GmAAP蛋白和GmAAP基因在大豆育种中的应用的制作方法

gmaap蛋白和gmaap基因在大豆育种中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于植物基因工程领域，特别是涉及gmaap蛋白和gmaap基因在大豆育种中的应用。


背景技术：

[0002]
氮素是植物生长所必需的大量元素之一，氮素的缺乏直接影响作物的产量和品质。为保证作物的产量和品质，每年有大量的氮肥被施入土壤，然而，由于氮肥的吸收和利用率很低，过度施用氮肥不仅对作物产量贡献极为有限，还会导致资源浪费和环境污染等问题。因此，提高植物自身利用氮素的能力对农业生产的可持续发展具有重要意义。利用基因工程技术，提高农作物对土壤中氮素的吸收利用和转运能力，培育氮高效作物新品种是解决上述问题的有效途径。
[0003]
植物利用根系从土壤中吸收硝酸根离子，铵离子或氨基酸以获取氮素，氮的吸收和转运主要依靠铵根转运蛋白(amt)、硝酸根转运蛋白(nrt)、氨基酸转运蛋白(aat)、肽转运蛋白(ptr)等转运蛋白来完成。而对源器官中大分子降解所产生的氨基酸的吸收和跨膜运输主要是由氨基酸转运蛋白来完成的。在高等植物中，aat是一类跨膜蛋白，将氨基酸从胞外运至胞内，同时还在氨基酸向生长的“库”的长距离运输、氮素再动员中“源”器官中氨基酸的韧皮部装载、种子发育过程中氨基酸输入、病原反应和非生物胁迫等方面发挥着重要的功能。
[0004]
aat基因被分为两个超家族：apc(氨基酸、多胺和胆碱转运)超家族和aaap(氨基酸/生长素透性酶)超家族。aaap超家族分为六个亚家族：aaps(氨基酸透性酶)家族、lhts(赖氨酸和组氨酸转运蛋白)家族、prots(脯氨酸转运蛋白)家族、gats(γ-氨基酸丁酸，gaba)家族、auxs(生长素转运蛋白)家族和ants(芳香族和中性氨基酸转运蛋白)家族。研究表明，调节氨基酸转运蛋白编码基因的表达可以调控转基因植物的生长发育以及产量相关性状。例如，osaat5、osaat7、osaat24、osaat49和osaat60的t-dna插入突变体的水稻产量及植物干重均下降，证明aat对水稻的氮素积累及碳氮分配有着重要作用。在拟南芥中过表达atlhtl可以增强转基因植物对多种氨基酸的吸收功能，同时增加转基因植物的生物量的积累(hinier等，2006)；在豌豆中表达菜豆的aapl基因显著提高了转基因豌豆种子中总氮和蛋白质的含量，增加了种子的重量(rol ietschek等，2005)；在番茄果实中过表达s1cat9可以改善果实中氨基酸的组成(snowden等，2015)。由此可以看出，对氨基酸转运蛋白基因表达水平的调控对作物产量和品质的改良具有重要意义。然而，氨基酸转运蛋白对于影响大豆株型的研究目前未见报道。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述问题，本发明提供了gmaap蛋白和gmaap基因在大豆育种中的应用。本发明探索了氨基酸转运蛋白对于大豆株型的影响，gmaap基因对大豆分枝有极其重要的作用，可应用于植物株型改良从而提高大豆产量。
[0006]
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0007]
本发明提供了gmaap蛋白在大豆育种中的应用，所述gmaap蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0008]
本发明还提供了gmaap基因在大豆育种中的应用，所述gmaap基因的cdna序列如seq idno:2所示。
[0009]
本发明还提供了调节gmaap基因的表达量在改良大豆的株型中的应用。
[0010]
本发明还提供了沉默gmaap基因在增加大豆分枝数中的应用。
[0011]
本发明还提供了沉默gmaap基因在增加大豆单株荚数中的应用。
[0012]
本发明还提供了沉默gmaap基因在提高大豆的产量中的应用。
[0013]
本发明提供了gmaap蛋白在大豆育种中的应用，所述gmaap蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。本发明通过基因工程技术沉默gmaap基因的表达能够显著增加大豆分枝数，从而提高大豆的产量。由实施例可知，本发明提供的应用能够有效提高大豆的分枝数，提高单株荚数。
附图说明
[0014]
图1为基因编辑载体主要功能元件的结构图，其中35s、atu6和ubi分别为启动子；bar为标记基因，grna为靶序列；dpcas9为cas9基因；
[0015]
图2为重组植物表达载体dts6001-gmaap；
[0016]
图3为大豆野生型jack(oe-ck)与大豆野生型品种williams82(ko-ck)、gmaap基因超表达植株3个株系(oe-1、oe-2和oe-3)和gmaap基因沉默植株3个株系(ko-1，ko-2和ko-3)的整株表型图；
[0017]
图4为各植株的单株分枝数统计图；
[0018]
图5为各植株的单株荚数统计图；
[0019]
图6为各植株gmaap基因的相对表达量。
具体实施方式
[0020]
本发明提供了gmaap蛋白在大豆育种中的应用，所述gmaap蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示：>glyma.04g209100.1487aa
[0021]
