基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及检测呼吸道传染病病毒技术领域，尤其涉及基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒。


背景技术：

2.目前临床用于病毒检测的常规方法主要有：病原体的培养和分离，免疫学检测和核酸pcr检测。病原体培养和分离检测方法是一种传统的检测技术，检测结果准确可靠，但是敏感性较低，检测周期较长，不利于病毒感染早期的诊断；免疫学检测敏感性和特异性较强，但是检测需要材料较多且测定的结果与抗体来源及亲和力有关；核酸pcr检测方法是目前灵敏度较高的一种检测方法，较病原体分离方法的检出率高，但是当pcr的靶序列发生突变则容易造成假阴性结果。
3.masa液相芯片(multi
‑
analyte suspension array，多功能悬浮点阵仪)技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机的结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过流式点阵仪(novaht)检测时，该仪器上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病病原体的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。


技术实现要素：

4.有鉴于此，有必要提供一种新的多通道同时检测八种呼吸道传染病病毒的试剂盒和检测方法，检测通量更高，检测准确，灵敏度高。
5.本发明提供一种基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法，包括以下步骤：
6.(1)设计pcr引物、tag探针序列和双结合探针序列，所述pcr引物用于扩增八种目的基因片段，所述tag探针为5’末端进行了aminolinker c12修饰的针对八种目的基因设计的用于标识荧光微球的探针，所述双结合探针序列用于与采用所述pcr引物扩增目的基因片段的扩增产物及tag荧光微球进行特异性杂交；
7.在与所述探针互补的链的pcr引物的5’端进行生物素修饰，所述pcr引物包括8对引物，所述8对引物如下：
8.piv1上游引物：5
’‑
ggagatgtcccgtaggagaac
‑3’
，如seq id no.1所示，
9.piv1下游引物：5
’‑
biotin
‑
acagaacatgatttcctgttgtc
‑3’
，如seq id no.2所示；
10.piv2上游引物：5
’‑
cattggtgttacactcacaatgt
‑3’
，如seq id no.3所示，
11.piv2下游引物：5
’‑
biotin
‑
agcaagtctcarttcagctag
‑3’
，如seq id no.4所示；
12.piv3上游引物：5
’‑
gtaaactcagayttggtacctga
‑3’
，如seq id no.5所示，
13.piv3下游引物：5
’‑
biotin
‑
atcatattgacaatatcaagtacaa
‑3’
，如seq id no.6所示；
14.2019
‑
ncov
‑
n上游引物：5
’‑
ccactaaagcatacaatgtaacaca
‑3’
，如seq id no.7所示，
15.2019
‑
ncov
‑
n下游引物：5
’‑
biotin
‑
tcttctttttgtcctttttaggctc
‑3’
，如seq id no.8所示；
16.2019
‑
ncov
‑
rd上游引物：5
’‑
gaattttgctctcaacatacaatgc
‑3’
，如seq id no.9所示，
17.2019
‑
ncov
‑
rd下游引物：5
’‑
biotin
‑
agtgggtaagcatctatagctaaag
‑3’
，如seq id no.10所示；
18.infa上游引物：5
’‑
cttctaaccgaggtcgaaacg
‑3’
，如seq id no.11所示，
19.infa下游引物：5
’‑
biotin
‑
agggcattttggacaaagcgtcta
‑3’
，如seq id no.12所示；
20.infb上游引物：5
’‑
aaagaatttgacctagactctgc
‑3’
，如seq id no.13所示，
21.infb下游引物：5
’‑
biotin
‑
ttcctagttttacttgcattgaata
‑3’
，如seq id no.14所示；
22.gapdh上游引物：5
’‑
caagggcatcctgggctacact
‑3’
，如seq id no.15所示，
23.gapdh下游引物：5
’‑
biotin
‑
cccagcgtcaaaggtggagga
‑3’
，如seq id no.16所示；
24.所述tag探针序列如下：
25.piv1
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgtattgattgagattaaag
‑3’
，如seq id no.17所示；
26.piv2
