccggtgcggacca cggcctgtca-3’(seq id no.3)，
[0089]
r2:5
’-
aaactgacaggccgtggtccgcacc-3’(seq id no.4)；
[0090]
编号3：
[0091]
f3:5
’-
caccgcgtcctacac cgaagatgat-3’(seq id no.5)，
[0092]
r3:5
’-
aaacatcatcttcg gtgtaggacgc-3’(seq id no.6)；
[0093]
编号4：
[0094]
f4:5
’-
caccgacaccgaaga tgatttctac-3’(seq id no.7)，
[0095]
r4:5
’-
aaacgtagaaatca tcttcggtgtc-3’(seq id no.8)；
[0096]
编号5：
[0097]
f5:5
’-
caccgtttctactgccccgtctgtc-3’(seq id no.9)，
[0098]
r5:5
’-
aaacgacagacggg gcagtagaaac-3’(seq id no.10)。
[0099]
3)打靶质粒构建：将grna退火形成双链dna，与载体px330连接，由于双链dna两头加上了质粒酶切后接头碱基，需要用bbs1酶切px330，再用t4酶连接载体和dna，最后转化、筛选阳性菌并提质粒；
[0100]
4)转染打靶细胞：根据打靶细胞类型，选择合适的转染试剂和方法转染细胞，设置对照组：不转染组，egfp组；
[0101]
5)药筛：转染24-48h，向培养基中加入最低致死剂量的嘌呤霉素，培养2-3天，当egfp组细胞全部死亡后，可换成正常培养基，富集阳性细胞；
[0102]
6)单克隆分选：当细胞生长到一定数量后，消化细胞，按照每孔1个细胞计算所需细胞量，再倍比稀释3-5个梯度，每孔100-200μl培养基，加入96孔板，最后将96孔板用保鲜膜包裹住，进行单克隆培养(约2-3周)；
[0103]
7)阳性单克隆筛选：单克隆生长成单一菌落后，挑选一个孔中只有一个菌落的细胞，扩大培养；
[0104]
8)单克隆wb验证：将扩大培养的细胞消化下来，留少量继续传代，剩余细胞进行wb检测，用相应的抗体验证基因敲除效率；
[0105]
9)单克隆测序验证：将扩大培养的细胞提取dna，用测序引物扩增后送测序，根据测序结果确定单一克隆和基因敲除效果。
[0106]
3、药物处理后细胞增殖检测
[0107]
1)每组3个复孔，计算所需检测样品孔后，将细胞按一定数量接种于96孔板，孵箱培养；
[0108]
2)细胞贴壁后，给予不同浓度的sc75741，对照组加dmso，继续培养；
[0109]
3)24h后，开始测吸光度值：吸弃原培养基，加入100μl cck-8检测液/孔(cck-8用培养基稀释至10％后再使用，即10μl cck-8+90μl培养基)，继续放回培养箱，37℃孵箱孵育4h；
[0110]
4)取出细胞(注意避光)，酶标仪测定450nm和630nm处吸光度值，用两者相减后的差值绘制生长曲线；
[0111]
5)每天测一次吸光度值，连续测一周；
[0112]
6)统计每天的吸光度值，做生长曲线。
[0113]
4、药物处理后ic50检测
[0114]
1)每组3个复孔，计算所需检测样品孔后，将细胞按一定数量接种于96孔板，孵箱培养；
[0115]
2)细胞贴壁后，给予不同浓度的sc75741，对照组加dmso，继续培养；
[0116]
3)96h后，测吸光度值：吸弃原培养基，加入100μl cck-8检测液/孔(cck-8用培养基稀释至10％后再使用，即10μl cck-8+90μl培养基)，继续放回培养箱，37℃孵箱孵育4h；
[0117]
4)取出细胞(注意避光)，酶标仪测定450nm和630nm处吸光度值，用两者相减后的差值计算ic50。
[0118]
5、实验结果
[0119]
