一种达巴万星关键中间体A40926的制备方法与流程

本发明属于生物药物分离技术领域，具体涉及达巴万星关键中间体多组分a40926的制备方法。

背景技术：

达巴万星(dalbavancin)，也称作道古霉素，是一种新型第二代半合成糖肽类抗生素，为a40926的衍生物，达巴万星最先由美国vicuronpharmaceuticals公司开发并进入临床实验，后来此公司被辉瑞公司收购，于2014年5月23日获得fda批准在美国上市的多组分抗生素。

达巴万星作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，抑制g+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(absssi)。体内、外试验表明，达巴万星对于g+菌包括耐甲氧西林金葡球菌(mrsa)、甲氧西林敏感金葡球菌(mssa)、凝固酶阴性葡萄球菌(cons)、链球菌等具有抗菌活性。对耐g+病原菌包括耐青霉素和头孢曲松肺炎链球菌、替考拉宁不敏感cons、非vana型肠球菌具有活性；对g+厌氧菌也具有活性。达巴万星是首个也是唯一一个被批准用于absssi治疗的双剂量方案的静脉注射用抗生素。

达巴万星关键中间体a40926是由野野村放线菌atcc39727发酵生物合成获得的多组分产物，发酵产物包含有效组分a0、a1、b0、b1、b2，前体物质pa、pb及少量的c(c0、c1)、d(d0、d1)组分，也包含其他的杂质(工艺杂质、降解杂质、无机杂质、发酵残留物等)。组分和前体物质的结构式如下：

a40926经酯化、酰胺化、水解获得达巴万星，但a40926为多组分的发酵产物，其有效组分a0、a1、b0、b1、b2的结构和性质相似，且各有效组分的含量及组分间比例要求高，同时需要严格控制工艺杂质、降解杂质等的限度，故对高质量多组分a40926的分离带来了很大困难，已成为盐酸达巴万星制备工艺的关键所在。

美国专利us8143212、cn107365357a中公开了一种a40926的制备方法，其发酵液脱酰化后进行陶瓷膜过滤，目标产物截留率高，需使用大量的水顶洗，导致后续层析上样体积极大；分离使用的聚酰胺树脂(sc-6)溶胀系数高，柱床填料易发生形变，影响分离效果；聚酰胺树脂上样吸附量低，虽然对色素性杂质清除较好，但对工艺杂质和降解杂质清除弱，上样完成后使用4种ph缓冲溶液洗涤、解析，操作繁琐。

中国专利cn110940763a中公开了一种a40926的精分方法，其使用高压层析，填料、设备价格高昂，且使用了乙腈作为层析溶剂，价格高、毒性大，不适用于工业化生产；目前原研上市产品为多组分(a0、a1、b0、b1、b2)的盐酸达巴万星，该专利工艺制备高纯度的a40926单一b0组分对制备达巴万星意义不大。

中国专利cn110156876a中公开的a40926制备方法，其发酵液脱酰化后进行陶瓷膜过滤，目标产物截留率高，需使用大量的水顶洗透过，不利于工业化生产；使用了酸沉淀操作，酸沉淀对溶液体系有要求，且酸沉淀样品形态不好、颗粒絮、颗粒小，难过滤，需添加助滤剂；制备的是a40926为单一b0组分产品，作为目前已上市的多组分达巴万星关键中间体并不合适。

中国专利cn110183519a中公开的a40926制备方法，发酵液水解后也采用了陶瓷膜过滤，使用了大量的水顶洗透过，目标产物依然有截留；xr910s树脂吸附上样后洗涤、解析操作复杂，且溶剂使用量大；xr3sp吸附上样，上样流出液有样品漏吸，会影响分离效果，使用高浓度的甲醇溶液洗涤、解析，工业化生产对人体伤害大，分离前后未介绍具体杂质的清除情况，a组分作为有效组分也被当做杂质进行清除，而目前已上市的多组分达巴万星对a40926的a、b组分均有严格要求，制备的a40926产品并未说明质量情况，若作为达巴万星关键中间体有待考量。

因此急需对a40926的制备工艺进行优化，保留有效组分，严格控制各有效组分的含量及组分间的比例；同时需要降低生产成本，简化工艺，保障产品质量及批间产品质量稳定。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种达巴万星关键中间体a40926的制备方法，以期望可以简化达巴万星关键中间体a40926的工业化生产方法，获得高质量的a40926。

为达到上述目的，本发明提供了一种达巴万星关键中间体a40926的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、a40926发酵液经脱酰化、板框过滤，得到脱酰化滤液；