mveyasrtnlsycrdydieedsmdgmplksdpecydddgrlkrtgtiwttsshiitavvgsgvlslawaiaqmgwiagpavmilfsivtlytssfladcyrtgdpifgkrnytfmdavstilggysvtfcgivqylnlfgsaigytiaaslsmkaiqrshciiqfsdgenqchipsipymigfgavqiffsqipdfhnmwwlsivasvmsftysiiglvlgvtkiaetgtfkgsltgisigtvteaqkvwgvfqalgniafaysysfvlleiqdtiksppsevktmkkaaklsiavtttfymlcgcvgyaafgdsapgnllagfgfhklywlidianaaivihlvgayqvyaqplfafvekeaakrwpkidkefqisipglqsynqnvfslvwrtvfviittvismllpffndilgvigalgfwpltvyfpvemyilqkripkwsmrwislellsvvclivtiaaglgsmvgvlldlqkykpfssdy*，seq id no:1。所述大豆育种的方法优选包括降低gmaap蛋白在植株中的表达。在本发明中，在不影响gmaap蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对seq id no.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，gmaap蛋白还包括seq id no.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活
性的蛋白质。
[0022]
本发明还提供了gmaap基因在大豆育种中的应用，所述gmaap基因的cdna序列如seq id no:2所示：>glyma.04g209100.1cds1464bp
[0023]
atggtagaatatgcttcgagaacaaaccttagctactgtcgagattatgacattgaggaggactccatggatggcatgcctttaaaaagtgatcctgaatgctatgacgatgatggccgtcttaaacgaacagggaccatttggactacaagctcccacataataacagctgtggtaggatctggggtgctctccttagcctgggcaatagctcagatgggttggattgctggtcctgcagtgatgatcttattcagcatagtcactttgtatacttcatcatttctagctgattgttatcgtactggtgaccccatattcgggaagagaaattatactttcatggatgcagttagcaccattctaggcgggtacagtgttacgttctgtgggatagttcagtacttaaatcttttcggaagtgcgataggatacacaattgcggcttcccttagcatgaaggcaatccaaaggtctcactgtatcatccaattctctgatggagaaaaccaatgtcatattccaagtatcccatacatgatcggttttggtgcagtgcaaattttcttttctcaaattccagattttcataacatgtggtggctctcaatagttgcttcagtcatgtctttcacctattccataattggtctcgttcttggagttaccaaaattgcagaaacgggaactttcaagggtagcctcactggaataagcattggaactgtgacagaggcccaaaaagtatggggtgttttccaagctcttggtaacatagccttcgcctattcatattctttcgttctccttgaaattcaggataccatcaaatctccaccatctgaagtaaaaacaatgaagaaggctgcaaaattaagtattgcagtgaccacaacattttatatgctttgtggctgcgtaggctatgctgcttttggggattcagcacctgggaacctgcttgctggatttggtttccataaactatattggcttatagatattgctaatgctgctattgtaattcaccttgtgggggcataccaagtgtatgctcaacccctctttgcatttgtcgagaaggaggcagcaaaaagatggcccaaaattgacaaggaattccaaatttcaattcccggtttgcaatcctacaatcagaacgtatttagcctagtttggaggacagtgtttgtgatcataaccactgttatatcaatgttgcttccattcttcaatgatattttgggagtgattggagcattggggttttggcctctaacggtgtactttcctgtggagatgtatatcttgcaaaagaggatcccaaaatggagtatgagatggatttctctggaattgctgagtgtggtgtgcctcatagtaacaattgcggctggtcttggctcaatggttggtgtcttgcttgacctccagaaatacaaaccattcagttcagattattaa，seq id no:2。所述大豆育种的方法优选包括沉默gmaap基因得到gmaap基因沉默的转基因植株。在本发明中，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0024]
本发明还提供了调节gmaap基因的表达量在改良大豆的株型中的应用。本发明提供的应用能够有效改良大豆的株型，使得经过基因改良的大豆的株型相较于未经过改良的大豆株型更为矮壮，分枝更多，单株荚数增多。
