一种基于毛细管电泳的同时检测三种蚊媒病毒的引物组及其应用的制作方法

本发明涉及一种基于毛细管电泳的同时检测三种蚊媒病毒的引物组及其应用，属于蚊媒携带传播病毒检测技术领域。

背景技术：

黄病毒科(flaviviridae)包含一大类基因组为单链正链的rna家族，目前分为黄病毒属(flavivirus)、瘟病毒属(pestivirus)、丙型肝炎病毒属(hepacivirus)以及pegivirus共四个属。登革热病毒(denguevirus,denv)、寨卡病毒(zikavirus,zikv)和黄热病毒(yellowfevervirus,yfv)同属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)成员，病毒在粒子形态、基因组结构及复制策略等方面具有很多相似性，但生物学特性各有差异，且相互间在血清学上缺乏交叉保护性，对疾病的预防和诊断增加了一定的困难。该三种病毒主要流行于东南亚、非洲、美洲及西太平洋地区，通过蚊虫叮咬传播，伊蚊是其主要传播媒介。随着国际贸易、人员等交往日益频繁，登革热、寨卡等蚊媒传染病跨地区、跨国境传播已成为新常态，造成了日益严重的公共卫生问题。如2016年在美洲地区爆发流行并导致婴幼儿小头畸形和格林-巴利综合征(gbs)的寨卡病毒，引起全球关注的突发公共卫生事件，我国也有多起输入性病例。zikv、denv等蚊媒传染病由丛林循环到都市循环的不断演变，造成每年数以万人的感染，严重威胁人类生命健康。早期预防是防控疾病爆发流行的重要手段，而开发快速、精准的检测技术是早期防控的关键。随着毛细管电泳技术(capillaryelectrophoresis,ce)的不断发展，越来越多地被广泛应用于食品微生物、呼吸道等病原体的鉴定。

本发明在对黄病毒属成员系统发生分析的基础上，针对其中denv、zikv和yfv三种常见蚊媒病毒性传染病保守区序列分别设计特异性引物对，通过一步法rt-pcr并结合毛细管电泳即可精确判读出单碱基差异的靶片段，实现对单一蚊媒病毒快速鉴定。通过进一步构建基于毛细管电泳的分子marker，实现同时快速精准鉴定三种蚊媒毒性疾病的目标。本研究建立的以毛细管电泳为基础的同时精准鉴别上述三种蚊媒传播病毒性疾病的快速鉴定技术方法，为国境口岸、基层医疗等机构开展蚊媒传染病防控提供了新的技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是解决蚊媒病毒检测过程中耗时较长、检测效率较低、检测成本较高、检测时效性不强等缺陷，提供一种基于毛细管电泳的同时检测三种蚊媒病毒的引物组及其应用，可同时检测denv、yfv、zikv三种蚊媒病毒。

本发明的技术方案，一种基于毛细管电泳的同时检测三种蚊媒病毒的引物组，包括3组引物对，分别是针对蚊媒登革热病毒denv的引物对1，针对蚊媒黄热病毒yfv的引物对2和针对蚊媒病毒zikv的引物对3；每组引物对均包括一个上游引物和下游引物。

进一步地，具体包括针对蚊媒病毒denv的上游引物f1，其序列如seqidno.1所示，下游引物r1，其序列如seqidno.2所示；

针对蚊媒病毒yfv的上游引物f2，其序列如seqidno.3所示，下游引物r2，其序列如seqidno.4所示；

针对蚊媒病毒zikv的上游引物f3，其序列如seqidno.5所示，下游引物r3，其序列如seqidno.6所示。具体如下表1所示。

表1

一种包括所述引物组的检测盒。

所述检测盒的应用，通过pcr反应同时检测登革热病毒denv、黄热病毒yfv和寨卡病毒zikv。

进一步地，所述检测盒的应用，所述pcr检测时，采用的分子marker以25μl反应体系为例具体配置如下，使用量终浓度：2х反应液：12.5μl；dna聚合酶：0.5μl；rt逆转录酶：0.5μl；上游引物：1μl；下游引物：1μl；病毒模板rna：5μl；ddh2o：4.5μl；upto25μl。

进一步地，所述上游引物和下游引物中，三对引物对的浓度一致；其中上游引物总浓度为2.5μm，下游引物总浓度为2.5μm；病毒模板rna包括对应的三种病毒模板rna，三者浓度均为10ng/μl。

所述pcr检测时，检测样本以25μl反应体系为例具体配置如下，使用量终浓度：2х反应液：12.5μl；dna聚合酶：0.5μl；rt逆转录酶：0.5μl；上游引物：1μl；下游引物：1μl；待测样本：5μl；ddh2o：4.5μl；upto25μl。

所述检测盒的应用，其特征是：pcr反应程序如下表2所示。

表2

本发明的有益效果：本发明可同时检测denv、yfv、zikv三种蚊媒病毒，具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速精准检测、操作简单、应用方便等突出的优点，为临床诊断、疾病监测检测、检验检疫等领域的病原体快速检测提供了切实可行的技术方法。

