一种基质金属蛋白酶响应性聚合物药物载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及高分子药物领域，尤其涉及一种基质金属蛋白酶响应性聚合物药物载体及其制备方法和应用。

背景技术：

两亲性嵌段聚合物可在水溶液中自组装成胶束，并已被广泛应用于包封疏水性抗癌药物。与小分子抗癌药相比，聚合物载药胶束能够改善药物的药代动力学和提高药物在肿瘤部位的富集从而显著提高药物的生物利用度，减少毒副作用。具有生物相容性的可降解聚合物胶束在药物运载方面取得了巨大的成功，有些已被批准进入临床应用或者正在进行临床试验。例如，相比于溶剂型紫杉醇(ptx)，genexol-pm(聚乙二醇-b-聚d，l-丙交酯)(peg-pdlla)聚合物负载的ptx制剂显示出了更好的疗效和较低的毒性，在韩国已被批准用于治疗转移性乳腺癌和非小细胞肺癌。此外，还有其他的两亲性嵌段聚合物胶束正在临床试验中，如nk105，nk911，nk012，sp1049c，bind014。

然而，另一方面，聚合物胶束的血液长循环和较高的肿瘤富集(例如peg-覆盖的表面)也阻碍了肿瘤细胞的内吞作用。这对于大多数需要被细胞内吞才能起作用的抗癌药物来讲是个不利的方面。为了解决这个问题，各种响应性的智能聚合物药物递送系统被设计来进一步提高疗效，但目前为止进入临床阶段的聚合物药物递送系统仍然十分稀少。聚合物本身复杂的结构和未知的系统毒性限制了其进一步的临床化。因此，提供一种毒性小，易得且疗效好的聚合物药物是目前需要解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供了一种基质金属蛋白酶(mmp)响应性聚合物药物载体及其制备方法和应用，本发明提供的聚合物药物载体不仅易得，而且担载药物后得到的聚合物药物疗效高且毒性小。

本发明提供了一种基质金属蛋白酶响应性高分子药物载体，具有式(i)所示结构，

其中，m为40～230，n为30～120；

所述pep的氨基酸序列为gplgvrgdg或gplgvrg。

优选的，所述m为80～150。

优选的，所述n为50～100。

本发明还提供了一种基质金属蛋白酶响应性高分子药物载体的制备方法，包括：

1)将peg-n3与alkynyl-pep反应，得到末端为氨基的peg-pep，

所述pep的氨基酸序列为gplgvrgdg或gplgvrg；

2)将末端为氨基的peg-pep与d，l-丙交酯反应，得到具有式(i)所示结构的高分子药物载体；

其中，m为40～230，n为30～120。

优选的，所述步骤1)反应的催化剂为溴化亚铜和n，n，n′，n，′n″-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)。

优选的，所述步骤2)反应的催化剂为辛酸亚锡、乙酸亚锡、二氧化钛和氯化铝中的一种或几种。

本发明还提供了一种高分子药物，包括高分子药物载体和抗肿瘤药物；

其中，所述高分子药物载体为本发明所述的高分子药物载体。

优选的，所述抗肿瘤药物为紫杉醇、喜树碱、顺铂、氮芥和阿霉素中的一种或几种。

本发明还提供了一种本发明所述的高分子药物的制备方法，包括：

将本发明所述的高分子药物载体、抗肿瘤药物、溶剂和缓冲溶液反应，得到高分子药物。

优选的，所述缓冲溶液为ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)。

与现有技术相比，本发明提供了一种具有式(i)所示结构的高分子药物载体，本发明提供的聚合物药物载体用于担载药物，得到的高分子药物能够增加肿瘤药物对于药物的内吞，提高药效，而且生物安全性较高；实验结果表明，本发明提供的高分子药物与现有的该分子药物相比，疗效提高了16倍；且药物安全。

