技术特征：
1.一种用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外核酸例如优选为细胞外rna的方法，所述方法包括下述步骤：(aa)制备酸性结合混合物，其包含所述样品和优选地由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换固相；(bb)从所述结合混合物分离出包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换固相；(cc)在至少一种去污剂存在下裂解所述结合的细胞外囊泡，并将释放的核酸例如优选为rna结合到所述阴离子交换固相；(dd)从裂解物分离带有结合的核酸的阴离子交换固相。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：(ee)任选地清洗结合的rna；和(ff)从优选地由粒子提供的所述阴离子交换固相洗脱所述结合的rna。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(cc)包括通过将分离的包含结合的细胞外囊泡的优选由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相与包含至少一种去污剂的酸性裂解试剂进行接触来制备裂解混合物，其中所述去污剂适合于裂解细胞外囊泡，并且其中所述去污剂以使所述结合的细胞外囊泡发生裂解并释放囊泡rna的浓度用于(cc)的裂解混合物中。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)包括通过将分离的包含结合的细胞外囊泡的优选由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相与包含所述去污剂的酸性裂解试剂进行接触来制备裂解混合物，其中所述去污剂以0.1至15％例如0.5至10％、0.75％至7％或1％至5％范围内的浓度包含在所述裂解混合物中。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中在步骤(cc)中用于裂解细胞外囊泡的所述至少一种去污剂选自非离子表面活性剂和阴离子去污剂。6.根据权利要求3至5中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)的酸性裂解试剂包含：(i)所述至少一种去污剂，其浓度任选地如权利要求4中为所述裂解混合物所定义；和(ii)缓冲剂。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酸性裂解试剂具有促进释放的囊泡rna与所述粒子的阴离子交换基团结合的酸性ph，并且其中所述酸性裂解试剂具有2.5至5.5例如2.7至5.3、3至5或3至4.7范围内的ph，任选地其中所述ph在3至4.5或3至4.3的范围内。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中在步骤(cc)中使用的所述酸性裂解试剂具有一个或多个下述特征：(i)它包含基于羧酸的缓冲剂，任选为乙酸盐；(ii)它包含浓度≤500mm，例如≤450mm、≤400mm、≤350mm，优选地≤300mm或≤250mm的缓冲剂；(iii)它建立允许释放的囊泡rna与所述阴离子交换粒子直接结合的条件；(iv)所述酸性裂解试剂中的总盐浓度为1m或更低，优选为0.75m或更低、0.5m或更低或370mm或更低，任选地其中所述酸性裂解试剂中的总盐浓度为300mm或更低或275mm或更低；(v)它不包含离液盐；和/或(vi)它不包含有机溶剂。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中步骤(cc)包括添加蛋白水解酶，任
选地其中所述蛋白水解酶是蛋白酶，优选为蛋白酶k。10.根据权利要求3至9中的一项或多项所述的方法，其中在由步骤(cc)中的酸性裂解试剂建立的条件下，从裂解的细胞外囊泡释放的囊泡rna与所述裂解混合物中存在的阴离子交换粒子结合，并且其中步骤(cc)包括将分离的包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换粒子与所述酸性裂解试剂进行接触，并且其中没有为了在步骤(cc)中建立ev裂解和囊泡rna结合的条件而添加其他试剂，并且其中在步骤(dd)中从裂解物分离的所述阴离子交换粒子包含与其结合的细胞外rna，所述细胞外rna包括囊泡rna和任选的非囊泡rna。11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中在步骤(aa)中制备的所述酸性结合混合物具有2至6、例如2.5至5.5、优选地3至5、更优选地3至4.5范围内的ph，并且其中准备步骤(aa)中的ev结合条件包括添加酸性试剂，任选地其中所述酸性试剂的ph在2至5、例如2.5至5、优选地3至5、更优选地3至4.5的范围内。