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
tgattgtagtatgtattgataaag
‑3’
，如seq id no.18所示；
27.piv3
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gattgtaagatttgataaagtgta
‑3’
，如seq id no.19所示；
28.2019
‑
ncov
‑
n
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgaagattattggtaatgta
‑3’
，如seq id no.20所示；
29.2019
‑
ncov
‑
rd
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gattgattattgtgatttgaattg
‑3’
，如seq id no.21所示；
30.infa
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgattgtaaaagattgttga
‑3’
，如seq id no.22所示；
31.infb
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
attggtaaattggtaaatgaattg
‑3’
，如seq id no.23所示；
32.gapdh：5
’‑
nh2c12
‑
gtaagtaatgaatgtaaaaggatt
‑3’
，如seq id no.24所示；
33.所述双结合探针序列如下：
34.piv1
‑
p：5
’‑
ctttaatctcaatcaatacaaatctcattatcaattggtgatgcaatatatgcgtattca
‑3’
，如seq id no.25所示，或ctttaatctcaatcaatacaaatcatatgcgtattcatcaaacttaatcactcaaggatg
‑3’
，如seq id no.26所示；
35.piv2
‑
p：5
’‑
ctttatcaatacatactacaatcaggactatgaaaaccatttacctaagtgatggaatca
‑3’
，如seq id no.27所示；
36.piv3
‑
p：5
’‑
tacactttatcaaatcttacaatctgtatatcaactgtgttcaaccccmaaagttgatga
‑3’
，如seq id no.28所示；
37.2019
‑
ncov
‑
n：5
’‑
tacattaccaataatcttcaaatccgcgcattggcatggaagtcacaccttcg
ggaacgt
‑3’
，如seq id no.29所示；
38.2019
‑
ncov
‑
rd：5
’‑
caattcaaatcacaataatcaatcacccagatccatcaagaatcctaggggccggctgt
‑3’
，如seq id no.30所示；
39.infa
‑
p：5
’‑
tcaacaatcttttacaatcaaatcgtcaggccccctcaaagccgaratcgcgcagagact
‑3’
，如seq id no.31所示；
40.infb
‑
p：5
’‑
caattcatttaccaatttaccaattgaagcatttgaaatagcagaaggccatgaaagct
‑3’
，如seq id no.32所示；
41.gapdh
‑
p：5
’‑
aatccttttacattcattacttactctcctctgacttcaacagcgacacccac
‑3’
，如seq id no.33所示；
42.(2)液相芯片的制备：带有步骤(1)tag探针的荧光编码微球及步骤(1)中所述双结合探针偶联，得到液相芯片；
43.(3)标本检测：
44.采用步骤(1)中所述pcr引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物，再与荧光报告分子及步骤(2)得到的液相芯片进行杂交，得到杂交产物，通过液相芯片检测仪读出检测结果。
45.具体的，所述步骤(3)具体为：
46.(31)取混合tag荧光微球分散于检测缓冲液中；
47.(32)取步骤(1)得到pcr扩增产物，混匀于上述体系中，将用于盛放反应体系的容器口封闭后置于59℃环境，孵育15min；
48.(33)孵育后，再加入5μl的sa
‑
pe再次对容器口封闭，59℃孵育5min后放置于novaht加样盘中上机检测。
49.进一步的，所述步骤(3)在避光条件下进行。
50.其中，所述检测缓冲液按体积份计包含31份氯化四甲铵缓冲液，10份te溶液，以及4份10％(w/v)peg8000水溶液。
51.其中，所述氯化四甲铵缓冲液的配制组分比例及配制方法如下：
52.将体积份为225份的5mol/l氯化四甲铵水溶液，体积份为1.88份20％(w/v)十二烷基肌氨酸钠双蒸水溶液，体积份为18.75份的ph 8.0、1mol/l tris
‑
hcl溶液，体积份为3.0份的0.5mol/l edta溶液，及体积份为1.37份的双蒸水，于68℃水浴混合溶解，室温保存。