步骤二、所述的脱酰化滤液经大孔树脂碱性吸附上样，酸性洗涤、解析，得到大孔解析合并液；

步骤三、所述的大孔解析合并液加水稀释，加氯化钠，调ph，过滤后通入聚合物微球填料吸附上样，解析后得到聚合物微球层析合并液；

步骤四、所述的聚合物微球层析合并液回调ph，经纳滤浓缩、沉淀、干燥，得到达巴万星关键中间体a40926。

所述的达巴万星关键中间体a40926是高质量多组分的a40926，高质量是指有效组分hplc纯度95％以上、含量85％以上，多组分是指包含有效组分a0、a1、b0、b1、b2。

步骤一所述的脱酰化是指向a40926发酵液中加入碱性溶液调节ph值为10.5～11.5，同时控制溶液温度为20～30℃，搅拌2～3h完成脱酰化。所述的碱性溶液是指2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水和5～15％碳酸钠溶液中的任意一种。优选的，所用的脱酰化碱性溶液为4％氢氧化钠溶液，脱酰化ph为11.0～11.5，脱酰化温度为20～30℃，脱酰化时间为2～3h，脱酰化步骤需要使前体杂质pa、pb脱酰化完全，目标产物(a0、a1、b0、b1、b2)稳定，杂质isob0的含量不得超过2.0％。

步骤二所述的大孔树脂是hz-818、xr901cs中的任意一种，树脂粒径为0.3～1.2mm，上样量为15～25g/l。选择的大孔树脂都具有对目标产物吸附选择性高而达到高载样量，树脂粒径使层析阻力小，对设备要求低，树脂价格相对低且耐用，便于产业化放大。

步骤二所述的酸性洗涤采用的洗涤剂为浓度0.05～0.5mol/l的硫酸水溶液或者0.1～1mol/l的盐酸水溶液，洗涤3～5bv；步骤二所述的解析采用的解析剂为60～80％乙醇溶液，水相含0.1～1mol/l硫酸或者0.2～2mol/l盐酸，解析2～4bv。采用酸性洗涤，流出液呈酸性，保障目标产物ph转换完全；在用乙醇溶液解析时，水相中加入一定浓度的盐酸或者硫酸，目标产物解析率高，且得到了高效富集，而吸附的色素性杂质、大分子有机杂质解析流出少。

步骤三所述的加水稀释是指向大孔解析合并液中加入3～5倍体积的水稀释作为层析上样液，加入所述的氯化钠后所述的层析上样液中氯化钠浓度为0.5～5％，步骤三所述的调ph是指用2～20％氢氧化钠溶液、5～25％氨水或者5～15％碳酸钠溶液调节所述的层析上样液的ph值为8～9。本步骤加入氯化钠的目的是保障高上样量，调节ph的目的是层析对杂质的有效清除。

步骤三所述的聚合物微球填料是unipmm40-500、ps30-300中的任意一种，优选的，聚合物微球填料是unipmm40-500，填料材质为聚甲基丙乙酸酯，粒径为40μm，孔径为500a；步骤三所述的上样量为15～25g/l，选择疏水的聚合物微球填料具有对目标产物吸附选择性高，填料为均一粒径使层析阻力相对小、柱效高，可实现高流速的上样、解析，极大的提高了生产效率，便于产业化放大。

步骤三使用的解析剂为0.01～0.1mol/l磷酸氢二钠或者0.01～0.1mol/l碳酸氢钠溶液，且该解析剂用2～20％氢氧化钠溶液调ph10.5～11.5，调节解析剂ph的目的是解析率高、下样集中，且使大极性的mag、d0、d1等杂质优先被洗脱流出，isob0、demannosyl-a40926等杂质与有效组分之间的结构差异而最后被洗脱，解析5～10bv。优选的，解析剂为0.01～0.02mol/l碳酸氢钠溶液，且用10～20％氢氧化钠溶液调ph10.5～11.0，解析5～10bv。本步骤未使用有机溶剂，目标产物解析率高，杂质清除好，有效组分保留好，产品质量得到大幅提升。

步骤四用酸液回调聚合物微球层析合并液的ph至6.0～7.0，所述酸液为10～50％硫酸或者5～15％盐酸。优选的，调ph所用的酸为10～15％盐酸，调ph后形成一价盐，保障纳滤浓缩、顶洗对一价盐的有效清除(纳滤对二价及二价以上的盐清除能力有限，对一价盐清除能力更高)。