运用crispr/cas9技术，设计5对grna，选择rnf138表达量相对较高的细胞系hct116，hct15，进行打靶，并分选单克隆细胞进行wb筛选验证，在hct116，hct15细胞中，分别成功筛选出至少三株rnf138敲除细胞系(图1)。选择(图1)鉴定过的rnf138敲除细胞，wt和ko各选择一株(hct116选择wt 3-11，ko 5-12；hct15选择wt 5-8，ko 1-2，横线前的数字代表转染的grna编号，横杆后的数字代表不同细胞克隆编号)用来检测nf-κb信号通路抑制剂的ic50，以及nf-κb信号通路抑制剂对wt和rnf138 ko细胞生长的影响(图2)。
[0120]
选购多种可能发挥作用的nf-κb信号通路抑制剂(见表1)，通过rnf138敲除细胞系进行ic50检测，发现nf-κb信号通路抑制剂sc75741能特异性抑制rnf138敲除细胞系生长，而对野生型细胞生长没有显著的影响。敲除rnf138的hct116和hct15细胞ic50分别为3.74μm和3.04μm，显著低于野生型细胞的ic50，对sc75741更敏感(图3a和3b)。在不加抑制剂的情况下，rnf138敲除细胞系生长明显快于野生型细胞，抑制剂处理之后，rnf138敲除细胞系生长减慢，而野生型细胞生长没有明显变化(图4a和4b)。说明敲除rnf138细胞系对sc75741更敏感，图中数据为mean
±
sem，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0121]
表1抑制剂统计表
[0122]
[0123][0124]
实施例2动物水平上研究rnf138基因表达对结直肠癌药物治疗的敏感性的影响
[0125]
1、实验方法
[0126]
收集待接种细胞：将细胞扩大培养至一定数量，按照每个点2x106个细胞，收集细胞，按每个点100-200μl重悬液计算，用30％的matrigel(用pbs将matrigel稀释至30％)重悬；
[0127]
接种balb/c裸鼠：提前购买5-7周的雌鼠，适应性培养3-5天，用胰岛素注射器在裸鼠背部后侧进行皮下接种，两侧分别接种野生型细胞和基因敲除细胞；
[0128]
第二天开始，裸鼠腹腔注射给药，每两天给药一次，同时观察裸鼠状态和肿瘤生长，测量最长径和最短径，按公式：v＝0.5*(最长径*最短径2)计算肿瘤体积；
[0129]
当肿瘤达到一定体积后(一般体积不超过1000mm3)，处死裸鼠，测量肿瘤重量和体积；
[0130]
pbs洗净肿瘤，取一部分以4％多聚甲醛溶液常温固定，用于后期的免疫组化和he实验，剩余组织装入含rnalater的冻存管中，-80℃保存。
[0131]
2、实验结果
[0132]
体外实验筛选出nf-κb信号通路抑制剂sc75741后，进一步进行体内验证，观察rnf138基因敲除细胞对sc75741的敏感性。将rnf138基因敲除和野生型hct116细胞分别皮下接种同一只裸鼠，随机分成2组，一组sc75741处理，一组对照。接种第二天开始，每隔一天对裸鼠腹腔注射sc75741(10mg/kg/只)，pbs作为对照，每两天测量一次肿瘤体积，待肿瘤体积接近700mm3时，处死裸鼠，取出肿瘤，称重，拍照，同时将肿瘤用多聚甲醛固定后进行免疫组化检测。结果在不给予抑制剂处理时，rnf138敲除组肿瘤生长明显快于对照组，与细胞体外实验和前期动物模型结果一致；sc75741处理后，rnf138敲除组肿瘤生长显著减慢，而对照组肿瘤生长没有明显变化(图5a-d)。免疫组化检测显示敲除rnf138组，nf-κb信号通路下游基因p-p65，icam1的表达高于野生型细胞组，sc75741处理后，敲除rnf138组p-p65，icam1表达降低，而野生型细胞组没有明显变化，说明rnf138敲除细胞对sc75741更敏感，而野生型细胞对sc75741表现出一定的耐受性(图5e)。裸鼠成瘤实验进一步验证敲除rnf138之后，细胞对sc75741更敏感，提示在缺失rnf138的背景下，nf-κb信号通路抑制剂sc75741具有一定的临床研究价值。图中数据为mean
±
sem，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0133]
实施例3rnf138表达与结直肠癌患者预后相关性研究
[0134]