附图说明

图1为本发明所述的聚合物载体的合成路线图；

图2为实施例制备得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc图；

图3为peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的¹hnmr图；

图4为以芘作为荧光探针，高分子药物浓度与其在激发光光谱中波长在339nm和332nm处的强度的比值(i339/i332)的相关图；

图5为本发明提供的聚合物药物的粒子尺寸表征结果；

图6为用1μg/ml的mmp-2和p1共同培养不同时间的凝胶渗透色谱(gpc)结果；

图7为p1纳米粒子、p2纳米粒子、p3纳米粒子与mmp-2分别共同培养后的peg释放结果；

图8为在mmp-2的存在下p1纳米粒子、p2纳米粒子、p3纳米粒子的大小的变化图；

图9为mmp-2处理之前和之后的p1纳米粒子的透射电子显微镜(tem)图像；

图10为mmp-2不存在下的ptx释放曲线；

图11为mmp-2存在下的ptx释放曲线；

图12为4t1细胞的流式细胞术结果；

图13为本发明所述的高分子药物的激光共聚焦显微镜(clsm)图像；

图14为空白胶束的细胞毒性评价结果；

图15为在不同ptx浓度的不同高分子药物的细胞毒性的评价；

图16为静脉注射ptx负载的p1，p2或p3后，在血液中与ptx含量在不同时间下的变化；

图17为12和24小时静脉注射后ptx在主要器官和肿瘤内的定量分析结果；

图18为负载1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindotricarbocyanineiodide(dir)荧光分子的纳米粒子静脉注射后在体内生物分布图；

图19为静脉注射ptx负载的纳米粒子和小分子ptx后肿瘤大小的变化结果；

图20为在第24天从不同处理组收集的典型肿瘤的照片；

图21为肿瘤切片的苏木精-伊红(h&e)染色的结果和末端脱氧核苷酸转移酶染色(tunel)荧光图像；

图22为小鼠体重变化；

图23为心脏，肝，脾，肺，肾h&e染色，分别对应于pbs，ptx，p1，p2和p3的静脉注射。

具体实施方式

本发明提供了一种高分子药物载体，具有式(i)所示结构，

其中，m为40～230，n为30～120；

所述pep的氨基酸序列为gplgvrgdg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸)或gplgvrg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸)。

按照本发明，所述pep的氨基酸序列为gplgvrg或gplgvrgdg；所述m优选为80～150，更优选为100～140，最优选为110～130，最优选为113～120；所述n优选为50～110，更优选为60～100。

本发明还提供了一种高分子药物载体的制备方法，包括：

1)将端基叠氮化化的聚乙二醇与炔基功能化的多肽反应，得到末端为氨基的peg-pep；

所述pep的氨基酸序列为gplgvrgdg或gplgvrg；

2)将末端为氨基的peg-pep与d，l-丙交酯反应，得到具有式(i)所示结构的高分子药物载体；

其中，m为40～230，n为30～120。

按照本发明，本发明还将端基叠氮化化的聚乙二醇(peg-n3)与炔基功能化的多肽(alkynyl-pep，其中炔基连接在初始的甘氨酸上)反应，得到末端为氨基的peg-pep，；本发明对反应的条件没有特殊要求，本领域公知的方法均可；其中，所述反应的催化剂优选为溴化亚铜和n，n，n′，n，′n″-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)；所述反应的溶剂优选为dmf；所述反应的温度优选为30～60℃；更优选为40～50℃；此外，本发明中，pep的氨基酸序列为gplgvrgdg或gplgvrg。

本发明还将末端为氨基的peg-pep与d，l-丙交酯反应，得到具有式(i)所示结构的高分子药物载体；其中，所述反应的催化剂优选为辛酸亚锡；所述反应的溶剂优选为四氢呋喃；所述反应的温度优选为60～100℃，更优选为80～90℃。

本发明还提供了一种高分子药物，包括高分子药物载体和抗肿瘤药物；

其中，所述高分子药物载体为本发明所述的高分子药物载体；所述抗肿瘤药物优选为紫杉醇、喜树碱、疏水性铂类药物、氮芥和阿霉素中的一种或几种；更优选为紫杉醇。

本发明还提供了一种本发明所述的高分子药物的制备方法，包括：

将本发明所述的高分子药物载体、抗肿瘤药物、溶剂和缓冲溶液反应，得到高分子药物。其中，所述缓冲溶液为ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液；所述溶剂优选为乙酸乙酯；所述反应优选为超声反应；所述超声的功率优选为90～120w；所述超声的时间优选为60～100秒。