[0025]
本发明还提供了沉默gmaap基因在增加大豆分枝数中的应用。
[0026]
本发明还提供了沉默gmaap基因在增加大豆单株荚数中的应用。
[0027]
在本发明中，上述沉默gmaap基因在增加大豆分枝数或是在增加大豆单株荚数中的应用中，沉默gmaap基因的具体实现方法优选包括：以大豆的氨基酸转运蛋白基因gmaap为对象，从大豆野生型品种williams82中克隆gmaap的cdna序列，通过cas9基因编辑技术构建gmaap基因沉默表达载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将cas9编辑表达载体导入正常大豆野生型品种williams82的植株中，得到gmaap基因沉默的转基因植株，gmaap基因沉默的转基因植株大豆的分枝数与大豆野生型品种williams82相比能够提高50％，单株荚数与大豆野生型品种williams82相比提升了57.5％。
[0028]
本发明还提供了沉默gmaap基因在提高大豆的产量中的应用。本发明提供的应用能够有效提高大豆的分枝数和单株荚数，从而提高大豆的产量。本发明还构建了gmaap基因
过量表达载体，将过量表达载体导入大豆野生型jack中，得到gmaap基因过量表达转基因植株，其分枝数与大豆野生型jack相比变化不明显。上述结果表明，通过降低gmaap基因表达，可以增加大豆的分枝数，从而提高单株荚数和大豆产量。
[0029]
本发明还明确了植物增产的分子作用机理，对明确植物增产的分子作用机理有很大的推动作用。
[0030]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的gmaap蛋白和gmaap基因在大豆育种中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0031]
实施例
[0032]
gmaap基因沉默植株的构建
[0033]
参考大豆基因组数据库中(https://www.soybase.org)大豆参考基因组中gmaap基因信息利用在线网站(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计该基因的目标靶点。
[0034]
靶点设计原则如下：
[0035]
1)敲除位点处于编码(cds)区且尽量在蛋白前端或重要功能domain区；
[0036]
2)尽量涵盖更高比例的转录本；
[0037]
3)没有脱靶或脱靶位于基因间区；
[0038]
4)优选编辑效率较高的靶点；
[0039]
5)序列有较为平衡的gc含量且不易形成二级结构。
[0040]
靶标序列如seq id no:3所示：
[0041]
grna：5'-atgtcatattccaagtatcc-3'，seq id no:3。
[0042]
基因编辑载体主要功能元件的结构图如图1所示，其中35s、atu6和ubi分别为启动子；bar为标记基因，grna为靶序列；dpcas9为cas9基因。
[0043]
按照crispr/cas9快速构建试剂盒vk005-04(购于唯尚立德生物公司)中的说明，将seq id no:3所示的grna插入到基因编辑载体中构建出含有gmaap靶标序列的crispr/cas9载体。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将基因沉默载体导入正常大豆野生型品种williams82中得到转基因小苗。
[0044]
编辑植株获得过程：
[0045]
将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待转基因小苗长高约10cm时，种于大田中，待转基因小苗长大后，利用bar试纸条(envirologix inc.,usa)检测bar蛋白，方法如下：
[0046]
(1)取长大的转基因小苗的叶片作为样品，将样品叶片组织置于一次性组织提取管的盖子与管身之间，迅速盖住盖子，得到圆形叶片组织，用杵将叶片置于提取管的底部；
[0047]
(2)将杵插入管中，旋转杵碾搅碎叶片，持续按压20～30秒。加入0.5ml提取缓冲液；
[0048]
(3)重复碾碎步骤使样品与缓冲液充分接触混合，拿掉杵棒；
[0049]
(4)反应管保持直立，将试纸插入反应管，样品液会沿试纸上升，反应10分钟后读取结果；
[0050]
提取基因组dna通过pcr对转基因植株中的bar进行检测，检测引物对如seq id no:4和seq id no:5所示：
[0051]
f3：5'-tgcaccatcgtcaaccactacat-3'，seq id no:4；
[0052]
r3：5'-agaaacccacgtcatgccagt-3'，seq id no:5。
[0053]
检测若扩增得到480bp的片段，则说明转基因植株为可能为阳性植株。然后单株收种并种植，取样提取dan利用测序引物对靶标序列附近测序，测序双峰或在靶标序列附近有碱基序列的插入或缺失的变化则为阳性植株。测序引物对如seq id no:6和seq id no:7所示：
[0054]
f4：5'-tacacaattgcggcttccct-3'，seq id no:6；
[0055]
r4：5'-tgcaggggttatgtgccaat-3'，seq id no:7。
[0056]
至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到gmaap基因编辑植株，后续选取三个株系分别标记为ko-1，ko-2和ko-3，未经过gmaap基因编辑的大豆野生型品种williams82植株标记为ko-ck。
