技术特征：
1.包含亚基的多聚组装体的人工纳米孔，每个亚基包含：(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的跨膜(tm)序列，其融合至(ii)控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的tm区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的人工纳米孔，其包含α-螺旋成孔蛋白的tm序列，优选地frac、clya、ahlb或wza(大肠杆菌(e.coli)荚膜多糖的易位子)的tm序列。3.如权利要求1所述的人工纳米孔，其包含β-桶状成孔蛋白的tm序列，优选地α-溶血素、气单胞菌溶素或炭疽保护性抗原(pa)的tm序列。4.如权利要求3所述的人工纳米孔，其中所述tm序列包括氨基酸序列vhgnaevhasffdiggsvsagf或由氨基酸序列vhgnaevhasffdiggsvsagf组成。5.如权利要求1-4中任一项所述的人工纳米孔，其中所述tm序列在n-末端或c-末端与所述成环蛋白的亚基融合。6.如权利要求1-4中任一项所述的人工纳米孔，其中所述tm序列被插入所述成环蛋白的亚基序列中。7.如权利要求1-5中任一项所述的人工纳米孔，其中所述tm序列在n-末端和/或c-末端侧侧接有至少3个、优选地至少5个氨基酸的柔性连接子，更优选地，其中所述n-末端连接子包括序列gss或由序列gss组成，和/或其中所述c-末端连接子包括序列ssg或由序列ssg组成。8.如权利要求1-7中任一项所述的人工纳米孔，其中所述成环蛋白是七聚体蛋白。9.如权利要求8所述的人工纳米孔，其中所述成环七聚体蛋白控制多核苷酸跨所述tm区的转运。10.如权利要求9所述的人工纳米孔，其中所述七聚体蛋白为atp酶,优选地为风产液菌(a.aeolicus)atp酶或其同源物或功能等效物。11.如权利要求8所述的人工纳米孔，其中所述成环七聚体蛋白控制多肽跨所述tm区的转运。12.如权利要求11所述的人工纳米孔，其中所述七聚体蛋白是蛋白酶体激活剂pa28、pa26或其同源物或功能等效物。13.如权利要求1-12中任一项所述的人工纳米孔，其中所述包含所述tm序列的成环蛋白亚基的c-末端与蛋白酶体α-亚基的n-末端基因融合。14.如权利要求1-12中任一项所述的人工纳米孔，其中包含所述tm序列的成环蛋白亚基的n-末端与clp蛋白酶(clpp)亚基的c-末端基因融合。15.多蛋白纳米孔传感器复合物，其包括(i)权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔，(ii)由蛋白酶体α-亚基组成的一个或两个环，和任选地(iii)由蛋白酶体β-亚基组成的一个或两个环。16.如权利要求15所述的多蛋白纳米孔传感器复合物，其中所述蛋白酶体α-亚基在其n-末端缺少至少5个氨基酸。17.如权利要求15或16所述的多蛋白纳米孔传感器复合物，其中所述由蛋白酶体β-亚基组成的环被工程化以提供不同类型的蛋白酶活性。18.如权利要求15-17中任一项所述的多蛋白纳米孔传感器复合物，其还包括蛋白易位酶，所述蛋白易位酶能够以相继顺序结合、解折叠多核苷酸或多肽并使多核苷酸或多肽转
移通过所述纳米孔传感器复合物。19.如权利要求18所述的多蛋白纳米孔传感器复合物，其中所述蛋白易位酶为ntp驱动的解折叠酶，优选为aaa+解折叠酶，更优选地其中所述蛋白易位酶选自clpx、vat、pan、ama、854、mba和samp。20.分析系统，其包括将流体室分成顺式侧和反式侧的疏水性膜，所述膜包含如权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔，或权利要求15-19中任一项所述的多蛋白纳米孔传感器复合物。21.用于单分子分析，优选地用于生物多聚体鉴定和/或测序，更优选地用于单分子多肽和多核苷酸测序的方法，其包括向权利要求20所述的分析系统的室中加入待分析的生物多聚体，并允许所述生物多聚体接触所述孔。22.权利要求20所述的分析系统用于单分子分析，优选地用于生物多聚体鉴定和/或测序，更优选地用于单分子多肽或多核苷酸测序的用途。23.核酸分子，其编码如权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔的亚基。24.表达载体，其包含权利要求23所述的核酸分子。25.宿主细胞，其包含权利要求24所述的表达载体，任选地还包含编码蛋白酶体β-亚基和/或蛋白酶体α-亚基的不同表达载体。
技术总结
本发明涉及纳米孔及其在分析生物多聚体(包括多肽和多核苷酸)中的用途的领域。提供了包含亚基多聚组装体的人工纳米孔，每个亚基包含(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)序列，其融合至(ii)能够控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。酸序列。
技术研发人员：乔瓦尼
受保护的技术使用者：格罗宁根大学
技术研发日：2020.11.19
技术公布日：2022/8/30