具有减轻关节炎的功效的泡菜乳酸菌沙克乳酸杆菌WIKIM0109的制作方法

具有减轻关节炎的功效的泡菜乳酸菌沙克乳酸杆菌wikim0109
技术领域
1.本发明涉及一种新型沙克乳酸杆菌菌株和包含其的组合物。


背景技术：

2.类风湿性关节炎是一种患病率为1％至1.5％的自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病，关节的炎症变化诱发全身关节水肿和疼痛，如果恶化可能会导致关节畸形和关节弯曲困难等严重后果。
3.迄今为止，诱发关节炎的直接病因尚未明确，类固醇、非甾体抗炎药、痛风抑制剂、免疫抑制剂等各种治疗剂用于治疗关节炎。然而，这些治疗剂没有表现出根本性的治疗效果，并且由于各种副作用而限制了它们的使用。并且，一些化学疗法药物具有缺点，例如对已经发生的关节炎缺乏功效。
4.因此，需要开发对炎症性症状和疼痛的缓解有效、治疗的副作用少、易于服用的关节炎治疗剂。因此，在本发明中，研究了一种泡菜来源的乳酸菌，其有效缓解关节炎症状并抑制血液中炎症相关因子的产生。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：韩国公开专利第10
‑
2018
‑
0104544号


技术实现要素：

8.技术问题
9.本发明的目的在于提供一种具有优异的关节炎改善活性的新型乳杆菌属乳酸菌。
10.解决问题的方案
11.因此，本发明人试图寻找一种具有关节炎改善效果的菌株，结果分离并鉴定新型乳杆菌属乳酸菌菌株沙克乳酸杆菌wikim0109(lactobacillus sakei wikim0109)，从而完成了本发明。
12.本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109(lactobacillus sakei wikim0109)是泡菜来源的沙克乳酸杆菌新型菌株。虽然本发明中的沙克乳酸杆菌wikim0109是从泡菜中分离、鉴定的，但其获取途径不限于此。
13.用于微生物鉴定和分类的16s rrna碱基序列分析结果，发现通过本发明实施例从传统发酵食品中分离的乳酸菌菌株具有seq id no：1的核苷酸序列。
14.因此，将具有seq id no：1的16s rrna碱基序列的本发明的微生物命名为沙克乳酸杆菌wikim0109(lactobacillus sakei wikim0109)，于2019年03月07日保藏于生物资源中心(保藏编号kctc13818bp)。
15.本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109(lactobacillus sakei wikim0109；保藏编号kctc13818bp)菌株为革兰氏阳性菌，是一种在好氧和厌氧条件下均可生长的兼性厌氧菌
(facultative anaerobe)，呈杆菌形式。
16.本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109具有乳酸菌的一般肠道调节效果和免疫增强效果。众所周知，乳杆菌属的乳酸菌具有肠道调节效果和免疫增强效果。
17.在以下实施例中，确认了本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109抑制血液中igg和igg2a的产生且抑制ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α的产生，由此具有关节炎改善效果。因此，本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109能够以各种方式应用于人或者动物的肠道调节、关节炎改善、免疫增强等用途。
18.因此，在本发明的一具体例中提供一种包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分的组合物。
19.本发明的组合物中包含的沙克乳酸杆菌wikim0109能够以活菌体形式存在，还能够以干燥或者冻干形式存在。适合包含在各种组合物中的乳酸菌的形式和配制方法是本发明所属领域普通技术人员公知的。
20.在一具体例中，上述组合物可以是用于口服给药的组合物，其包含以活菌形式存在的沙克乳酸杆菌wikim0109菌株。
21.并且，在本发明的一具体例中提供一种肠道调节剂组合物，包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分。本发明的肠道调节剂组合物可以用于预防、治疗、改善包括人在内的动物的胃肠道疾病，优选地，上述动物包括牛、马、猪等家畜。上述“胃肠道疾病”包括所有胃肠道的有害细菌感染和炎症性肠病，例如包括由病原微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等)引起的感染性腹泻、胃肠道炎症、炎症性肠病、神经性肠炎综合征、小肠微生物过度生长、肠道急性腹泻等，但不限于此。