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸性试剂包含缓冲剂，优选为基于羧酸的缓冲剂，任选地其中所述基于羧酸的缓冲剂具有一个或多个下述特征：-所述基于羧酸的缓冲剂包含羧酸和所述羧酸的盐，其中优选地所述羧酸(i)包含1至3个羧酸基团，(ii)是脂族的，和/或(iii)是饱和的；-所述基于羧酸的缓冲剂包含1个羧基；和/或-所述基于羧酸的缓冲剂是乙酸盐缓冲剂，任选地由乙酸钠/乙酸缓冲剂提供。13.根据权利要求1至12中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(aa)中，用于将细胞外囊泡与阴离子交换粒子结合的所述结合混合物的ph低于所述粒子的阴离子交换基团的离子化形式的pka，任选地其中所述ph比所述pka低至少1、至少1.5、至少2或至少2.5个单位。14.根据权利要求1至13中的一项或多项所述的方法，其中在步骤(aa)中使用磁性阴离子交换粒子作为阴离子交换固相。15.根据权利要求1至14中的一项或多项所述的方法，其中所述阴离子交换粒子具有一个或多个下述特征：(i)它们在粒子表面处包含阴离子交换基团；(ii)它们包含相同或不同类型的阴离子交换基团；(iii)所述阴离子交换基团通过共价附连，任选地使用基于碳二亚胺的反应，特别是通过所述粒子的羧基与所述阴离子交换基团中包含的氨基的反应，附连到所述粒子的表面。16.根据权利要求1至15中的一项或多项所述的方法，其中优选地由粒子提供的所述固相的阴离子交换基团具有一个或多个下述特征：(i)它们包含至少一个可离子化基团作为官能团，其中优选地所述可离子化基团可通过质子化作用离子化，任选地其中所述阴离子交换基团的可离子化基团作为单体、寡聚物或聚合物提供在所述固相的表面上；(ii)它们包含至少一个伯氨、仲氨或叔氨基；和/或(iii)它们包含选自下述结构式的伯胺、仲胺和叔胺的基团(r)3n、(r)2nh、rnh2和/或x-(ch2)
n-y其中
x是(r)2n、rnh或nh2，y是(r)2n、rnh或nh2，r各自独立地是任选取代的直链、支链或环状烷基、烯基、炔基或芳基取代基，其可以包含一个或多个优选地选自o、n、s和p的杂原子，并且n是0至20、优选地0至18范围内的整数。17.根据权利要求1至16中的一项或多项所述的方法，其中所述阴离子交换基团包含至少一个氨基，其中所述氨基是杂环或杂芳环的一部分。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述氨基是咪唑环的一部分。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述阴离子交换基团包含组氨酸或组胺或它们的能够结合细胞外核酸和ev的衍生物。20.根据权利要求1至19中的任一项所述的方法，其中所述阴离子交换基团具有一个或多个下述特征：(i)它们包含离子化形式、优选为质子化形式的pka值≤8.0或≤7.5的可离子化基团；(ii)它们包含离子化形式、优选为质子化形式的pka值在选自4.0至8.0或4.5至7.5、优选地5.0至7.5例如5.5至7.5或5.5至7.0的范围内的可离子化基团；(iii)它们包含至少一个可离子化基团，其中所述基团可通过质子化作用离子化，其中所述可离子化基团在步骤(aa)的结合混合物的酸性ph下质子化，而在碱性ph下，例如在至少8或至少8.5的碱性ph下是中性或不带电荷的；(iv)它们在步骤(aa)和/或步骤(cc)的结合混合物的ph下，任选地在≥3至≤6或≥3.5至≤5.5范围内的ph下，每个阴离子交换基团具有单个正电荷。21.根据权利要求1至20中的任一项所述的方法，其中所述阴离子交换基团包含每个阴离子交换基团数目为n的可离子化基团，其中数目n选自1至300、1至250或1至200的范围，任选地其中所述阴离子交换基团选自下述阴离子交换基团：(i)所述阴离子交换基团包含每个阴离子交换基团30至300或50至250个可离子化基团，任选地其中这些阴离子交换基团由聚组氨酸提供；(ii)所述阴离子交换基团包含每个阴离子交换基团2至＜30个可离子化基团，例如每个阴离子交换基团3至25、4至20、5至18、6至15或8至12个可离子化基团，任选地其中这些阴离子交换基团由寡聚组氨酸基团提供；或(iii)所述阴离子交换基团包含每个阴离子交换基团1至5个可离子化基团，例如每个阴离子交换基团1至4或1至3个可离子化基团，特别是每个阴离子交换基团1、2或3个可离子化基团。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可离子化基团由氨基提供，任选地其中所述可离子化氨基被包含在聚合物中，任选地其中所述聚合物是：(i)聚烷基亚胺，任选地选自聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺或聚丁烯亚胺，优选为聚乙烯亚胺，或(ii)是包含咪唑基团的聚合物，例如聚组氨酸或寡聚组氨酸。23.根据权利要求1至22中的任一项所述的方法，其中阴离子交换粒子被用作固相，并且其中在步骤(aa)中使用的所述粒子的阴离子交换基团选自(i)聚乙烯亚胺；(ii)聚组氨酸，其中组氨酸单体的数目为至少30；(iii)寡聚组氨酸，其中组氨酸单体的数目在4至18，