步骤四所述的纳滤浓缩采用的膜材质为聚醚砜，纳滤膜截留分子量为100～300da，浓缩温度为10～30℃，浓缩压力为1.0～2.0mpa，所得浓缩液的浓度为100～200g/l，顶洗浓缩液等体积的水2～5次。优选的，浓缩温度为20～30℃，浓缩压力为1.5～2.0mpa，浓缩液浓度为100～200g/l，顶洗浓缩液等体积的水3～5次。纳滤浓缩对无机盐清除好，顶洗滤液电导率100us/cm以下。

步骤四所述的沉淀是指向纳滤浓缩得到的浓缩液中加入其体积4～6倍的丙酮沉淀，搅拌20～40min，静置120～180min，沉淀物的固体形态好，易过滤，无引湿吸潮现象。

步骤四所述的干燥采用鼓风干燥，鼓风干燥温度为30～40℃，干燥至减失重量≤1％/h。

本发明中涉及到的乙醇的浓度是指体积分数，其他溶液的浓度是指溶质的质量分数。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供了达巴万星关键中间体a40926的制备方法，目前国内已报道的制备方法大多仅局限于单一组分a40926-b0的制备，工艺步骤多，单元操作繁琐，后续的放大生产及产业化生产困难；单一组分的a40926-b0产品已不满足目前已上市达巴万星的需求，本发明提供的制备工艺，工艺步骤简短，单元操作简单，对色素、有机杂质、无机杂质等清除好，通过收集、合并有效组分，对a40926的有效组分a0、a1、b0、b1、b2的含量及组分间比例进行了有效控制，得到了高质量(有效组分hplc纯度高于95％、含量高于85％)、多组分的a40926产品，极大的满足了达巴万星对a40926的杂质、组分的质控要求，为达巴万星的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1是本发明的制备工艺流程图。

图2是本发明实施例1的脱酰化滤液的hplc图谱。

图3是本发明实施例2的解析合并液的hplc图谱。

图4是本发明实施例3的解析合并液的hplc图谱。

图5是本发明实施例4a40926产品的hplc图谱。

图6是本发明实施例5的解析合并液的hplc图谱。

图7是本发明实施例6a40926产品的hplc图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

a40926发酵液10000l，a40926-b0单位为1880ug/ml，用4％氢氧化钠溶液调ph11.2，控制物料温度约25℃，搅拌脱酰化。搅拌2h后取样检测a40926含量及组分前体物质pa、pb的残留量；检测结果如图2和表1所示。从表1可以看出，a40926有效组分hplc纯度为78.09％，碱降解杂质isob0为0.84％，有效控制在限度内，图2显示pa、pb已无残留，表示脱酰化已经完成。接着加入2％珍珠岩(提升过滤效率)，板框压滤，2h压滤完成得到脱酰化滤液，顶洗2500l饮用水，合并脱酰化滤液和顶洗液，共9500l。脱酰化滤液呈红棕色透明液体，经检测，脱酰化滤液的a40926-b0单位为1811ug/ml，a40926-b0的收率为91.51％。

表1实施例1脱酰化滤液的hplc图谱结果

实施例2

将实施例1合并脱酰化滤液和顶洗液得到的9500l合并液通入1000l大孔树脂hz-818(树脂粒径为0.3～1.2mm)中，上样量为17.20ga40926-b0/l树脂，流速为500～1500l/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤4000l0.1mol/l盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析2500l70％乙醇溶液(水相含0.3mol/l盐酸)，合并a40926-b0500ug/ml以上的解析液，得到1500l解析合并液①，hplc检测结果如图3和表2所示，有效组分保留好，hplc图谱0～5min杂质清除明显。解析合并液①呈褐色透明液体，解析合并液①的a40926-b0单位为11038ug/ml，可见层析后目标产物得到了高效富集，收率96.24％。

表2解析合并液①的hplc图谱结果

实施例3

取实施例2的解析合并液①150l，加水稀释至600l，加入6kg氯化钠(层析上样液中加入1％氯化钠)，用10％碳酸钠溶液调层析上样液的ph8.5，1m²板框过滤，滤液以流速200～400l/h通入100lunipmm40-500填料中上样，上样量16.56ga40926-b0/l填料，以流速300～500l/h解析900lph10.7缓冲盐溶液(0.02mol/l的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调ph)，取解析液进行hplc检测，hplc检测后合并解析液520l，hplc检测结果如图4和表3所示，即解析合并液②，其a40926-b0单位为2880ug/ml，呈淡黄色透明液体，层析后目标产物有效组分保留好、hplc纯度大幅提升，对mag、d0、d1、isob0、demannosyl-a40926等杂质清除好，且色素性杂质清除明显，收率90.45％。

