一种产胞外多糖的菌株及利用该菌株生产胞外多糖的方法和应用

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)，及利用该胶质类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法和应用。

背景技术：

近年来，我国化肥与农药的不合理使用，不仅严重破坏土壤生态环境，而且危害食品安全，影响人民身心健康。大量研究发现，微生物制剂具有活化土壤养分的作用，是支撑“减肥减药”、保障农产品质量安全不可或缺的投入品。胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)是一类革兰氏阴性，兼性厌氧，广泛分布于土壤，植物根际等环境的细菌。p.mucilaginosus可以溶解含磷、钾的难溶矿石及化合物，被称作硅酸盐细菌。研究者们推测硅酸盐细菌分泌的特殊酶以及有机酸等共同作用，从而破坏矿物的晶格，溶解硅酸盐矿物，促使k离子的释放，为植物提供营养。大量研究发现，植物益生菌分泌的eps(胞外多糖)不仅能增强细菌对植物的侵染定殖能力，而且还可帮助细菌抵抗逆境，有效地促进植物生长。目前对于胶质类芽孢杆菌分泌的胞外多糖功能主要集中提升其发酵产量、污水絮凝、蛋禽养殖饲料及保湿型化妆品中的应用，而其对植物的促生功能却少有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)，及利用该胶质类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法和应用，利用本发明保藏的胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)生产胞外多糖可以促进番茄等植株的生长，并提高了植株的抗逆性。

本发明的第一方面，提供了一种包含具有seqidno.1的16srrna序列的产胞外多糖的菌株。所述菌株为胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78，所述胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78已于2020年12月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno:61395。

本发明的胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)是胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78，该菌株分离于耕作土壤。如图1所示，菌落呈无色、半透明，表面光滑。如图2所示，菌体革兰氏染色呈阴性，杆状，产芽孢。该菌株在常见的牛肉膏蛋白胨培养基上生长缓慢，在无氮琼脂固体培养基上可生长。

本发明的第二方面，提供了一种利用胶质类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法，包括以下步骤：

s1.在固体培养基中活化上述产胞外多糖的菌株，然后接种于种子液体培养基中培养，得种子液；

s2.将步骤s1中的种子液转入发酵培养基中培养，得发酵培养液；

s3.将步骤s2中的发酵培养液离心，去除菌体，加入无水乙醇沉淀，室温静置过夜，收集胞外多糖。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤s1中固体培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-15g；酵母膏0.5-1g；k2hpo4·3h2o0.5-1g；nacl0.2-0.5g；mgso4·7h2o0.2-0.5g；caco31-3g；琼脂粉15-18g；所述固体培养基的ph为7.0-7.5。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤s1中种子液体培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-15g；酵母膏0.5-1g；k2hpo4·3h2o0.5-1g；nacl0.2-0.5g；mgso4·7h2o0.2-0.5g；caco31-3g；所述种子液体培养基的ph为7.0-7.5。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤s2中发酵培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-30g；尿素0.3-0.6g；caco31-3g；mgso4·7h2o0.6-0.8g,k2hpo40.2-0.5g；nacl0.4-0.6g；所述发酵培养基的ph为7.0-7.5。

本发明利用胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78生产出胞外多糖，其胞外多糖不仅能提高植株的生长量，并且能提高植株生长抗性。

本发明的第三方面，提供了上述产胞外多糖的菌株在制备微生物制剂中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述微生物制剂包括微生物肥料。

本发明的第四方面，提供了上述产胞外多糖的菌株在促进植物生长中的应用。所述植物包括番茄植株。

本发明的第五方面，提供了一种胞外多糖，包含葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)和葡萄糖醛酸(glucuronicacid)组分。

本发明采用gc-ms分析利用保藏的胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78生产出的胞外多糖单糖组分包含葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，目前已报道的其他菌株胶质类芽孢杆菌胞外多糖组分为葡萄糖和甘露糖，或者是葡萄糖、甘露糖及半乳糖，目前还未有葡萄糖醛酸组分报道。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78，菌落呈无色、半透明，表面光滑；菌体革兰氏染色呈阴性，杆状，产芽孢；并且利用本发明保藏的胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)生产胞外多糖可以促进番茄等植株的生长，并提高了植株的抗逆性。

附图说明

图1为本发明胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78平板培养图；

图2为本发明胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78革兰氏染色光学显微镜图；

图3为glucose标准品、胞外多糖样品总离子流图；

图4为mannose标准品、胞外多糖样品总离子流图；

图5为glucuronicacid标准品、胞外多糖样品总离子流图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明使用的菌株为胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78，所述胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78已于2020年12月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno:61395。