53.其中，所述te溶液的配制组分比例及配制方法如下：
54.将体积份为1份ph 8.0、1mol/l tris
‑
hcl溶液，体积份为0.2份ph 8.0、0.5mol/l edta溶液，及体积份为100份的双蒸水混合而成。
55.具体的，所述步骤(3)的杂交反应体系中，tag与双结合探针的分子比例为1:(1～1.5)。
56.具体的，带有步骤(1)tag探针的荧光编码微球的制备方法为：
57.将荧光编码的微球与0.1m，ph值4.5的2
‑
(n
‑
吗琳代)乙磺酸溶液，混匀，得到偶联体系；接着在偶联体系中加入tag探针和二氯乙烷，避光反应，得到tag荧光编码微球。
58.本发明还提供一种实现基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法的试剂盒，包括所述pcr引物，所述双结合探针和采用所述tag探针标识的荧光编码微球。
59.有益效果：
60.1、本发明将多重pcr技术和流式点阵仪(novaht)技术相结合，设计了可同时八种检测呼吸道传染病病毒的引物组。利用该引物组进行多重pcr获得目标扩增产物，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素
‑
藻红蛋白进行杂交，通过流式点阵仪读取mfi值时，从而分辨不同类型的病毒。该方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高、重复性好等有益效果，可应用于实验小鼠的质量监测、流行病学调查及早期预警。
61.2、目前实验动物常规检测方法均是单一项目检测，无法一次检测多种病原，与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，实现高通量检测，而且可以根据病原的增多灵活增加检测项目；同时样本用量少，操作简单，检测效率高，可大大降低检测成本。
62.3、通过特异性微球探针捕获pcr产物，优于传统多重检测方法用pcr产物片段长度进行结果判断，检测特异性更强。
63.4、流式点阵仪(novaht)利用生物素
‑
亲和素系统进行信号放大，其亲和力高达10
15
l/mol，比单纯的抗体亲和力高104倍以上，使检测结果更灵敏、受环境干扰较小、稳定性高；本发明方法的检测灵敏度比普通pcr高1～2个数量级。
64.5、流式点阵仪利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，大大提高了样品检测的重复性，检测结果可靠稳定：检测的重复性往往可以达到90％以上，并且线性范围也很宽。
65.6、本发明灵活度高，可以根据需要在此基础上加减检测病毒的种类。
具体实施方式
66.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
67.本发明实施例提供一种基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法，包括以下步骤：
68.(1)设计pcr引物、tag探针序列和双结合探针序列，所述pcr引物用于扩增八种目的基因片段，所述tag探针为5’末端进行了aminolinker c12修饰的针对八种目的基因设计的用于标识荧光微球的探针，所述双结合探针序列用于与采用所述pcr引物扩增目的基因片段的扩增产物及tag荧光微球进行特异性杂交；
69.在与所述探针互补的链的pcr引物的5’端进行生物素修饰，所述pcr引物包括8对引物，所述8对引物如下：
70.piv1上游引物：5
’‑
ggagatgtcccgtaggagaac
‑3’
，如seq id no.1所示，
71.piv1下游引物：5
’‑
biotin
‑
acagaacatgatttcctgttgtc
‑3’
，如seq id no.2所示；
72.piv2上游引物：5
’‑
cattggtgttacactcacaatgt
‑3’
，如seq id no.3所示，
73.piv2下游引物：5
’‑
biotin
‑
agcaagtctcarttcagctag
‑3’
，如seq id no.4所示；
74.piv3上游引物：5
’‑
gtaaactcagayttggtacctga
‑3’
，如seq id no.5所示，
75.piv3下游引物：5
’‑
biotin
‑
atcatattgacaatatcaagtacaa
‑3’
，如seq id no.6所示；
76.2019
‑
ncov
‑
n上游引物：5
’‑
ccactaaagcatacaatgtaacaca
‑3’
，如seq id no.7所
示，
77.2019
‑
ncov
‑
n下游引物：5
’‑
biotin
‑
tcttctttttgtcctttttaggctc
‑3’
，如seq id no.8所示；
78.2019
‑
ncov
‑
rd上游引物：5
’‑
gaattttgctctcaacatacaatgc
‑3’
，如seq id no.9所示，
79.2019
‑
ncov
‑
rd下游引物：5
’‑
biotin
‑
agtgggtaagcatctatagctaaag
‑3’
，如seq id no.10所示；