表3解析合并液②的hplc图谱结果

实施例4

将实施例3的520l解析合并液②用10％盐酸调ph6.5，入料2540纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100da)，入料压力1.7mpa，温度22～28℃，浓缩至10l，水顶洗4次(10l/次)，顶洗滤液电导率44us/cm，收集浓缩液10l，所得浓缩液a40926-b0浓度为131g/l；向浓缩液中加入50l丙酮沉淀，搅拌30min，静置145min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得a40926产品1.72kg，其中a40926-b0含量75.68％，有效组分(a0、a1、b0、b1、b2)含量89.11％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.77％，收率86.92％。a40926产品的hplc图谱如图5所示，hplc图谱结果如表4所示。发酵液至a40926产品总收率69.24％。

表4a40926产品的hplc图谱结果

实施例5

向1350l实施例2的解析合并液①中加水稀释至5000l，加入50kg氯化钠(所得液体中加入1％氯化钠)，用10％碳酸钠溶液调ph8.5，板框过滤，收集滤液5000l；取250l滤液通入dac450层析柱(装填unipmm40-500填料40l)中上样，上样量18.63ga40926-b0/l填料，流速240～360l/h，解析350lph10.7缓冲盐溶液(0.02mol/l的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调ph10.7)，hplc检测后合并解析液240l；按照首针dac450层析条件和收集合并方式，再进行dac450柱层析19次(无需取样检测)，合并20针柱层析解析液得解析合并液4750l，a40926-b0单位为2864ug/ml，hplc检测结果如图6和表5所示，解析合并液呈淡黄色透明液体，层析后目标产物有效组分保留好、hplc纯度大幅提升，对mag、d0、d1、isob0、demannosyl-a40926等杂质清除好，且色素性杂质清除明显，收率91.29％。解析未使用有机溶剂，安全、环保，使用少量的填料也可以大批量生产，极大地降低了生产成本，为工业化生产奠定了坚实的基础。

表5实施例5中a40926的hplc图谱结果

实施例6

将实施例5的解析合并液4750l用10％盐酸调ph6.5，入料4040纳滤浓缩设备，入料压力1.7mpa，温度22～26℃，浓缩至90l，水顶洗4次(90l/次)，顶洗滤液电导率36us/cm，收集浓缩液90l，浓缩液a40926-b0浓度为130g/l；向浓缩液中加入450l丙酮沉淀，搅拌31min，静置150min，离心机过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得a40926产品15.20kg，其中a40926-b0含量76.33％，有效组分(a0、a1、b0、b1、b2)含量89.85％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.06％，收率85.28％。a40926产品的hplc图谱如图7所示，hplc图谱结果如表6所示。发酵液至a40926产品总收率68.57％。

表6实施例6中a40926的hplc图谱结果

实施例7

a40926发酵液1000l，a40926-b0单位为2028ug/ml，用4％氢氧化钠溶液调ph11.5，控制物料温度约25℃，搅拌脱酰化2h，加入2％珍珠岩，板框压滤，0.5h压滤完成后顶洗300l饮用水，合并脱酰化滤液和顶洗液，共1050l。脱酰化滤液呈红棕色透明液体，经hplc检测，脱酰化滤液的a40926-b0单位为1780ug/ml，a40926-b0的收率为92.16％，hplc检测结果如表7所示。

表7实施例7脱酰化滤液的hplc图谱结果

实施例8

将实施例7脱酰化滤液100l通入10l大孔树脂hz-818中上样(上样量为17.80ga40926-b0/l树脂)，流速为5～15l/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤3l0.5mol/l硫酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析20l80％乙醇溶液(水相含1mol/l硫酸)，合并a40926-b0500ug/ml以上的解析液，得到解析合并液11l，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液a40926-b0单位为15449ug/ml，收率95.47％。

将解析合并液11l，加水稀释至50l，加入2.5kg氯化钠，用25％氨水调ph9.0，过滤，滤液以流速50～100l/h通入10lunipmm40-500填料中上样，上样量16.99ga40926-b0/l填料，以流速50～100l/h解析50lph11.0缓冲盐溶液(0.1mol/l的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调ph)，解析流出液经hplc检测后得合并解析液35l，其a40926-b0单位为4100ug/ml，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率84.44％。

