一株缓解溃疡性结肠炎的植物乳杆菌及其应用

本发明涉及一株缓解溃疡性结肠炎的植物乳杆菌及其应用，具体涉及植物乳杆菌在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，属于功能性微生物技术领域。

背景技术：

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)是炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)的一种，主要临床表现为慢性或亚急性腹泻，黏液脓血便和腹痛。uc始于西方发达国家，近年来在其发病率和患病率在全球范围内呈不断上升趋势，已成为一种全球性的疾病。uc是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，疾病通常由直肠开始向向全结肠蔓延。uc的病程长，易复发，不仅影响患者的生活质量，还增加了患者罹患肠癌的风险。目前uc的发病机制尚不清楚，研究显示其主要与免疫因素、遗传因素和环境因素有关。近年来越来越多的研究显示，uc的发病与肠道菌群的异常有直接关系，因此，改善患者肠道菌群结构，也成为治疗uc的一种重要手段。

uc病因不明，且难以治愈，目前常用的uc治疗药物有三种，氨基水杨酸、激素和免疫抑制剂。氨基水杨酸类药物不会抑制免疫系统，可降低肠道的炎症，用于轻中度的uc。激素类药物和免疫抑制剂短期内可有效控制疾病活动，但不能长期使用。这三种药物对uc的治疗作用较局限且副作用较多，因此，开发出新的措施有效预防或辅助治疗uc对减少疾病产生，增强疾病治疗效果具有重要意义。近年来，一些特殊的益生菌菌株被提出在干预uc的过程中能起到有益作用。益生菌作为抗生素类生长促进剂的替代品已经在动物生产上得以应用。作为最常见的益生菌，大量研究显示一些特殊的乳杆菌菌株具有良好的抗炎和调节肠道菌群的作用，但这种作用在乳杆菌中具有明显的个体差异，目前还未找到效果较好的菌株，能够有效地抗炎并修复肠道屏障。且乳杆菌安全可食用，无副作用，因此在乳杆菌中筛选一些特殊的具有抗炎，修复肠道屏障以及诱导抗菌肽产生的菌株，可用于预防或辅助治疗uc。

技术实现要素：

鉴于目前所存在的未找到效果较好的、能够有效地抗炎并修复肠道屏障等方面功能的菌株等问题，提出了本发明。

为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm1117，于2020年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：61227。

本发明提供了所述植物乳杆菌ccfm1117在制备改善溃疡性结肠炎症状的功能性发酵食品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为使用植物乳杆菌ccfm1117发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

在本发明的一种实施方式中，所述乳制品包括酸奶、奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品。

本发明提供了所述植物乳杆菌ccfm1117在制备改善溃疡性结肠炎症状的功能性菌剂，或药物，或药物组合物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述改善溃疡性结肠炎症状包括但不限于如下方面：

(a)减少因溃疡性结肠炎而体重减轻的状况；

(b)缓解结肠长度变短；

(c)调节结肠紧密连接相关蛋白和结肠中抗菌肽的转录水平，改善结肠粘膜损伤；

(d)减少结肠中促炎因子含量；

(e)提高短链脂肪酸含量；

(f)提高肠道菌群多样性。

在本发明的一种实施方式中，所述结肠紧密连接相关蛋白包括claudin-3、zo-1、zo-2和occludin；所述结肠中抗菌肽包括cramp。

在本发明的一种实施方式中，所述结肠中促炎因子包括tnf-α、il-1β、il-6和ifn-γ。

在本发明的一种实施方式中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述肠道菌群包括粪杆菌属和粪球菌属的菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂为将含有植物乳杆菌ccfm1117的菌液干燥得到的粉剂。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中的活性植物乳杆菌ccfm1117不低于1.0×10⁶cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：将植物乳杆菌ccfm1117在mrs培养基中培养，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养18-24h，用ph为7.0-7.4磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬，使菌浓度达到10¹⁰cfu/ml；接着，悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，进行真空冷冻干燥得到所述的发酵菌剂。