22.本发明的肠道调节剂组合物优选口服给药。剂量可根据胃肠道疾病的种类、疾病的程度、年龄、性别、种族、治疗或者预防目的等而有所不同，但一般来说，以成人为基准，每天可以给药1000万只至1000亿只。
23.本发明提供一种用于增强免疫的组合物，包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分。众所周知，乳杆菌属的乳酸菌具有免疫增强效果。
24.本发明提供一种用于预防和改善关节炎的组合物，包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分。上述关节炎可以是选自由类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎或者银屑病关节炎组成的组中的一种以上疾病，但不限于此。
25.在一具体例中，上述关节炎可以是类风湿关节炎。
26.由于这种有利的作用，本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109可以包含在医药、保健功能食品、食品、饲料、饲料添加剂或者用于发酵食品或者饲料的乳酸菌发酵剂中。
27.在一具体例中，当本发明的组合物用作药剂学组合物时，本发明的药剂学组合物可通过使用除上述有效成分之外的药剂学上适合且生理学上可接受的助剂来制备，作为上述助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、助流剂或者增香剂等。
28.为了给药，除了上述有效成分之外，上述药剂学组合物可以进一步包含一种以上药剂学上可接受的载体来优选配制为药剂学组合物。
29.例如，为了配制为片剂或者胶囊剂的形式，有效成分可以与口服的、无毒的、药剂
学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等结合。并且，根据期望或需要，还可以包含合适的结合剂、润滑剂、崩解剂和显色剂作为混合物。合适的结合剂包括但不限于，淀粉、明胶、如葡萄糖或者β
‑
乳糖等的天然糖，玉米甜味剂、如阿拉伯胶、黄芪胶或者油酸钠等的天然树胶及合成树胶、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。对于配制为液体溶液的组合物，作为适合无菌和生物的药剂学上可接受的载体可以混合使用盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇以及这些成分中的一种以上，根据需要可以添加如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他常规添加剂。并且进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂和润滑剂来配制为如水溶液、悬浮液、乳液等的可注射剂型、丸剂、胶囊、颗粒或者片剂。
30.进而，作为该领域适合的方法可以使用remington's pharmaceutical science，mack publishing company，easton pa中公开的方法，可以根据每种疾病或者成分优选配制。
31.在另一具体例中，本发明可以是包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分的用于预防和改善关节炎的食品。上述食品组合物可以包括保健功能食品或者饮料、棒状食品等的形式。
32.在本发明中，包含上述菌株作为有效成分的食品组合物可以包括发酵乳等饮料。因此，本发明提供一种用于发酵食品或者饲料的乳酸菌发酵剂，包含沙克乳酸杆菌wikim0109、其培养物、其裂解物或者其提取物作为有效成分。
33.本发明的食品组合物能够以与上述药剂学组合物相同的方式配制而用作功能性食品，或添加到各种食品中。可以添加本发明的组合物的食品包括例如，饮料类、维生素复合剂、保健食品类等。
