1.一种香菇申香16号菌种的indel标记指纹图谱的构建方法,包括:
(1)菌丝培养:将香菇菌丝转接到pda平板上,22℃下避光培养,10d后收集菌丝;
(2)基因组dna的提取:用ctab法提取上述菌丝的基因组dna,紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度,调整样品dna的浓度为20~30ng/ul;ctab法提取菌丝的基因组dna工艺包括:
①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2ml离心管中,并放入2-3颗钢珠;
②将离心管放入多样品组织研磨机中,设置频率60hz,时间30s研磨至均匀粉末;
③加入62℃预热1h的2×ctab抽提液,于62℃保温60min,间隔20min轻摇混匀一次;
④12000rpm、4℃离心20min,分装上清液,分装为两管各800μl;
⑤在上述上清液中加入体积比为22:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入新的离心管中;
⑥在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液,轻轻混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;
⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,混匀,-20℃下静置沉淀1h,之后8000rpm、4℃离心10min,弃上清;
⑧将得到的沉淀加入1ml浓度为70%乙醇洗涤1次,8000rpm,室温离心2min;
⑨弃乙醇,超净工作台中吹干;加入100μl10×te缓冲液,轻轻敲打使沉淀溶解,加入1μl10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h,去除rna;
⑩将得到的dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用;
(3)indel分子标记的检测:对上述提取的dna进行开发的indel标记的pcr扩增;
pcr扩增体系为:总体积20μl,包括:premixtaqtm(1.22u/22μltaqdna酶,0.4mm/ldntp,0.3mm/lpcrbuffer)10ul,10μmol/lindel标记正向引物和反向引物总体积各1μl,浓度20~30ng/μl提取的模板dna2μl、ddh2o6μl;
pcr反应条件:94℃2min;94℃42second,22-60℃42second,72℃30second,32个循环;72℃7min;10℃保存;
(4)电泳检测:将上述pcr扩增得到的产物点样7μl于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳,琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2%,电泳缓冲液为1×tae,电压90v,电流300ma,功率100w,电泳2h,拍照,分析结果;
选用7对indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增,通过对照dna分子量对照d2000bpdnaladder可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量,找到符合编号组合为:20121(1+2)2的菌种,即可确定该菌种为香菇申香16号菌种;
其中7对indel标记引物序列(2′-3′)如下:
lefp_id001正向引物:acggatggagagacacagga
反向引物:tgccccacttactctcaacc
lefp_id002正向引物:cctttctcaaaagcggactg
反向引物:gggagtgggttgtttggata
lefp_id003正向引物:cggatgttatgcactggaag
反向引物:cgtacggttggacatttgaa
lefp_id004正向引物:agcctttcacagtcagctcg
反向引物:gtcaacggagggaaacagag
lefp_id002正向引物:gtagcactcctcatacaacc
反向引物:accaaatgtcacagcacagg
lefp_id006正向引物:acattggcgaaggctgtacg
反向引物:cccttttgccctataaggcg
lefp_id007正向引物:aacagtaacctgtgcactgc
反向引物:catgatcagatcacacagcg。
2.一种香菇申香16号菌种的indel标记指纹图谱,其特征在于该指纹图谱由7对indel标记组成,是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的indel标记引物,7对indel标记引物序列(2′-3′)如下:
lefp_id001正向引物:acggatggagagacacagga
反向引物:tgccccacttactctcaacc
lefp_id002正向引物:cctttctcaaaagcggactg
反向引物:gggagtgggttgtttggata
lefp_id003正向引物:cggatgttatgcactggaag
反向引物:cgtacggttggacatttgaa
lefp_id004正向引物:agcctttcacagtcagctcg
反向引物:gtcaacggagggaaacagag
lefp_id002正向引物:gtagcactcctcatacaacc
反向引物:accaaatgtcacagcacagg
lefp_id006正向引物:acattggcgaaggctgtacg
反向引物:cccttttgccctataaggcg
lefp_id007正向引物:aacagtaacctgtgcactgc
反向引物:catgatcagatcacacagcg。
3.权利要求2所述香菇申香16号菌种的indel标记指纹图谱的应用,是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对indel标记引物,对香菇菌种进行indel标记扩增,将得到的带型与申香16号菌种的带型对照,与该带型一致即为香菇申香16号菌种;其中香菇申香16号菌种的带型编号组合为:20121(1+2)2。