80.infa上游引物：5
’‑
cttctaaccgaggtcgaaacg
‑3’
，如seq id no.11所示，
81.infa下游引物：5
’‑
biotin
‑
agggcattttggacaaagcgtcta
‑3’
，如seq id no.12所示；
82.infb上游引物：5
’‑
aaagaatttgacctagactctgc
‑3’
，如seq id no.13所示，
83.infb下游引物：5
’‑
biotin
‑
ttcctagttttacttgcattgaata
‑3’
，如seq id no.14所示；
84.gapdh上游引物：5
’‑
caagggcatcctgggctacact
‑3’
，如seq id no.15所示，
85.gapdh下游引物：5
’‑
biotin
‑
cccagcgtcaaaggtggagga
‑3’
，如seq id no.16所示；
86.所述tag探针序列如下：
87.piv1
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgtattgattgagattaaag
‑3’
，如seq id no.17所示；
88.piv2
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
tgattgtagtatgtattgataaag
‑3’
，如seq id no.18所示；
89.piv3
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gattgtaagatttgataaagtgta
‑3’
，如seq id no.19所示；
90.2019
‑
ncov
‑
n
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgaagattattggtaatgta
‑3’
，如seq id no.20所示；
91.2019
‑
ncov
‑
rd
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gattgattattgtgatttgaattg
‑3’
，如seq id no.21所示；
92.infa
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
gatttgattgtaaaagattgttga
‑3’
，如seq id no.22所示；
93.infb
‑
t：5
’‑
nh2c12
‑
attggtaaattggtaaatgaattg
‑3’
，如seq id no.23所示；
94.gapdh：5
’‑
nh2c12
‑
gtaagtaatgaatgtaaaaggatt
‑3’
，如seq id no.24所示；
95.所述双结合探针序列如下：
96.piv1
‑
p：5
’‑
ctttaatctcaatcaatacaaatctcattatcaattggtgatgcaatatatgcgtattca
‑3’
，如seq id no.25所示，或ctttaatctcaatcaatacaaatcatatgcgtattcatcaaacttaatcactcaaggatg
‑3’
，如seq id no.26所示；
97.piv2
‑
p：5
’‑
ctttatcaatacatactacaatcaggactatgaaaaccatttacctaagtgatggaatca
‑3’
，如seq id no.27所示；
98.piv3
‑
p：5
’‑
tacactttatcaaatcttacaatctgtatatcaactgtgttcaaccccmaaagttgatga
‑3’
，如seq id no.28所示；
99.2019
‑
ncov
‑
n：5
’‑
tacattaccaataatcttcaaatccgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgt
‑3’
，如seq id no.29所示；
100.2019
‑
ncov
‑
rd：5
’‑
caattcaaatcacaataatcaatcacccagatccatcaagaatcctaggggccggctgt
‑3’
，如seq id no.30所示；
101.infa
‑
p：5
’‑
tcaacaatcttttacaatcaaatcgtcaggccccctcaaagccgaratcgcgcagaga
ct
‑3’
，如seq id no.31所示；
102.infb
‑
p：5
’‑
caattcatttaccaatttaccaattgaagcatttgaaatagcagaaggccatgaaagct
‑3’
，如seq id no.32所示；
103.gapdh
‑
p：5
’‑
aatccttttacattcattacttactctcctctgacttcaacagcgacacccac
‑3’
，如seq id no.33所示。
104.(2)液相芯片的制备：带有步骤(1)tag探针的荧光编码微球及步骤(1)中所述双结合探针偶联，得到液相芯片。
105.(3)标本检测：