本发明提供了一种具有式(i)所示结构的高分子药物载体，本发明提供的聚合物药物载体用于担载药物，得到的高分子药物能够在mmp高表达的肿瘤组织中增加肿瘤药物对于药物的内吞，提高药效，而且生物安全性较高，具有很好的应用前景。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中式(i)化合物用缩写peg-pep-pdlla表示。

实施例

一、高分子药物的制备及表征

1)聚合物载体的制备方法

peg-gplgvrgdg-nh2的制备

将peg-n3(0.3g，0.06mmol)，alkynyl-pep(0.062g，0.072mmol)，dmf(3ml)和pmdeta(31mg，0.18mmol)一起至于5ml的封管中，冷冻-循环抽气三次后在氮气的保护下加入溴化亚铜(26mg，0.18mmol)，再次冷冻-循环抽气两次，在真空下封住，置于40℃下反应24小时。反应完成后将反应物加入50ml乙醚中沉淀，得到的产物干燥后溶解在去离子水中，加入到分子量为3500的透析膜内，在流动的去离子水中透析24小时。冻干后得到白色粉末状产物，即为peg-gplgvrgdg-nh2；产量为0.22g，产率为62.7％。

将peg-gplgvrgdg-nh2引发剂溶解在约0.5ml的ch2cl2中，然后加入过量的苯。冻干后得到无水白色粉末。然后，冻干的peg-gplgvrgdg-nh2(0.117g，0.02mmol)，d，l-丙交酯(0.288g，2mmol)，辛酸亚锡(30μl，10mg/ml苯溶液)溶于1ml无水四氢呋喃和4ml无水苯中，加入10ml封管中，冻干后加入4ml无水四氢呋喃，封住封管，在80℃下反应18小时。然后将得到的聚合物沉淀到50ml冷乙醚中。产品通过离心收集。重复上述溶解-沉淀循环两次。将最终产物干燥，得到白色固体粉末，即为聚合物载体peg-gplgvrgdg-pdlla，产量为0.26g，产率为64％。

同样，用类似的合成方法合成peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla聚合物载体。

聚合物载体的具体制备方法见图1，图1为本发明所述的聚合物载体的合成路线图。

对得到的聚合物载体进行检测，结果见图2～图3，图2为实施例制备得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc图；图3为peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的¹hnmr图。

2)高分子药物(载药胶束)的制备

将peg-gplgvrgdg-pdlla(10mg)和紫杉醇(1mg)溶解在乙酸乙酯(0.2ml)中，然后加入磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)1ml，在90w的功率下超声乳化60秒，减压出去有机溶剂，在离心除去未包埋的紫杉醇后得到载药的纳米粒子，即高分子药物(又称p1纳米粒子或p1)。

同样，用类似的合成方法在peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla上担载紫杉醇，分别得到高分子药物p2和p3。此外，尼罗红和dir包埋的纳米粒子(高分子药物)的制备是通过将上述ptx换成相应的分子实现的。

通过以芘作为荧光探针，溶液中芘的浓度为1×10^-7m，荧光测试的发射波长为475nm，测试高分子药物在339nm和332nm激发光强度的比值对聚合物浓度作图，结果见图4，图4为以芘作为荧光探针，高分子药物浓度与其在激发光光谱中波长在339nm和332nm处的强度的比值(i339/i332)的相关图；从同种可以看出，本发明所述的高分子药物的临界胶束浓度分别为2.1×10^-3mg/ml(p1).2.5×10^-3mg/ml(p2)和3.3×10^-3mg/ml(p3)。

通过动态光散射表征聚合物药物，结果见图5，图5为本发明提供的聚合物药物的粒子尺寸表征结果；从图中可以看出，本发明得到的纳米粒子的平均粒径均为80nm左右，该尺寸便于纳米粒子在肿瘤组织部位富集。而且测得p1，p2和p3纳米粒子的载药率和包封率都是差不多的。这说明在嵌段聚合物中间引入多肽的序列后对于聚合物药物的相关性质没有产生大的影响。

