[0001]
涉及一种生物化工领域，具体涉及一种还原型谷胱甘肽分离提取的清洁生产工艺。
背景技术：
[0002]
谷胱甘肽(glutathione,gsh)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，含γ-酰胺键和巯基的三肽化合物。谷胱甘肽中半胱氨酸的侧链基团上的活性巯基可以起到保护体内蛋白酶上的巯基不被氧化和破坏的作用，保护酶的活性。谷胱甘肽不仅是甘油醛磷酸脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脱氢酶的辅酶。其活性成分为还原型谷胱甘肽，大约占95％，广泛分布于人类肝细胞和肾细胞，不仅可以维持机体的氧化还原平衡、参与细胞的抗氧化反应，而且在调节细胞增生、机体免疫应答、保护肝功能以及在神经系统中充当神经调质和神经递质中发挥重要的作用。
[0003]
目前，谷胱甘肽的制备方法主要有溶剂提取法、发酵法、化学合成法和酶合成法。溶剂提取法存在生产工艺落后、生产规模小且提取出来的谷胱甘肽的质量不高，工艺流程相对较为复杂等问题；化学合成法生产工艺较为成熟，但是有操作过程复杂、反应步骤多、时间长和生产成本高等缺点，同时还存在环境污染的问题。发酵法是目前生产gsh的主要方法，但在工业发展上受到能耗高、排污较大的环境问题限制。酶法生产谷胱甘肽具有明确的工艺，提取出的谷胱甘肽纯度高，但目前工业化生产中，大都采用离子交换工艺。如中国专利申请cn200810233835.6中提供了一种阳离子交换树脂分离纯化方法；中国专利申请cn201210111271.5中提供了一种阴离子交换树脂分离纯化的方法。这些耗时长，树脂需要酸、碱再生、清水冲洗等步骤，消耗大量酸碱并产生大量废水，污染环境，成本高。此外，在分离纯化工艺过程中，普遍采用加入有机溶剂析晶的方法。加入的试剂用量大，成本高，回收时能耗高，且溶剂残留容易影响产品质量。
技术实现要素：
[0004]
针对现有技术中的不足之处，本发明提供一种从酶法合成液中分离提取还原型谷胱甘肽的清洁生产工艺。本发明提供的工艺不使用离子交换步骤，节省酸、碱，大幅度减少了废水、废液的排放。在不使用有机溶剂析晶，降低能耗、节约生产成本的情况下，获得高纯度的还原型谷胱甘肽产品。
[0005]
为实现发明目的，提供一种还原型谷胱甘肽的清洁生产工艺，其包括：微滤膜过滤、超滤膜过滤、浓缩、结晶、干燥等步骤。具体地，所述工艺包括如下步骤：
[0006]
(1)调节ph：调节谷胱甘肽反应液体系处于ph 2.0～4.0的酸性环境中，可沉淀某些杂质，并使gsh处于稳定状态，防止被氧化；
[0007]
(2)微滤：调节ph后的反应液经孔径0.2～0.6μm的微滤膜过滤，收集滤过液；
[0008]
(3)超滤：将步骤(2)得到的滤过液经超滤膜过滤，收集浓液；所述超滤膜为截留分子量200～500da的纳滤膜；
[0009]
(4)减压浓缩：对步骤(3)的浓液进行减压浓缩，使其达到gsh含量在400～600g/l；
[0010]
(5)结晶：在谷胱甘肽浓缩液中加入还原型谷胱甘肽晶种，滴加水，在0～25℃下，搅拌结晶，搅拌速率50～200rpm；
[0011]
(6)真空干燥：在-0.08～-0.098mpa的真空度下干燥，得到98.5％以上纯度的gsh。
[0012]
本发明所述的谷胱甘肽反应液可以使用本领域用于制备谷胱甘肽的酶法转化方法制备得到，例如其制备方法参考中国专利申请cn 110373370.a。
[0013]
对于上文所述的技术方案，优选的，将步骤(2)的滤过液初始固含量8～12wt％左右，稀释0.5～1.5倍后，开始超滤。优选的，在步骤(2)过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到4～6wt％时，添加含gsh的溶液进行稀释，再次超滤gsh含量达到4～6wt％。再次重复添加含gsh的溶液稀释，最终超滤gsh含量达到7wt％～10wt％；最后收集浓液。
[0014]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(2)进行稀释时所用的含gsh的溶液为gsh含量为0.1～0.5wt％的溶液。
[0015]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(2)中，所述的微滤膜孔径为0.22μm；优选的所述微滤膜为陶瓷膜，优选的，过滤的系统温度为10～30℃，压力为1.5～2.0mpa。
[0016]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(3)中，系统的温度为10～30℃，压力为0.6～1.5mpa。
[0017]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(4)减压浓缩是在-0.08～-0.098mpa的真空度与50～75℃温度下进行。
[0018]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(5)中，在谷胱甘肽浓缩液中加入1wt％～5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，优选的，在谷胱甘肽浓缩液中加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.2～1倍水，优选0.5倍水。在0～25℃下，搅拌结晶，搅拌速率50～200rpm；所得结晶产品经真空烘干得到还原型谷胱甘肽。
[0019]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(5)中，在谷胱甘肽浓缩液中加入的还原型谷胱甘肽晶种为纯度大于等于98.5wt％的药品级谷胱甘肽。
[0020]
对于上文所述的技术方案，优选的，上述步骤(1)中，调节ph选用盐酸、硫酸或硝酸，优选用盐酸或硫酸，最优选用盐酸。
[0021]
本发明从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法相对于现有技术，具有以下有益的技术效果：
[0022]
1、本发明的创新点在于超滤除盐的过程中，膜内循环的固含量浓度保证在10wt％～20wt％。所以，初始超滤过程稀释反应液，在超滤除盐过程，需要根据滤过速度连续添加谷胱甘肽反应液，维持膜内循环的压力与固含量稳定，经过这样的改进，除盐效果好。
[0023]
2、结晶工艺采用添加晶种并滴加水的析晶方式。与现有的分离提纯技术相比，本发明工艺具有以下有益效果：结晶不需加入无水乙醇，产品无溶残污染。工艺在保证产品品质的情况下，收率高；同时生产成本降低，也不需要相应的醇回收工艺，能耗少，是一种环境友好的绿色高效生产及提取工艺。得到的产品品质高、无溶残污染。3、在ph约为3的情况下，谷胱甘肽可以得到保护，并且带正电荷。结合在超滤过程中补加gsh的工艺，在超滤除盐时，增加电荷力以及浓度阻力，维持浓度后快速gsh形成多聚体结构，减少gsh的透过率，而500da的超滤膜，足够小分子的杂质盐通过，除杂效果更好，最后除盐率可以达到95％以上。
具体实施方式
[0024]
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。下述实施例中所用的谷胱甘肽反应液的制备方法参考中国专利申请cn 110373370.a。
[0025]
实施例1
[0026]
取谷胱甘肽反应液1l(其制备方法参考中国专利申请cn 110373370.a)，gsh含量20.9g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为1.5mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为1.0mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽13.6g，收率64.6％，纯度99.3％。
[0027]
实施例2
[0028]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量20.9g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为15℃，压力为2.0mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为15℃，压力为1.5mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽13.1g，收率62.0％，纯度98.9％。
[0029]
实施例3