为了验证rnf138的表达与结直肠癌患者生存预后的关系，本研究使用rnf138抗体对420例结直肠癌患者组织芯片(来源于中国医学科学院肿瘤医院)进行免疫组化，通过病理专家判读，统计计算rnf138的表达得分。判读标准为：染色得分＝染色强度得分*阳性率得分，其中染色强度分为：0代表无着色，1代表弱阳性，2代表阳性，3代表强阳性；阳性率：0代表0％，1代表0-25％，2代表25-50％，3代表50-75％，4代表75-100％。另一方面，使用p-p65抗体对420例结直肠癌患者组织芯片进行免疫组化，通过病理专家判读，分别统计计算p-p65在胞浆和胞核的表达得分。判读标准为：染色得分＝染色强度得分*阳性率得分，其中染色强度分为：0代表无着色，1代表弱阳性，2代表阳性，3代表强阳性；阳性率：0代表0％，1代表0-25％，2代表25-50％，3代表50-75％，4代表75-100％。计算p-p65的核质比(p-p65 n/c)。统计结果显示，rnf138的表达与p-p65的核质比(p-p65 n/c)显著负相关(图6a)，x-tile软件分析计算出rnf138表达最佳截断值为4，相比于rnf138高表达组，rnf138低表达组p-p65的核质比(p-p65 n/c)显著升高(图6b)。x-tile软件分析计算出p-p65核质比(p-p65 n/c)的最佳截断值为0.7，生存分析检验采用log-rank法检验，并计算其风险比(hazard ratio，hr)。生存分析结果显示，rnf138低表达且p-p65的核质比(p-p65 n/c)高的结直肠癌患者的无病生存期和总生存期最短，而rnf138高表达且p-p65的核质比(p-p65 n/c)低的结直肠癌患者的无病生存期(dfs)和总生存期(os)最长，两组具有显著的统计学差异(图6c和d)，提示rnf138高表达并且p-p65的核质比(p-p65 n/c)降低，可能为保护性因素，能延长结直肠癌患者的生存期。
[0135]
通过x2检验检测rnf138的表达与p-p65的核质比(p-p65 n/c)在结直肠癌患者tnm病理分期的差异，结果显示，相比于rnf138
low p-p65 n/c
high
组，rnf138
high p-p65 n/c
low
组结直肠癌患者的临床tnm分级显著降低，从tnm的1期到4期，其阳性率逐渐降低(图7)。从tnm的1期到4期，p-p65的核质比(p-p65 n/c)逐渐升高(图8)，rnf138
high p-p65 n/c
low
组结直肠癌患者在临床tnm低分化时期中所占的百分比高于rnf138
low p-p65 n/c
high
组(图9)。本研究在rna水平检测了结直肠癌组织中，rnf138和部分nf-κb信号通路下游基因的表达并进行相关性分析，发现rnf138的表达与cox2(p＝0.0136)和icam1(p＝0.039)的表达具有负相关性，即肿瘤组织中，rnf138的表达越高，cox2和icam1的表达越低，表明rnf138在结直肠癌中能抑制nf-κb信号通路活化，降低下游基因的转录表达(图10)。为了进一步验证rnf138的表达对nf-κb信号通路活化的影响，本研究选取来自中国医学科学院肿瘤医院的10例结直肠癌临床样本进行免疫组化染色，检测rnf138与p-p65、icam1和cox2的表达，通过病理专家判读，统计计算rnf138的表达得分，判读标准为：染色得分＝染色强度得分*阳性率得分，其中染色强度分为：0代表无着色，1代表弱阳性，2代表阳性，3代表强阳性；阳性率：0代表0％，1代表0-25％，2代表25-50％，3代表50-75％，4代表75-100％。在rnf138高表达组织中，p-p65、icam1和cox2表达相对较低，在rnf138低表达组织中，p-p65、icam1和cox2表达相对较高，与前期结果一致，说明rnf138能抑制nf-κb信号通路的活化，抑制其下游靶基因的表达(图11)。通过rnf138和p-p65这2个生物标志物，联合指示sc75741的药物敏感性，具有重要的价值。
[0136]
表2 10例结直肠癌患者临床信息
[0137][0138]
注：肿瘤部位标号：1＝回盲，2＝升结肠，3＝肝曲，4＝横结肠，5＝脾曲，6＝降结肠，7＝乙状结肠，8＝直乙交界，9＝直肠.