[0057]
gmaap基因超表达植株的构建
[0058]
提取大豆野生型品种jack的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对如seq id no:8和seq id no:9所示：
[0059]
f5：5'-tttggagagaacacgtatggctgagcttcactacca ac-3'，seq id no:8；
[0060]
r5：5'-tcggggaaattcggggttaataatctgaactgaatg-3'，seq id no:9。
[0061]
通过无缝克隆技术将gmaap基因正向导入到大豆表达载体pcambia3300中，构建成重组植物表达载体dts6001-gmaap(如图2所示，图2为重组植物表达载体dts6001-gmaap)载体在t-dna区域带有一个选择标记基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)，该基因编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)，该酶可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而不被草甘膦杀灭。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常大豆野生型品种jack中，得到大豆野生型品种jack的转基因小苗。
[0062]
将得到的大豆野生型品种jack的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待小苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为如seq id no:10和seq id no:11所示：
[0063]
f3：5'-gacgcacaatcccactatcc-3'，seq id no:10；
[0064]
r3：5'-ttaataatctgaactgaatggt-3'，seq id no:11。
[0065]
若扩增出1656bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到gmaap基因的超表达植株，后续选取三个株系分别标记为oe-1、oe-2和oe-3，未经过gmaap基因编辑的大豆野生型品种jack植株标记为oe-ck。
[0066]
应用例1
[0067]
将实施例提供的大豆野生型品种jack(oe-ck)、gmaap基因超表达植株的3个株系(oe-1、oe-2和oe-3)与大豆野生型品种williams82(ko-ck)、gmaap基因沉默植株3个株系(ko-1，ko-2和ko-3)的植株进行栽培，栽培结果如图3、图4、图5和表1、表2所示，图3为为大豆野生型jack(oe-ck)与大豆野生型品种williams82(ko-ck)、gmaap基因超表达植株3个株系(oe-1、oe-2和oe-3)和gmaap基因沉默植株3个株系(ko-1，ko-2和ko-3)的整株表型图，图4为各植株的单株分枝数统计图，图5为各植株的单株荚数统计图。
[0068]
表1各植株单株分枝数统计结果
[0069]
分组(编号)平均单株分枝数(个)oe-ck(1)5.20oe-1(2)3.20oe-2(3)3.60oe-3(4)3.80ko-ck(5)6.20ko-1(6)9.00ko-2(7)9.20ko-3(8)9.40
[0070]
由图3、图4和表1可知，经过gmaap基因编辑植株(ko-1，ko-2和ko-3)的分枝数显著多于大豆野生型品种williams82植株的分枝数。gmaap基因超表达植株的分枝数与大豆野生型品种jack相比减少的不显著。说明沉默gmaap基因能够有效增加大豆的分枝数。
[0071]
表2各植株单株荚数统计结果
[0072][0073][0074]
由图5和表2可知，经过gmaap基因编辑植株(ko-1，ko-2和ko-3)的单株荚数显著多于大豆野生型品种williams82植株的单株荚数。gmaap基因超表达植株的分枝数与大豆野生型品种jack相比差异不显著。说明沉默gmaap基因能够有效增加大豆的单株荚数。
[0075]
应用例2
[0076]
取gmaap基因编辑植株的叶片和gmaap基因超表达植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测gmaap基因在编辑植株和超表达植株中的表达量。检测结果如图6和表3所示，图6为各植株gmaap基因的相对表达量。实时荧光定量pcr所用引物对如seq id no:12和seq id no:13所示：
[0077]
f5：5'-tggcctctaacggtgtactt-3'，seq id no:12；
[0078]
r5：5'-agacaccaaccattgagcca-3'，seq id no:13。
[0079]
表3各植株gmaap基因的相对表达量
[0080][0081]
由图6和表3可知，经过基因编辑的植株(ko-1，ko-2和ko-3)中gmaap基因的表达量低于未经过基因编辑的大豆野生型品种williams82植株。超表达植株中gmaap基因的表达量远远高于大豆野生型品种jack。
[0082]
上述结果表明，gmaap基因可以通过降低表达量，提高大豆的分枝数和单株荚数，最终影响大豆的产量。
[0083]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。