106.采用步骤(1)中所述pcr引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物，再与荧光报告分子及步骤(2)得到的液相芯片进行杂交，得到杂交产物，通过流式点阵仪读出检测结果。
107.上述pcr扩增的序列、tag探针和双结合探针序列均分别为针对不同病毒的特异性保守序列。本发明根据副流感病毒1型(piv1)，副流感病毒2型(piv2)，副流感病毒1型(piv2)，新型冠状病毒(2019
‑
ncov的n基因和rd基因)，甲型流行感冒病毒(infa)，乙型流行感冒病毒(infb)和gapdh为人源内参基因。
108.根据核酸序列设计引物，并进行引物二级结构及互相之间形成引物二聚体的能力进行评价。本发明在设计引物时遵循以下设计原则:引物长度为18～25bp，上下游引物之间相差不超过5bp，尽量使g+c含量在40％～60％之间，引物尽量避免形成二聚体结构、发卡结构，扩增的片段大小选择在200～300bp之间，这样有利于减少微球杂交反应时的位阻效应，更有利于后续杂交反应的进行。同时，发明人也对tag探针序列形成引物二聚体的能力进行了分析，选择了与原始引物序列最合适的tag探针序列和双结合探针序列。
109.由于多重pcr体系中多个引物和模板在同一个反应管里，很容易造成互相干扰，并且引物之间很容易会形成二聚体，生物素化的引物形成二聚体后，在链霉亲和素
‑
藻红蛋白作用后也会激发出很强的荧光信号，这样就会产生很高的阴性背景荧光，影响结果的判定，甚至导致试验失败。因此引物设计是本发明的关键，也是进行液相芯片检测的基础。发明人对所设计的引物经过了大量的试验和改进，才克服了上述多重pcr引物设计的难点，优选出如上的引物组。
110.本发明将多重pcr技术和液相芯片技术相结合，设计了可同时八种检测呼吸道传染病病毒的引物组。利用该引物组进行多重pcr获得目标扩增产物，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素
‑
藻红蛋白进行杂交，通过流式点阵仪(novaht)读取mfi值时，从而分辨不同类型的病毒。该方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高、重复性好等有益效果，可应用于实验小鼠的质量监测、流行病学调查及早期预警。
111.具体的，步骤(3)具体为：
112.(31)取混合tag荧光微球分散于检测缓冲液中；
113.(32)取步骤(1)得到pcr扩增产物，混匀于上述体系中，将用于盛放反应体系的容器口封闭后置于59℃环境，孵育15min；
114.(33)孵育后，再加入5μl的sa
‑
pe再次对容器口封闭，59℃孵育5min后放置于novaht加样盘中上机检测。
115.更优选的，步骤(3)在避光条件下进行。
116.其中，检测缓冲液按体积份计包含31份氯化四甲铵缓冲液，10份te溶液，以及4份
10％(w/v)peg8000水溶液。
117.更具体的，氯化四甲铵缓冲液的配制组分比例及配制方法如下：
118.将体积份为225份的5mol/l氯化四甲铵水溶液，体积份为1.88份20％(w/v)十二烷基肌氨酸钠双蒸水溶液，体积份为18.75份的ph 8.0、1mol/l tris
‑
hcl溶液，体积份为3.0份的0.5mol/l edta溶液，及体积份为1.37份的双蒸水，于68℃水浴混合溶解，室温保存。
119.更具体的，te溶液的配制组分比例及配制方法如下：
120.将体积份为1份ph 8.0、1mol/l tris
‑
hcl溶液，体积份为0.2份ph 8.0、0.5mol/l edta溶液，及体积份为100份的双蒸水混合而成。
121.更具体的，步骤(3)的杂交反应体系中，tag与双结合探针的分子比例为1:(1～1.5)。
122.更具体的，带有步骤(1)tag探针的荧光编码微球的制备方法为：
123.将荧光编码的微球与0.1m，ph值4.5的2
‑
(n
‑
吗琳代)乙磺酸溶液，混匀，得到偶联体系；接着在偶联体系中加入tag探针和二氯乙烷，避光反应，得到tag荧光编码微球。
124.本发明还提供实现基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法的试剂盒，包括上述的pcr引物、双结合探针和采用上述tag探针标识的荧光编码微球。
125.实施例1
126.一、液相芯片制备
127.取出40u1(1
×
105个)武汉新纵科病毒疾病工程技术有限公司研制的表面羧基修饰的novastar磁性荧光微球，12000rpm离心2min后弃上清，在沉淀中加入5u1 0.1m,ph 4.5的mes溶液(2
‑
(n
‑
吗琳代)乙磺酸)，混匀得到偶联体系。将tag探针溶液稀释至0.1mm，向偶联体系中加入lul。然后加入2.5u1 l0mg/ml edc(二氯乙烷)，混匀后避光放置30min。再次加入2.5u1 l0mg/ml edc，混匀避光放置30min。用0.2m1体积百分比0.02％tween
‑
20和质量体积比0.1％的sds十二烷基硫酸钠)溶液分别各洗一次，最后将微球重新悬浮于10u1 1
×
te(ph8.0，其中的物质组成是lm tris
‑
hcl，1ml；0.5mm edta，0.2ml，加双蒸水100ml)溶液中，得到偶联tag探针的荧光微球。