[0139]
实施例4研究rnf138对结直肠癌病人pdx药物治疗敏感性的效果
[0140]
1、实验方法
[0141]
通过免疫组化检测结直肠癌患者癌组织中rnf138以及p-p65的表达，通过病理专家判读，统计计算表达得分。判读标准为：染色得分＝染色强度得分*阳性率得分，其中染色强度分为：0代表无着色，1代表弱阳性，2代表阳性，3代表强阳性；阳性率：0代表0％，1代表0-25％，2代表25-50％，3代表50-75％，4代表75-100％。x-tile软件分析计算出rnf138表达
最佳截断值，分成rnf138高表达和低表达两组。另外，统计p-p65核质比，选择出rnf138高表达同时p-p65核质比低和rnf138低表达同时p-p65核质比高的病人样本进行pdx实验。
[0142]
选择的3例病人的rnf138表达和p-p65核质比信息如表3所示。
[0143]
表3 pdx实验使用病人样本情况
[0144][0145]
以上3例结直肠癌患者的临床信息如下：
[0146]
id：64781，tnm分期：pt3n0m1；手术时间：2016/11/1；结束时间：无；
[0147]
gapdh的log2(fpkm)：11.1857；
[0148]
rnf138的log2(fpkm)：3.7014；
[0149]
病理资料：(直肠)直肠局限溃疡型中分化腺癌。肿瘤浸透肠壁肌层达浆膜下纤维脂肪组织，可见脉管瘤栓，未见神经侵犯，上切缘、下切缘并未见癌。淋巴结未见转移性癌(0/20)，将肠壁淋巴结(0/12)、肠系膜淋巴结(0/8)、肝四段结节、肝左外叶、肝6段结节、肝五段结节、肝4b段结节送检，肝组织内均可见腺癌浸润，符合直肠腺癌转移。(肝六段脏面结节)肝组织，可见灶状肝细胞脂肪变性，未见癌。(胆囊)胆囊组织，未见癌。免疫组化结果显示:braf-v600e(-),mlh1(3+),msh2(3+),msh6(3+),pms2(3+)。ptnm分期：pt3n0m1(结合病理号病理642307、642373)，未显示kras基因第2、3和4号外显子突变；未显示braf基因第15号外显子突变；未显示nras基因第2、3和4号外显子突变。
[0150]
id:76387，tnm分期：ypt4n1bm1手术时间：2017/8/16；结束时间：2017/10/10；
[0151]
gapdh的log2(fpkm)：无；
[0152]
rnf138的log2(fpkm)：无；
[0153]
病理资料：“升结肠癌肝转移6周期化疗后”结肠壁组织中仍见中-低分化腺癌残留。肿瘤侵透浆膜，并纤维性粘连少许肝组织。癌组织轻度退变，伴炎细胞浸润、少量粘液分泌及间质纤维化，符合轻度治疗反应(dworak trg 1级)，可见脉管瘤栓、神经侵犯及肌壁外静脉侵犯。肿瘤未累及阑尾、回盲瓣及大网膜。上切缘、下切缘未见癌。回肠粘膜下多灶淋巴滤泡形成。肝五六段肿物基底、肝七段肿物、肝四段肿物、肝四段肿物、肝尾叶肿物及肝五段肿物这些肝组织中见腺癌浸润，伴坏死、泡沫细胞反应及炎细胞浸润，符合结肠癌转移伴治疗后改变。肿瘤部分累及被膜，局灶紧邻基底。周围肝未见异常。左肝外叶肿物1、左肝外叶膈面结节、肝四段表面结节、肝五六段肿物这些肝组织中见少许腺癌浸润，伴坏死、泡沫细胞反应及炎细胞浸润，符合结肠癌转移伴治疗后改变。肿瘤部分累及被膜，局灶紧邻基底。周围肝未见异常。肝六段肿物、肝七段肿物2、肝尾叶肿物2这些肝组织中可见坏死、炎细胞浸润及泡沫细胞聚集，未见明确肿瘤残留，考虑治疗后改变。(胆囊)胆囊组织，未见癌。淋巴结转移癌(2/74)，伴大片坏死物及泡沫细胞反应，符合治疗后改变。回肠周淋巴结(0/11)，结肠系膜淋巴结(1/51)，结肠壁淋巴结(1/11)，网膜淋巴结(0/1)。ptnm分期：ypt4n1bm1(供临床参考)；肠腺癌免疫组化结果显示：her2(1+)，braf-v600e(-)，mlh1(+)，pms2(+)，msh2