本实验所用菌株为胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78分离自耕作土壤，可在无氮培养基上生长。

如图1所示，菌落呈无色、半透明，表面光滑。如图2所示，菌体革兰氏染色呈阴性，杆状，产芽孢。该菌株在常见的牛肉膏蛋白胨培养基上生长缓慢，在无氮琼脂固体培养基上可生长。

实施例1、利用胶质类芽孢杆菌生产胞外多糖的方法

利用胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78生产胞外多糖的方法，包括以下步骤：

s1.在固体培养基中活化保藏的胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78，然后接种于种子液体培养基中，于25-34℃，160-200rpm条件下摇床培养8-16h，得种子液；

s2.将步骤s1中的种子液转入发酵培养基中，于25-34℃，160-200rpm条件下摇床培养75-80h，得发酵培养液；

s3.将步骤s2中的发酵培养液于4℃，以9000-12000rpm转速离心30-45min，去除菌体，加入3倍体积无水乙醇沉淀，室温静置过夜，收集胞外多糖，纯化并制成干粉。

其中，步骤s1中固体培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-15g；酵母膏0.5-1g；k2hpo4·3h2o0.5-1g；nacl0.2-0.5g；mgso4·7h2o0.2-0.5g；caco31-3g；琼脂粉15-18g；所述固体培养基的ph为7.0-7.5。

其中，步骤s1中种子液体培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-15g；酵母膏0.5-1g；k2hpo4·3h2o0.5-1g；nacl0.2-0.5g；mgso4·7h2o0.2-0.5g；caco31-3g；所述种子液体培养基的ph为7.0-7.5。

其中，所述步骤s2中发酵培养基包括以下重量的成分：

蔗糖10-30g；尿素0.3-0.6g；caco31-3g；mgso4·7h2o0.6-0.8g,k2hpo40.2-0.5g；nacl0.4-0.6g；所述发酵培养基的ph为7.0-7.5。

实施例2、胞外多糖组分分析

实验材料：葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖醛酸(glucuronicacid)3个标准品，将实施例1得到的胞外多糖(eps)采用gc-ms分析。

结果显示：见图3-5，每个标准品都检测到多个峰，代谢物后面的数字代表同分异构体，或者是该物质的反应产物。eps样品中可以检测到3种单糖，分别为葡萄糖，甘露糖及葡萄糖醛酸。

实施例3、盆栽实验

盆栽实验使用的植物营养液包括以下质量浓度的组分：

ca(no3)2·4h2o5mm；kno35mm；mgso4·7h2o2mm；fe-edta20μm；h3bo34.6μm；cuso40.32μm；znso4·7h2o0.77μm；mncl211.1μm；h2moo40.38μm，植物营养液的ph值为7.0。

本实施例使用的eps为实施例1获得的胞外多糖。

1、番茄种子发芽后，放入穴盘培养1个月后，选取同等大小的番茄苗转移至花盆中进行土培，正常浇水。移苗后第3天进行实验处理：用eps浓度为50mg/l，每棵苗浇灌20-50ml，以不加eps的植株为对照，7天浇1次，共浇3次，移苗后31天收苗。收苗数据采用spss18软件进行统计分析，多组间差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用duncan法(邓肯法)，见表1。

番茄苗地上干重、地下干重及数据统计用spss18软件进行统计。

表1

2、番茄种子发芽后，放入穴盘培养1个月后，选取同等大小的番茄苗转移至花盆中移入植物营养液中进行水培。进行实验处理：处理一：不加eps(control)为对照；处理二：移苗后第3天，营养液中加入eps(50mg/l)，4天后同时加入eps(50mg/l)和100mmnacl；处理三：移苗后第7天加入100mmnacl。每4天更换营养液，移苗后第24天收苗。收苗数据采用spss18软件进行统计分析，多组间差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用duncan法(邓肯法)，见表2。

表2

结果：根据表1的数据可知，与不加eps的植株为对照，本发明添加了浓度为50mg/l的eps的植株生长活力更佳，其根系活力、sod酶活、cat酶活、地上干重、地下干重均大于对照组，说明利用本发明胶质类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)g78生产的eps可以促进番茄植株的生长，提高植株的生物量。

根据表2的数据可知，处理二中移苗后第3天，营养液中加入eps(50mg/l)，4天后同时加入eps(50mg/l)和100mmnacl，可以有效提高植株在高盐浓度下的生长抗性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院农业资源与环境研究所

<120>一种产胞外多糖的菌株及利用该菌株生产胞外多糖的方法和应用

<130>2021.01.13

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

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<223>nisa,c,g,toru

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