3)聚合物药物对于mmp-2的响应性评估。

本发明所用的多肽(gplgvrgdg)已经证实会被活化的mmp-2在g和v之间的位点被切断。将p1纳米粒子、p2纳米粒子、p3纳米粒子分别和mmp-2共培养不同时间后，进行了gpc表征，结果见图6～图7，图6为用1μg/ml的mmp-2和p1共同培养不同时间的凝胶渗透色谱(gpc)结果；图7为p1纳米粒子、p2纳米粒子、p3纳米粒子与mmp-2分别共同培养后的peg释放结果；从图6可以看出，培养1个小时后gpc曲线显示一个新的肩峰，位于16.08分钟，这对应于peg峰。这一结果证明了mmp-2导致peg的从纳米粒子的去除。随着mmp-2处理时间的增加，肩峰变得越来越强，且从图7可以看出超过70％peg在8个小时内脱离，最后，大约20％peg仍然在纳米粒子表面上。

在mmp-2培养的同时，我们也采用动态光散射(dls)来研究纳米粒子的尺寸变化，结果见图8～图9，图8为在mmp-2的存在下p1纳米粒子、p2纳米粒子、p3纳米粒子的大小的变化图；图9为mmp-2处理之前和之后的p1纳米粒子的透射电子显微镜(tem)图像；从图8中可以看出，纳米粒子尺寸在24小时内没有显著的变化；tem测量进一步证实，如图9所示，除了极少数相对大的颗粒外，去peg化后的纳米粒子依然保持着较为均一的尺寸。这种现象可能是因为mmp-2培养24小时仍然有20％peg留在纳米粒子的表面上足以稳定纳米粒子。对照组p2也显示出peg的脱离，而p3没有对mmp-2的响应性(图7)。上述结果表明，mmp-2能够有效地切断肽键，但不会导致显著的聚集。可以推测，残留的肽vrgdg是保留在纳米粒子的表面的，这对于肿瘤细胞的内吞具有极大的优势。

此外，为了评估mmp-2的存在对于药物释放的影响，我们研究了在mmp-2存在和不存在下ptx的释放行为。如图10和图11，图10为mmp-2不存在下的ptx释放曲线；图11为mmp-2存在下的ptx释放曲线；从图中可以看出，负载ptx的p1，p2，和p3无论有没有mmp-2的存在都表现出类似的释放行为，在72小时内约80％的ptx释放。

4)微弱的尺寸变化和有效mmp-2导致的peg脱离有可能促进细胞摄取。此外，残留的肽vrgdg残留在纳米粒子表面上能够作为一种靶向配体，进一步促进纳米粒子和肿瘤细胞之间的相互作用。为了研究在mmp-2存下纳米粒子的细胞摄取行为，等量的负载尼罗红的纳米粒子和4t1细胞在mmp-2存在下共培养。然后进行流式细胞术测量以研究纳米粒子的内吞。结果见图12～图13，图12为4t1细胞的流式细胞术结果；图13为本发明所述的高分子药物的激光共聚焦显微镜(clsm)图像；从图12中可以看出，p1的纳米粒子相比p3的纳米粒子表现出几乎高三倍的细胞摄取，而p2的纳米粒子仅表现出1.2倍摄取增加，在mmp-2作用下，p2的纳米粒子虽然显示出去聚乙二醇化而p1的纳米粒子不仅表现出去聚乙二醇化，而且rgd残基被留下纳米粒子的表面上。因此，p1的纳米粒子显示的最高的细胞摄取。此外，从图13可以看出，相比于p2和p3纳米粒子，p1纳米粒子显著更强尼罗红的荧光强度表现出更有效的细胞内化，因此，mmp-2导致的peg去除和p1纳米粒子表面上残余的vrgdg肽协同促进了细胞摄取。