(+)，msh6(+)，c-met(1+)。肝转移癌免疫组化结果显示：mlh1(+)，pms2(+)，msh2(+)，msh6(+)。特殊染色结果显示：弹力纤维染色(显示浆膜受累，两个蜡块)。
[0154]
id:80629，tnm分期：pt4an2am1；手术时间：2017/7/11；结束时间：2017/9/19；
[0155]
gapdh的log2(fpkm)：11.283；
[0156]
rnf138的log2(fpkm)：3.1132
[0157]
病理资料：(右半结肠)结肠弥漫浸润型低分化腺癌，肿瘤侵达浆膜，可见脉管瘤栓及神经侵犯。肿瘤未累及回盲瓣、阑尾及回肠。结肠切缘、回肠切缘均未见癌。网膜组织可见癌累及。膈肌结节、膈肌结节纤维脂肪组织中可见低分化腺癌浸润。肝七段脏面结节、肝七段脏面结节2、肝八段膈面结节、肝四段结节、肝三段结节、肝六段结节这些送检肝段组织中均可见分化差的癌浸润，结合形态、病史及免疫组化结果，符合结肠癌肝转移。肿瘤局灶累及肝被膜，肝四段结节紧邻基底切缘，其余肝段肿瘤未累及基底切缘。周围肝组织未见明显异常。淋巴结可见转移性癌(5/22)，肠系膜血管根部淋巴结(1/1)，回肠壁淋巴结(0/4)，另见一枚癌结节结肠壁淋巴结(4/12)，另见一枚癌结节肠系膜淋巴结(0/5)。ptnm：pt4an2am1免疫组化结果显示：结肠肿瘤：her2(-)，braf-v600e(-)，mlh1(+)，pms2(+)，msh2(+)，msh6(+)，c-met(1+)。肝肿瘤：ck20(2+)，ck7(2+)，ck19(3+)，cdx2(灶+)，hepatocyte(-)，stab2(-)。
[0158]
取结直肠癌患者来源的新鲜组织，4℃保存于组织保存液中，转移至生物安全柜；
[0159]
pbs洗净组织，用手术剪刀剪碎成直径1mm的组织块，按照每个点200μl重悬液计算，以一定量1*pbs重悬组织块；
[0160]
接种nod/scid鼠：提前购买8周的雌鼠，适应性培养3-5天，用带0.5mm针头的1.0ml注射器在小鼠背部前侧进行皮下接种；
[0161]
当肿瘤体积达到100mm3时，开始给药，小鼠腹腔注射给药，每隔一天对小鼠腹腔注射sc75741(10mg/kg/只)，dmso作为对照，同时观察小鼠状态，两天测量一次小鼠体重和肿瘤体积，测量最长径和最短径，按公式：v＝0.5*(最长径*最短径2)计算肿瘤体积；
[0162]
给药18天之后，处死小鼠。癌细胞接种小鼠后腹腔注射给药的流程图见图12。
[0163]
取出肿瘤，pbs洗净，取一部分以4％多聚甲醛溶液常温固定，用于后期的免疫组化实验，检测rnf138，p-p65，ki67，icam1，cox2的表达。剩余组织装入含rnalater的冻存管中，-80℃保存。
[0164]
免疫组化实验方法如下：
[0165]
1)实验试剂：
[0166]
tris-edta抗原修复液(ph9.0)：取tris 3.027g、edta 0.146g溶于450ml去离子水中，用hcl调节ph至9.0，定容至500ml，现用现配；
[0167]
柠檬酸抗原修复液(ph 6.0)：称取0.4g citric acid，3g sodium citrate，溶于1000ml ddh2o，现用现配；
[0168]
二抗和dab显色液均购自中杉金桥公司。
[0169]
2)实验步骤：
[0170]
切片于60℃烘烤1h；
[0171]