34.本发明的食品组合物可以包含制备食品时通常添加的成分，例如包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及增香剂。上述碳水化合物的例子包括单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、寡糖等；以及多糖，例如常规糖如糊精、环糊精等以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。作为增香剂可以使用天然增香剂(奇异果甜蛋白、甜菊提取物(例如莱鲍迪苷a、甘草甜素等))以及合成增香剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，当本发明的食品组合物制成饮品和饮料类时，可以进一步包含柠檬酸、果糖浆、糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁以及各种植物提取液。
35.上述本发明的组合物可以用作饲料添加剂或者饲料。
36.当用作饲料添加剂时，上述组合物可以制成20％至90％的高浓度溶液、粉末或者颗粒形式。上述饲料添加剂可进一步包含如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等的有机酸或者如磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、多聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等的磷酸盐或者如多酚、儿茶素、α
‑
生育酚、迷迭香提取物、维生素c、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等的天然抗氧化剂中的一种或一种以上。当用作饲料时，上述组合物可配制成常规饲料形式，可以一同包含常规饲料成分。
37.上述饲料添加剂和饲料还可以包含谷物，例如粉碎或者破碎的小麦、燕麦、大麦、玉米及大米；植物蛋白饲料，例如包含油菜、大豆、向日葵作为主要成分的饲料；动物蛋白饲料，例如血粉、肉粉、骨粉及鱼粉；糖以及乳制品，例如由各种奶粉和乳清粉组成的干燥成分
等，此外，还可以包含营养补充剂、消化及吸收增强剂、生长促进剂等。
38.上述饲料添加剂可以单独给药或者与其他饲料添加剂在食用载体中组合给予动物。并且，上述饲料添加剂可以直接混合到动物饲料中作为顶肥，或者作为与饲料分开的口服剂型容易地给予动物。当上述饲料添加剂与动物饲料分开给药时，可将其与本领域熟知的药剂学上可接受的食用载体组合制成速释或缓释制剂。这些食用载体可以是固体或者液体，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄榄油、芝麻油及丙二醇。当使用固体载体时，饲料添加剂可以是片剂、胶囊剂、粉剂、锭剂、糖衣片剂或者非分散形式的顶肥。当使用液体载体时，饲料添加剂可以是软明胶胶囊剂、糖浆剂、悬浮液、乳剂或者溶液剂的剂型。
39.并且，上述饲料添加剂和饲料可以包含助剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、增溶剂等。上述饲料添加剂可通过浸渍、喷洒或者混合的方式添加到动物的饲料中。
40.本发明的饲料或者饲料添加剂可适用于包括哺乳类、家禽类和鱼类在内的各种动物的饲料。
41.上述哺乳类不仅可以包括猪、牛、羊、山羊及实验用啮齿类动物，还可以包括宠物(例如：狗、猫)等，上述家禽类可以包括鸡、火鸡、鸭、鹅、雉及鹌鹑等，上述鱼类可以包括鳟鱼等，但不限于此。
42.以单次剂量为基准，本发明的组合物中包含的沙克乳酸杆菌wikim0109菌株的量可以约为106cfu/g至10
12
cfu/g，例如107cfu/g至10
11
cfu/g、108cfu/g至10
10
cfu/g。当给予菌株时，优选以活菌体状态给药，能够以在摄入前杀死或减毒(attenuation)的状态给药。并且，当使用培养上清液等来制备时，可进一步进行通过热处理过程的灭菌过程。达到最低功效所需的菌株量和日摄取程度可以根据摄取者的身体或者健康状况而变化，但通常可以约为106cfu/g至10
12
cfu/g，例如107cfu/g至10
11
cfu/g、108cfu/g至10
10
cfu/。
43.参考以下详细描述的实施例，本发明的优点和特征以及实现它们的方法将变得显而易见。然而，本发明并不限于以下公开的实施例，而是会以各种不同的形式来实施，这些实施例仅用于本发明的公开完整，为本发明所属领域普通技术人员充分告知发明的范围而提供，本发明仅根据权利要求的范围来定义。
44.发明的效果
45.本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109具有抑制血液中igg和igg2a产生的活性和抑制ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α产生的活性，因此作为乳酸菌其能够以各种方式应用于人或者动物的肠道调节、免疫增强、胃肠道疾病及关节炎的预防或改善等用途。进而，可有效地用作发酵用发酵剂。