例如5至16、6至14、7至13或优选地8至12的范围内；和(iv)组胺。24.根据权利要求1至23中的任一项所述的方法，其中磁性阴离子交换粒子被用于在步骤(aa)中结合所述细胞外囊泡，并且其中所述方法的一个或多个步骤使用在磁场帮助下移动磁性粒子的自动化系统来进行，任选地其中步骤(aa)至(dd)以自动化方式进行。25.权利要求1至24中的任一项所述的方法，其中所述包含细胞外囊泡的样品具有一个或多个下述特征：(i)它是体液或源自于体液，(ii)它是无细胞或除细胞体液样品，任选地其中所述样品是通过除去细胞从体液获得的样品；(iii)它是作为下述样品或通过除去细胞从下述样品衍生的无细胞或除细胞体液样品：全血，血浆，血清，淋巴液，尿液，清液，脑脊液，滑液，组织间隙液，腹水，乳汁，支气管灌洗液，唾液，羊水，精液，身体分泌物，鼻腔分泌物，阴道分泌物，伤口分泌物和排泄物；(iv)它选自血浆、血清和尿液，其中尿液优选为除细胞或无细胞尿液；(v)它是包含细胞外囊泡的细胞培养上清液。26.根据权利要求1至25中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述方法包括从体液样品除去细胞，从而提供除细胞体液样品作为包含细胞外囊泡的样品，其中在步骤(aa)中将所述样品与所述阴离子交换粒子并优选地与酸性试剂例如结合缓冲液进行接触，以制备所述酸性结合混合物。27.根据权利要求1至26中的任一项所述的方法，其中在步骤(aa)之前，对包含细胞外囊泡的除细胞或无细胞生物样品进行去除dna步骤，特别是通过将dna例如细胞外dna结合到包含阴离子交换基团的粒子并从结合混合物分离出结合的dna，从而提供包含细胞外囊泡的去除dna的样品，使其经历根据前述权利要求中的任一项所述的方法的步骤(aa)，用于将细胞外囊泡结合到优选地由阴离子交换粒子提供的阴离子交换固相。28.根据权利要求1至27中的任一项所述的方法，其中所述方法包括：(a)制备结合混合物，其包含-包含细胞外囊泡的生物样品，其中优选地所述生物样品是除细胞或无细胞体液样品，-阴离子交换粒子，-包含缓冲剂的酸性结合缓冲液，并将细胞外dna结合到所述粒子；(b)从结合混合物中分离出带有结合的细胞外dna的粒子，其中剩余的结合混合物提供包含细胞外囊泡的样品；并且(c)使用包括根据前述权利要求、特别是权利要求1至24中的任一项所述的步骤(aa)至(dd)的方法，从提供包含细胞外囊泡的样品的所述剩余的结合混合物富集细胞外囊泡。29.一种用于执行根据权利要求1至28中的任一项所述的方法的试剂盒，其包含：(a)阴离子交换粒子，(b)酸性试剂，优选为酸性缓冲液；(c)酸性裂解试剂，优选为不同于酸性试剂(b)并包含去污剂的裂解缓冲液；(d)任选的一种或多种清洗溶液；和(e)任选的一种或多种洗脱溶液。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述阴离子交换粒子如权利要求14至23中的任一项中所定义。31.根据权利要求29或30所述的试剂盒，其中优选为缓冲液的所述酸性试剂(b)如权利要求11至12中的任一项中所定义。32.根据权利要求29至31中的任一项所述的试剂盒，其中所述酸性裂解试剂(c)包含选自非离子去污剂和阴离子去污剂的去污剂。33.根据权利要求29至32中的任一项所述的试剂盒，其中优选为缓冲液的所述酸性裂解试剂(c)如权利要求3至8中的任一项中所定义。34.根据权利要求29至33中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含洗脱溶液和/或蛋白水解酶。
技术总结
本发明涉及用于从包含细胞外囊泡的样品富集细胞外核酸例如囊泡RNA的方法和试剂盒。根据所述方法制备了酸性结合混合物，其包含所述样品和阴离子交换粒子，并将细胞外囊泡结合到所述阴离子交换粒子。在将包含结合的细胞外囊泡的阴离子交换粒子从剩余混合物中分离出来之后，将结合的细胞外囊泡在至少一种去污剂存在下裂解，并将释放的RNA结合到所述阴离子交换粒子。然后从裂解物洗脱带有结合的RNA的阴离子交换粒子。阴离子交换粒子。
技术研发人员：马丁
受保护的技术使用者：凯杰有限公司
技术研发日：2020.12.16
技术公布日：2022/7/15