128.将各偶联tag探针的荧光微球混匀，使用血细胞计数器计数微球数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微球个数)，再4℃避光保存。将上述八种偶联tag探针的荧光微球混合，使用1.5
×
tmac缓冲液稀释，使每种微球的浓度分别为100个/u1，得到液相芯片，待进行杂交检测。
129.其中，1.5
×
tmac缓冲液，即氯化四甲铵水溶液的配制方法，以250ml配制试剂比例如下：
130.5mol/l tmac(氯化四甲铵)，225ml；
131.20％(w/v)sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)，1.88ml；
132.1mol/l tris
‑
hcl，ph 8.0，18.75ml；
133.0.5mol/l edta，ph 8.0，3.0ml；
134.双蒸水，1.37ml；
135.分装后4℃冰箱保存。
136.在tmac中杂交有利于确认核苷酸序列正确配对的真阳性杂交，允许杂交温度仅随寡核苷酸长度而变，并可有效剔除gc丰富序列的假阳性结果。
137.其中，20％(w/v)sarkosyl溶液配制如sarkosyl 20g，双蒸水100ml，68℃水浴可完全溶解，不高压，室温保存。
138.二、样本检测
139.1、pcr扩增
140.对8个样本进行检测，每个待检样品先进行pcr扩增：
141.1)确保pcr反应建立区、移液器干净无污染；
142.2)取出
‑
20℃保存的pcr扩增试剂置于可制冷孔板或冰上；
143.3)按照下表配制pcr反应体系master mix，建议比所需反应用量多配1个。例如：实验检测的样品需要9个反应，考虑到分装过程中的消耗，按照10个反应的量来计算；
144.表1 pcr反应体系master mix配制
[0145][0146][0147]
4)轻弹master mix，瞬时离心；
[0148]
5)取15μl master mix于可制冷孔板或冰上预冷的pcr反应管中，盖紧管盖后重新放置于冰上；
[0149]
6)把步骤5中的加有master mix的pcr反应管连同可制冷孔板或冰一起转移到模板加样区，确保模板加样区、移液器等无污染；
[0150]
7)取出待检测核酸样品，轻弹混匀样品，瞬时离心；
[0151]
8)取5μl样品加入相应pcr反应管中，混匀样品，瞬时离心确保液体沉入管底；
[0152]
9)把混匀好的pcr反应管置于荧光定量pcr仪上，运行pcr程序；
[0153]
10)反应完成后，分析荧光定量结果，产物可
‑
20℃短期保存，长期保存应转移至
‑
80℃冰箱中。
[0154]
表2 pcr循环条件
[0155][0156]
每个样本有反应体系中：
[0157]
检测目的基因片段的体系所用的引物为上述seq id no.2所示，其中10
×
pcr缓冲液5u1.dntp(各2.5mm)4u1,hot start taq enzyme 1.5u、前述引物浓度各为0.25um、待检样品基因组dna 100ng；
[0158]
pcr产物混合后置4℃待杂交检测。
[0159]
由上述步骤可知，由于pcr扩增种使用的上游引物使用荧光基团进行修饰，因此，可对其进行酶切，而直接进行荧光检测。
[0160]
2、扩增产物与液相芯片的杂交
[0161]
1)取混合的tag荧光微球分散于检测缓冲液中；
[0162]
2)将pcr产物上述分散有tag荧光微球的检测缓冲液中，体系体积为51u1，其中含tag荧光微球5μ1，检测缓冲液45u1，双结合探针1u1，其中tag与双结合探针的分子比例为1:(1～1.5)，双结合探针浓度为0.01pmol/μl，加入1
×
te溶液补充体积至反应体积为50u1，95℃变性5min后，混匀于上述体系中，将用于盛放反应体系的容器口封闭后置于59℃环境，孵育15min；
[0163]
3)孵育后，再加入5μl的sa
‑
pe溶液再次对容器口封闭，59℃孵育5min后放置于novaht加样盘中。
[0164]
4)上机检测
[0165]
流式点阵仪(novaht)收集获得杂交后形成的“微球
‑
双结合探针
‑
核酸扩增产物
‑
sa
‑
pe”复合物的荧光信号值进行判断分析检测结果，结果如表3所示。
[0166]
表3
[0167][0168]
备注：ct值小于37为阳性大于37为阴性；荧光性号大于10000为阳性小于5000为阴性；加粗为重点指标，其它为辅助指标，重点指标有荧光定量与杂交双重结果。
[0169]
由表3可知，本发明能准确检出呼吸道病毒指标。使用本发明所述的方法和试剂盒，约5小时能得出结果。现在临床上使用的pcr
‑
rdb方法，需要2日才能完成。而且，对于大样本量检测，本发明与pcr
‑
rdb方法相比，更具有优势；并且，本发明可以对pcr扩增产物和液相芯片杂交产物均进行荧光检测，相互进行验证，提高检出率，减少假阴性样本的漏检情况发生。
[0170]
应用本发明所述的方法和试剂盒对230例的样本进行了检测，与经典的测序方法比较准确率达100％，且检出率高于经典方法。
[0171]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。