将unipmm40-500解析合并液35l用15％盐酸调ph7.0，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100da)，入料压力1.5mpa，温度23～28℃，浓缩至0.8l，水顶洗3次(0.8l/次)，顶洗滤液电导率75us/cm，收集浓缩液0.8l，所得浓缩液a40926-b0浓度为155g/l；向浓缩液中加入3.2l丙酮沉淀，搅拌20min，静置120min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得a40926产品160g，经hplc检测其中a40926-b0含量72.93％，有效组分(a0、a1、b0、b1、b2)含量85.85％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.88％，收率81.32％。a40926产品的hplc图谱结果如表8所示。发酵液至a40926产品总收率60.42％。

表8a40926产品的hplc图谱结果

实施例9

将实施例7脱酰化滤液100l通入10l大孔树脂hz-818中上样(上样量为17.80ga40926-b0/l树脂)，流速为5～15l/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤3l1mol/l盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析20l80％乙醇溶液(水相含2mol/l盐酸)，合并a40926-b0500ug/ml以上的解析液，得到解析合并液11l，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液a40926-b0单位为15502ug/ml，收率95.80％。

将解析合并液11l，加水稀释至50l，加入250g氯化钠，用2％氢氧化钠调ph8.0，过滤，滤液以流速50～100l/h通入10lunipmm40-500填料中上样，上样量17.05ga40926-b0/l填料，以流速50～100l/h解析100lph10.5缓冲盐溶液(0.01mol/l的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调ph)，解析流出液经hplc检测后得合并解析液65l，其a40926-b0单位为2361ug/ml，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率90.00％。

将unipmm40-500解析合并液65l用5％盐酸调ph6.0，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100da)，入料压力1.5mpa，温度23～27℃，浓缩至0.8l，水顶洗5次(0.8l/次)，顶洗滤液电导率38us/cm，收集浓缩液0.8l，所得浓缩液a40926-b0浓度为169g/l；向浓缩液中加入4.8l丙酮沉淀，搅拌40min，静置180min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得a40926产品176g，经hplc检测其中a40926-b0含量75.51％，有效组分(a0、a1、b0、b1、b2)含量88.79％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.03％，收率86.60％。a40926产品的hplc图谱结果如表9所示。发酵液至a40926产品总收率68.81％。

表9a40926产品的hplc图谱结果

实施例10

将实施例7脱酰化滤液100l通入10l大孔树脂xr901cs中上样(上样量为17.80ga40926-b0/l树脂)，流速为5～15l/h，流出液颜色深且有固形物析出，上样完成后洗涤40l0.1mol/l盐酸水溶液，流出液呈淡黄色液体、显酸性，解析30l70％乙醇溶液(水相含0.3mol/l盐酸)，合并a40926-b0500ug/ml以上的解析液，得到解析合并液18l，解析合并液呈褐色透明液体，解析合并液a40926-b0单位为9493ug/ml，收率96.00％。

将大孔解析合并液18l，加水稀释至70l，加入700g氯化钠，用10％碳酸钠溶液调ph8.5，过滤，滤液以流速50～100l/h通入10lunipmm40-500填料中上样，上样量17.09ga40926-b0/l填料，以流速50～100l/h解析90lph10.7缓冲盐溶液(0.02mol/l的碳酸氢钠溶液，用20％氢氧化钠溶液调ph)，解析流出液经hplc检测后得合并解析液50l，其a40926-b0单位为2972ug/ml，呈淡黄色透明液体，色素性杂质清除明显，收率86.96％。

将unipmm40-500解析合并液50l用10％盐酸调ph6.5，入料1812纳滤浓缩设备(聚醚砜膜，截留分子量为100da)，入料压力1.7mpa，温度23～27℃，浓缩至0.8l，水顶洗4次(0.8l/次)，顶洗滤液电导率36us/cm，收集浓缩液0.8l，所得浓缩液a40926-b0浓度为166g/l；向浓缩液中加入4l丙酮沉淀，搅拌30min，静置150min，过滤盅过滤，收集沉淀湿品；将沉淀湿品置于鼓风干燥箱中，35℃，鼓风干燥至减失重量≤1％/h以下，得a40926产品173g，经hplc检测其中a40926-b0含量75.15％，有效组分(a0、a1、b0、b1、b2)含量88.29％，产品外观呈类白色固体粉末，水分6.37％，收率87.49％。a40926产品的hplc图谱结果如表10所示。发酵液至a40926产品总收率67.31％。

表10a40926产品的hplc图谱结果

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。