[0030]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量20.9g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为30℃，压力为1.5mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为30℃，压力为0.6mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到7wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到7wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽12.6g，收率59.6％，纯度99.0％。
[0031]
实施例4
[0032]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量20.9g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为1.5mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为0.6mpa。在过滤
过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到7wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加1.0倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽12.4g，收率59.0％，纯度99.4％。
[0033]
实施例5
[0034]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量20.9g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为1.5mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为1.0mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.2倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽13.7g，收率64.6％，纯度98.5％。
[0035]
实施例6
[0036]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量21.3g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为1.5mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为1.0mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在25℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽12.1g，收率56.2％，纯度98.9％。
[0037]
对比例1
[0038]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量21.3g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为10～30℃，压力为1.5～2.0mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为10～30℃，压力为0.6～1.5mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到15wt％时停止纳滤，收集浓液。在-0.08～-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽9.94g，收率44.1％，纯度94.5％。
[0039]
对比例2
[0040]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量21.3g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为10～30℃，压力为1.5～2.0mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为10～30℃，压力为
0.6～1.5mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到20wt％时停止纳滤，收集浓液。在-0.08～-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽9.54g，收率42.4％，纯度94.7％。
[0041]
对比例3
[0042]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量21.3g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为2.0mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量1000da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为1.0mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，加入5wt％的还原型谷胱甘肽晶种，滴加0.5倍水。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽8.3g，收率38.6％，纯度99.1％。
[0043]
对比例4
[0044]
取谷胱甘肽反应液1l，gsh含量21.3g。盐酸调节ph＝3.0后，经孔径0.22μm的陶瓷膜对反应液进行过滤，系统的温度为25℃，压力为2.0mpa。陶滤清液稀释1倍后，开始超滤。通过超滤膜优选用截留分子量500da的纳滤膜。系统的温度为25℃，压力为1.0mpa。在过滤过程中，杂质盐随清液排出，浓液中gsh逐渐富集，当gsh含量达到5wt％时，添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，再次超滤gsh含量达到5wt％。再次重复添加0.1wt％gsh含量的溶液等体积稀释，最终超滤gsh含量达到10wt％。最后收集浓液。在-0.098mpa的真空度与75℃温度下减压浓缩gsh溶液，使其达到gsh含量在600g/l。收集浓缩液，不加入任何晶种。在4℃下，搅拌结晶，搅拌速率200rpm；过滤，真空烘干得到还原型谷胱甘肽5.2g，收率20.9％，纯度85.5％。
[0045]
对比例5
[0046]
利用专利cn105566445a法，取酶法所得的gsh转化液1l，gsh含量13.3g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用盐酸调ph至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂hd-8，用0.03mol/l的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集gssg浓度高于0.2g/l的洗脱液。上柱非极性吸附树脂sp207，用去离子水洗脱，收集gssg浓度大于0.2g/l的洗脱液，其中gssg含量12.11g。纳滤浓缩至500ml，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/l的硫酸120ml，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂sp207，用去离子水洗脱，收集gsh浓度高于0.2g/l的洗脱液。旋转蒸发浓缩至35ml，加入少量晶种，滴加35ml乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到gsh固体7.7g，收率57.9％，固体的重量纯度99.14％。对比例工艺繁琐，离子交换产生大量废水，成本高。
[0047]
对比例6
[0048]
专利cn201610639702的实施例：取10g谷胱甘肽粗品，40ml水溶解，热水浴60℃，20min滴加含有1.8g(3wt％)十二烷基磺酸铵的乙醇溶液60ml，静置结晶；逐步冷却至10℃，抽滤，用75％乙醇40ml洗涤，真空干燥，得成品7.54g，经常规hplc法检测，纯度为98.93％。
对比例产品有溶剂残留，经hpgc法测检测乙醇溶残6342.7ppm。
[0049]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。