5)有效的细胞摄取对抗癌药物疗效提高具有关键作用。通过mtt法，测定了不同的药物治疗后4t1细胞的细胞活性。具体方法如下：

将4t1细胞以在1×10⁴/孔的密度种在96孔板中，含有fbs(10％)dmem培养基100μl，在37℃下，co2气氛中(5％)培养24个小时。然后，用100μl新鲜培养基替换旧的培养基，空白或负载ptx的纳米粒子以不同的浓度加入，并加入酶活化剂apma活化的mmp-2，培养24个小时后将培养基完全吸出，加入100μl新鲜培养基，再通过另外48小时的培养。细胞活性通过3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide(mtt)测定。20μlmtt溶液(5mg/mlpbs溶液)加入到每个孔中并培养在37℃下在黑暗放置4小时。再吸取培养基加入dmso(200μl)放置30分钟使得所形成的紫色甲臜晶体溶解。用酶标仪测量在490nm处的吸光度。半数最大抑制浓度(ic50)值根据mtt结果的通过graphpadprism软件计算。

结果见图14～图15，图14为空白胶束的细胞毒性评价结果；图15为在不同ptx浓度的不同高分子药物的细胞毒性的评价，其中，*p＜0.05。从图14可以看出，在mmp-2的存在下，空白的纳米粒子即使在相当高的浓度下也几乎没有显示出毒性，表明这些嵌段共聚物良好的生物相容性。从图15可以看出，相比负载ptx的p2和p3的纳米粒子以及小分子ptx，负载ptx的p1纳米粒子表现出显著增强的细胞毒性。负载ptx的p1半抑制浓度(ic50)值是85ng/ml，小分子ptx为(147ng/ml)，负载ptx的p2纳米粒子(560ng/ml)，或p3纳米粒子(1080ng/ml)。

二、药代动力学的评价

高分子药物的药代动力学在雌性6周龄的cd-1(icr)小鼠体内进行评价。具体的：

雌性6周龄cd-1(icr)小鼠随机分成三组(n＝3)。ptx负载的p1，p2，或p3纳米粒子通过尾静脉注射，ptx剂量为10mg/kg。在不同的时间间隔，从小鼠眶收集100μl血液样品装入肝素化的试管中并加入10ml乙酸乙酯。随后在10000×g下离心5分钟，分离有机溶剂并在n2下干燥。通过反相高效液相色谱(rp-hplc)测定紫杉醇的含量，(流动相为：乙腈/h2o(3∶7v/v)，流速1ml/min，uv-vis检测波长固定在217nm)。

结果如图16所示，图16为静脉注射ptx负载的p1，p2或p3后，在血液中与ptx含量在不同时间下的变化；从图16可以看出，静脉注射后，负载ptx的p1，p2和p3的纳米粒子显示了类似的相对较长的血液循环时间。p1，p2和p3的半衰期t1/2分别为3.36h，4.82h和3.92h。长血液循环能够提高肿瘤位置抗癌药物的富集。

三、h22小鼠肿瘤模型的构建

考虑到mmp酶在各种肿瘤的发展过程中的重要性，我们选择雌性cd-1(icr)小鼠的h22肿瘤模型进行抗肿瘤效果的研究。为了定量ptx量在肿瘤部位和主要器官的分布，静脉注射不同的药物制剂后，肿瘤组织和主要器官内ptx被萃取出来，用hplc系统进行分析。具体的，悬浮于200μlpbs中的h22细胞(3×10⁶)通过皮下注射到雌性6周龄cd-1(icr)小鼠的右下肢腋窝。使用数字游标卡尺监测肿瘤的大小，而且肿瘤体积(v)从方程v＝a×b²/2计算，其中a和b分别表示肿瘤的最长和最短直径。

此外，h22荷瘤小鼠用于研究的纳米粒子的体内分布。当肿瘤体积达到100mm³时，dir负载的p1，p2或p3纳米粒子通过静脉注射，剂量为1mg/kg。在不同的时间间隔(1，12，24，48和72小时)，将小鼠麻醉并用ivis小动物成像系统来获取图像。