依次于二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各脱蜡30min；
[0172]
将脱蜡后的组织切片依次放入100％-95％-90％-80％-70％-50％ethanol中，各
浸泡3-5min，最后浸于pbs中；
[0173]
将切片放入预热的96℃抗原修复液中(抗原修复液根据检测蛋白的特性选择，一般tris-edta抗原修复液检测核蛋白比较好，柠檬酸抗原修复液检测胞浆蛋白较好)，放入后开始计时10min，加热过程中，采用不锈钢杯子装抗原修复液并在电磁炉上加热，待温度达到96℃后，调节电磁炉火力，使抗原修复液温度维持在94-96℃，10min后将不锈钢杯子从电磁炉上拿下，冷却至室温。注意：在该过程中，切片不能从不锈钢杯子中取出；
[0174]
修复液冷却后，将片子取出，放在tbs中洗5min，再转入tbst中洗5min；
[0175]
在湿盒中用3％h2o2处理15-30min，充分除去组织内源性过氧化物酶活性；
[0176]
pbs中洗3次，每次5min；
[0177]
滴加封闭液(10％羊或兔血清)，室温封闭30min；
[0178]
弃去封闭液，加适量一抗(封闭液配置)，用量以覆盖标本为准；
[0179]
为防止干片，将片子放入湿盒内，4℃冷室过夜孵育；
[0180]
tbst洗3次，每次10min；
[0181]
滴加适量试剂1(透化剂，试剂盒所带)于组织位置，放入湿盒内，室温反应20min；
[0182]
tbst洗3次，每次5min；
[0183]
滴加相应抗性的二抗，放入湿盒内，室温孵育20-30min；
[0184]
tbst洗3次，每次5min；
[0185]
新鲜配置dab，吸水纸上吸干片子上多余的tbst，滴加适量dab显色反应液，一般为20-30μl，在显微镜下控制显色时间；
[0186]
pbs中泡洗玻片2次，每次5min；
[0187]
苏木素复染1-2min，自来水浸泡5min，期间显微镜下观察片子颜色，如果染色过深，可将片子放入1％盐酸酒精中分色，如果过浅，则继续蓝化；
[0188]
脱水：片子依次放入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％ethanol中，各浸泡3min；
[0189]
二甲苯中浸泡透化20min；
[0190]
中性树脂封片；
[0191]
显微镜下拍照。
[0192]
2、实验结果
[0193]
实验结果如图13所示，在不给sc75741处理时，rnf138低表达组肿瘤生长明显快于rnf138高表达组，与细胞体外实验和前期cdx模型结果一致；sc75741处理后，rnf138低表达组肿瘤生长显著减慢，而rnf138高表达组肿瘤生长没有明显变化。说明rnf138低表达组对sc75741更敏感，而rnf138高表达组对sc75741表现出一定的耐受性。该实验进一步验证在rnf138低表达的情况下，肿瘤细胞对sc75741更敏感，提示rnf138可作为nf-κb信号通路抑制剂sc75741治疗的生物标志物，即rnf138低表达结直肠癌病人，给予sc75741治疗，能抑制肿瘤的生长。
[0194]
免疫组化结果如图14所示，在rnf138高表达组织中，p-p65、icam1、ki67、cox2表达相对较低，在rnf138低表达组织中，p-p65、icam1、ki67、cox2表达相对较高，说明rnf138能抑制nf-κb信号通路的活化，抑制其下游靶基因的表达(图14)。
[0195]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。