46.本发明的沙克乳酸杆菌wikim0109为从泡菜中分离的乳酸菌，具有抑制血液中igg和igg2a产生的活性和抑制ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α产生的活性，因此其能够以各种方式应用于关节炎的预防或改善等用途。进而，可有效地用作发酵用发酵剂。
附图说明
47.图1为示出口服给予本发明的菌株的小鼠模型的关节炎发病率和关节炎指数的结果。
48.图2为测定根据口服给予本发明的菌株的小鼠模型的关节炎诱发的足部厚度的结果。
49.图3为测定血液中igg和胶原特异性igg(cii
‑
igg)产生量的结果。
50.图4为测定血液中igg2a和胶原特异性igg2a(cii
‑
igg2a)产生量的结果。
51.图5为测定胶原抗原特异性ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α产生量的结果。
52.图6为wikim0109与其他沙克乳酸杆菌菌株ls35和ls41的免疫调节能力对比实验结果。
具体实施方式
53.以下，通过实施例对本发明进行详细说明。以下实施例仅用于示例本发明，但本发明的范围不限于以下实施例。
54.实施例
55.实施例1：菌株的分离和鉴定
56.利用环收集将泡菜提取物的原液涂抹在mrs培养基中获得的单菌落并在mrs肉汤(mrs broth)中培养。使用qiaamp dna迷你试剂盒(qiaamp dna mini kit)(qiagen，德国(germany))进行dna提取。用1％的琼脂糖确认提取的dna，为了扩增16s rrna基因，以提取的基因组dna为模板进行pcr，pcr条件为95℃变性(denaturation)1分钟、45℃退火(annealing)1分钟、72℃延伸(extension)1分30秒进行30个循环。得到的pcr产物的序列由macrogen(首尔(seoul)，韩国(korea))分析。细菌的鉴定通过使用美国国家生物技术信息中心(ncbi，www.ncbi.nlm.nih.gov)的基本局部比对搜索工具(blast)搜索引擎对16s rrna序列进行相似度分析来执行。
57.用于微生物鉴定的16s rrna碱基序列分析结果，发现通过本发明的实施例分离的菌株具有seq id no：1的核苷酸序列。
58.因此，将具本发明的微生物命名为沙克乳酸杆菌wikim0109(lactobacillus sakei wikim0109)，于2019年03月07日保藏于生物资源中心(保藏编号kctc13818bp)。
59.实施例2：沙克乳酸杆菌wikim0109的关节炎改善功效的确认
60.将上述实施例1中分离的沙克乳酸杆菌wikim0109菌株在30℃的mrs培养基中培养24小时，将培养的菌体在8000rpm中离心5分钟，用pbs洗涤，去除剩余的培养基成分。然后，使用pbs将细菌数量定量为1
×
10
10
cfu/ml，使用探头每周5次向胶原诱导关节炎小鼠模型口服给予0.1ml(1x109cfu)。此时，向阴性对照组和阳性对照组给予无菌pbs。
61.1)胶原诱导关节炎小鼠模型中的关节炎发病率和指数的测定
62.将沙克乳酸杆菌wikim0109菌株口服给于胶原诱导关节炎小鼠模型期间的12周的关节炎指数(arthritic score)和发病率示于图1。
63.其结果，胶原诱导关节炎诱发对照组(cia
‑
no lab)的发病率和关节炎指数最高，确认到沙克乳酸杆菌wikim0109处理组(wikim0109)的发病率和关节炎指数显著降低。
64.2)感官评价和足部厚度测定
65.向实验动物口服给予沙克乳酸杆菌wikim0109菌株4周后，通过临床目测评价法对关节炎进行感官评价和足部厚度测定。
66.其结果，如图2所示，与正常组(naive)相比，胶原诱导关节炎诱发对照组(cia
‑
no lab)中作为感官评价标准的关节和手指中可以确认红斑、肿胀等症状，确认到在沙克乳酸杆菌wikim0109处理组(wikim0109)中红斑和关节的肿胀现象得到缓解，并且与对照组相
比，足部厚度减少。
67.3)血液中igg和igg2a浓度测定
68.采集实验动物的血液，测定血液中igg、胶原抗原特异性igg和igg2a以及胶原抗原特异性igg2a的浓度。图3为测定igg和胶原抗原特异性igg(cii
‑
igg)的浓度的结果，图4为测定igg2a和胶原抗原特异性igg2a(cii
‑
igg2a)的浓度的结果。
69.表1
[0070] 给药前给药后抑制率(％)igg6.52
±
0.81mg/ml4.796
±
1.08mg/ml26.5cii
‑
igg14.04
±
1.51μg/ml3.77
±
2.21μg/ml73.2igg2a118.2