结果见图17和图18，图17为12和24小时静脉注射后ptx在主要器官和肿瘤内的定量分析结果；图18为负载dir荧光分子的纳米粒子静脉注射后在体内生物分布图；从图17可以看出，在24个小时肿瘤部位p1纳米粒子的药物富集显著得到加强，比p2的纳米粒子增加1.47倍，p3纳米粒子2.01倍(*p＜0.05)，而药物在主要器官的分布显示没有显著的差别。为了能够看到体内纳米粒子的情况，疏水性的近红外荧光发射染料(dir)被包埋到的纳米粒子内进行从而实现实时监控。如图18所示，从图18可以看出，三个dir负载的纳米粒子的静脉注射1个小时后，肿瘤位置表现出明显的dir的荧光，24个小时达到最大值。而且，对于dir负载的p1纳米粒子在48小时显示出稍强的荧光。

四、体内的分布

同时使用h22荷瘤小鼠对负载ptx的纳米粒子的疗效进行了评价。将25只小鼠分为5组，包括pbs，小分子ptx，ptx负载的p1，p2，和p3纳米粒子。当肿瘤生长至约100mm³时，将不同的药物制剂每两天静脉注射一次，剂量为10mg/kg，总共三次注射。

为了量化ptx在主要器官和肿瘤的积累，静脉注射10mg/kg剂量的ptx后，收集相应的器官和肿瘤组织。然后将样品用pbs洗涤，之后干燥称重，加入0.5毫升ch3cn，并在10000×g离心10分钟，然后，将上清液进一步用1mlchcl3萃取。将有机相在氮气流下干燥，并将残余物溶解于100μl甲醇中，通过rp-hplc确定ptx的量。

结果见图19～图20，图19为静脉注射ptx负载的纳米粒子和小分子ptx后肿瘤大小的变化结果；数据表示为平均值±sd，n＝5，*p＜0.05。图20为在第24天从不同处理组收集的典型肿瘤的照片。从图19和图20可以看出，24天后用pbs处理的肿瘤显示出近40倍体积增加，小分子ptx为25倍，p3的纳米粒子为16倍，p2的纳米粒子为10倍。对比鲜明的是，负载ptx的p1纳米粒子有效地抑制了肿瘤生长，肿瘤大小只是增加了1.9倍。

五、动物体内抗肿瘤效果的评价

h22荷瘤小鼠随机分为5组(n＝5)。当肿瘤体积达到100mm³时，小分子ptx，负载ptx的p1，p2和p3纳米粒子通过尾静脉注射，ptx剂量为10mg/kg。每两天注射一次，共三次注射。肿瘤大小通过使用数字游标卡尺测量监测。同时，每两天记录一次小鼠的体重。在治疗(24天)结束后，所有的小鼠处死，并收集主要脏器(心脏，肝，脾，肺，肾)和肿瘤。记录肿瘤的重量，然后将肿瘤和器官包埋在石蜡中，并制备5μm的石蜡切片。将切片用苏木精和伊红(h&e)进行染色。此外，肿瘤切片进一步用末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记(tunel)测定试剂盒染色以鉴定凋亡细胞。

肿瘤切片用h&e和tunel进行染色评价凋亡细胞。

结果见图21～图23，图21为肿瘤切片的苏木精-伊红(h&e)染色的结果和末端脱氧核苷酸转移酶染色(tunel)荧光图像；图22为的小鼠体重变化；图23为心脏，肝，脾，肺，肾h&e染色，分别对应于pbs，ptx，p1，p2和p3的静脉注射；其中，白色箭头指示肝脏损伤。从图中可以看出，与ptx负载的p1纳米粒子治疗的肿瘤表现出最强的绿色荧光，这表明最多的细胞凋亡。h&e染色也证实了最显著的疗效是通过注射负载ptx的p1纳米粒子实现的。此外，五组小鼠的体重在治疗期间没有显著改变；而且，从图13可以看出，器官的h&e染色的结果主要表现出小分子ptx导致的肝损伤，而负载ptx的纳米粒子治疗组无明显器官损伤；这些结果显示p1，p2和p3纳米粒子的生物安全性较高。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。