附图说明

图1是三种蚊媒病毒毛细管电泳信号图谱。

图2是三种蚊媒病毒毛细管电泳凝胶成像图谱。

图3是三种蚊媒病毒毛细管电泳分子marker的建立。

图4是denv/yfv/zikv毛细管电泳信号图谱。

图5是分子marker对denv毛细管电泳结果判定。

图6是分子marker对yfv毛细管电泳结果判定。

图7是分子marker对zikv毛细管电泳结果判定。

具体实施方式

实施例1

本发明实施例中，本发明提供的同时检测denv、yfv、zikv三种蚊媒病毒的rt-pcr扩增反应体系，反应条件、检测步骤如下：

(1)样本制备：样本核酸可从感染病毒的蚊媒组织细胞、血液等样本中直接提取，可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。

(2)作为优选，选用one-stepqrt-pcrkit(toyobo)以25μl反应体系为例具体配置如下：

以25μl反应体系为例具体配置如下，使用量终浓度：2х反应液：12.5μl；dna聚合酶：0.5μl；rt逆转录酶：0.5μl；上游引物：1μl；下游引物：1μl；病毒模板rna：5μl；ddh2o：4.5μl；upto25μl。

所述上游引物和下游引物中，三对引物对的浓度一致(三种病毒的上游引物和下游引物分别加0.33μl)；其中上游引物总浓度为2.5μm，下游引物总浓度为2.5μm。

(3)作为优选，pcr反应程序如表3所示。

表3

(4)结果分析与判定：

对pcr扩增产物采用全自动毛细管电泳仪(qseq100，光鼎生物科技(江苏)有限公司(苏常械备20180095号))，选择高分辨率卡夹s1(c105102)，alignmentmarker选择ma1(c109100)，sizemarker选择ma2(c109200)，样本注入电压4kv10s，分离压6kv330s。将pcr扩增产物用dilutionbuffer(c104405)作10倍稀释后进行毛细管电泳，操作过程按照设备说明书进行。

三种蚊媒病毒毛细管电泳信号图谱如图1所示，其中a为电泳sizemarker，b为denv，c为yfv，d为zikv。三种蚊媒病毒pcr产物经毛细管电泳后均能精确判读出预期大小的单一目的片段(误差不超过3bp)，具备较好的特异性和检测灵敏性、精确性。

三种蚊媒病毒毛细管电泳凝胶成像图谱如图2所示，其中三种蚊媒病毒pcr扩增产物经电泳后均能扩增出特异性目的条带。

三种蚊媒病毒毛细管电泳分子marker的建立如图3所示(按照实施例1中的25μl反应体系进行配置：2х反应液：12.5μl；dna聚合酶：0.5μl；rt逆转录酶：0.5μl；三种病毒上游引物混合液：1μl；下游引物混合液：1μl；包含三种病毒模板rna：5μl；ddh2o：4.5μl；upto25μl。

所述上游引物和下游引物中，三对引物对的浓度一致(三种病毒的上游引物和下游引物分别加0.33μl)；其中上游引物总浓度为2.5μm，下游引物总浓度为2.5μm。三种病毒模板rna总浓度均为10ng/μl)，由于不同靶基因线性结构的不同，毛细管电泳目标基因判读信号偏差不超过3bp，根据实验数据，将denv、yfv、zikv三种蚊媒病毒靶基因判读信号置信区间分别设置在78(±3)bp、139(±3)和169(±3)bp。通过建立上述针对三种蚊媒病毒的分子marker，即可同步实现针对三种蚊媒病毒靶基因的精准检测。

实施例2

分别以denv、yfv和zikv阳性样本作为检测对象，以建立的分子marker作为参照，按照实施例1中说明(三种病毒的上游引物和下游引物分别加0.33微升(终浓度均为0.25μm))，通过核酸提取、rt-pcr反应体系配置及毛细管电泳分析，结果如下图所示(图4)：图4中，以分子marker为参照，经核酸提取、pcr扩增及电泳后均能精确检测出对应的靶片段，从而实现同时精准鉴上述三种蚊媒病毒的目的。

分子marker对denv毛细管电泳结果判定如图5所示，分子marker对yfv毛细管电泳结果判定如图6所示，分子marker对zikv毛细管电泳结果判定如图7所示。其中，当目标峰值区间为79(+3/-3)时，判定denv阳性；当目标峰值区间为139(+3/-3)时，判定yev阳性；当目标峰值区间为169(+3/-3)时，判定zikv阳性。

本发明具备市场上独一无二的创新性，即实现同时检测三种蚊媒病毒，具有检测精准、特异性强、灵敏度高、检测时间快等突出优点，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关技术及产品报道，本发明在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>中华人民共和国无锡海关

新疆环疆绿源环保科技有限公司

新疆国际旅行卫生保健中心（乌鲁木齐海关口岸门诊部）

<120>一种基于毛细管电泳的同时检测三种蚊媒病毒的引物组及其应用

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