±
19.55μg/ml57.65
±
9.02μg/ml51.3cii
‑
igg2a16.17
±
0.88μg/ml11.26
±
2.34μg/ml30.4
[0071]
如图3和表1所示，可以确认与正常组相比，当关节炎诱发时促进血液中igg和igg2a的产生，并且可以确认在向实验动物给予沙克乳酸杆菌wikim0109时，降低igg和igg2a的浓度。可以确认，尤其在胶原抗原特异性igg2a(cii
‑
igg2a)的情况下，与对照组相比，显著抑制约30.4％的产生。
[0072]
4)胶原抗原特异性ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α的产生浓度测定
[0073]
采集实验动物的关节周围淋巴结，获得单个细胞，将每5
×
105个细胞分注于96孔板中后，利用胶原(50μg/ml)处理48小时的上清液测定抗原特异性ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α的产生浓度。如图5所示，可以看出与正常组相比，关节炎诱发组中的抗原特异性ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α的产生增加，并且可以确认在向实验动物给药沙克乳酸杆菌wikim0109时，抗原特异性ifn
‑
γ、il
‑
17及tnf
‑
α的产生显著减少。
[0074]
5)wikim0109与其他种类的沙克乳酸杆菌的对比实验
[0075]
为了确认上述沙克乳酸杆菌wikim0109的效果是否为沙克乳酸杆菌的一般效果，将韩国食品研究院所附属的世界泡菜研究所拥有的沙克乳酸杆菌ls35和ls41与
①
免疫抑制细胞因子il
‑
10产生量增加和
②
免疫增强细胞因子il
‑
17的产生量减少进行比较。
[0076]
沙克乳酸杆菌ls35是从水泡菜中分离出的，沙克乳酸杆菌ls41是从葱/芥菜泡菜中分离出的，使用乳酸杆菌mrs(bd difco)液体培养基在30℃的培养箱中静置培养24小时。在对编码16s rrna的基因的序列进行分析后，通过使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的基本局部比对搜索工具(blast)进行同源性分析，将其鉴定为沙克乳酸杆菌。
[0077]
具有ova特异性t细胞的otⅱ小鼠购自杰克逊实验室(jackson laboratory)并在繁殖后使用。将5
×
105个otⅱ小鼠的单个脾细胞分注到96孔板，在用moi 1处理ova肽(ova323
‑
339)和泡菜乳酸菌后，在37℃的温度下培养72小时。培养液中存在的il
‑
17、il
‑
10的量分别通过使用从bd bioscience购买的微量样本多指标流式蛋白定量技术(cba)小鼠th1/th2/th17试剂盒并按照建议的方法来处理。使用facscantoⅱ(bd bioscience)进行测定后，基于标准曲线分析每个细胞因子的产生量。
[0078]
实验结果证实，与其他种类的沙克乳酸杆菌相比，用wikim0109处理时测定出较高的il
‑
10的产生、最低的il
‑
17的产生以及最高的il
‑
10/il
‑
17的比率(图6)。
[0079]
对于免疫抑制细胞因子il
‑
10，ls41菌株也表现出产生量增加，但wikim0109表现出约40％以上更高的il
‑
10的产生量增加，在ls35的情况下，仅产生wikim0109的1/3左右。
[0080]
并且，确认到对于免疫增强细胞因子il
‑
17，ls41菌株未表现出显著的产生量减少，而wikim0109表现出il
‑
17的产生量显著减少。相反，确认到在ls35的情况下，即使是相同的沙克乳酸杆菌菌株，il
‑
17的产生量反而增加了。
[0081]
以上对本发明的特定部分进行了详细说明，对于本领域普通技术人员来说，这些具体技术仅为优选实例，显然本发明的范围并不限于此。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来定义。
[0082]
保藏编号
[0083]
保藏机构名称：韩国生物资源中心(国际)
[0084]
保藏编号：kctc13818bp
[0085]
保藏日期：20190307
[0086]
译文
[0087]
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0088]
国际格式
[0089]
原始保藏的保藏证明
[0090]
保藏人：韩国食品研究院
[0091]
地址：韩国全罗北道完州郡伊西面农生命路245
[0092]
[0093][0094]
表格bp/4(kctc表格17)