在本发明的一种实施方式中，冻干保护剂为100g/l-150g/l脱脂奶粉、和/或100g/l-150g/l麦芽糊精、和/或140g/l-160g/l海藻糖。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

本发明的有益效果：本发明植物乳杆菌ccfm1117对胃肠液具有较好的耐受能力，能够减少溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，缓解结肠长度变短，改善结肠粘膜损伤，减少结肠中促炎因子tnf-α，il-1β，il-6，ifn-γ含量，上调结肠紧密连接相关蛋白claudin-3、zo-1、zo-2和occludin的基因转录水平，提高短链脂肪酸含量，增加产短链脂肪酸菌属coprococcus丰度，提高肠道菌群多样性。

本发明所述的植物乳杆菌ccfm1117能够减少溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，缓解结肠长度变短，改善结肠粘膜损伤，减少结肠中促炎因子tnf-α，il-1β，il-6，ifn-γ含量，上调结肠紧密连接相关蛋白claudin-3、zo-1、zo-2和occludin的基因转录水平，提高短链脂肪酸含量，增加产短链脂肪酸菌粪球菌属coprococcus以及产丁酸菌粪杆菌属faecalibacterium的丰度，提高肠道菌群多样性，还可用于制备具有预防uc的乳制品、豆制品与果蔬制品，具有非常广泛的应用前景。

生物材料保藏

本发明所提供的植物乳杆菌ccfm1117，分类学名称为lactobacillusplantarum，于2020年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:61227，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1是植物乳杆菌ccfm1117的菌落形态图；

图2是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠疾病症状的影响图；

图3是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠结肠长度的影响图；

图4是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠结肠粘膜损伤的影响图；

图5是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠结肠组织病理评分的影响图；

图6是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠结肠中促炎因子含量的影响图；

图7是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠结肠紧密连接相关蛋白以及抗菌肽cramp转录水平的影响图；

图8是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠粪便中短链脂肪酸含量图；

图9是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠肠道中产短链脂肪酸菌属coprococcus相对丰度以及产丁酸菌属faecalibacterium相对丰度的影响图；

图10是是植物乳杆菌ccfm1117对uc小鼠肠道菌群多样性的影响图。

具体实施方式

植物乳杆菌ccfm1117具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。

(2)菌落特征：有氧或厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘不齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。

(3)生长特性：在37℃恒温有氧或厌氧的条件下，在mmrs培养基中培养约12小时达到对数末期。

(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。

本菌株的获得方法为：

(1)取1g来自健康人群的新鲜粪便。将样品在含有山梨醇gm17培养基中35℃富集12h；

(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的gm17固体平板上，培养24～48h；

(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；

(4)将上述单菌落培养于液体gm17培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。

mmrs培养基：mrs培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐。

所使用的3％(w/v)的蔗糖溶液的浓度即为3g/100ml。

2.5％(w/v)的葡聚糖硫酸钠的浓度即为2.5g/100ml。

植物乳杆菌qs6-12：记载于朱广素等《植物乳杆菌通过调节肠道短链脂肪酸水平缓解代谢综合征》，食品科学.2019,40(13)。

实施例1：植物乳杆菌ccfm1117对模拟胃肠液的耐受性

将冷冻保存的植物乳杆菌ccfm1117接种于mmrs培养基(mrs培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mmrs培养液传代培养2～3次后，取1ml植物乳杆菌ccfm1117的培养液，与9.0mlph2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、ph＝2.5的mmrs培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h和3h时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率(结果见表1)。

取1ml植物乳杆菌ccfm1117的培养液加入9ml人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mmrs培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率(结果见表2)。

存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。

结果表明，植物乳杆菌ccfm1117对人工胃肠液具有较好的耐受性。

表1植物乳杆菌ccfm1117在人工模拟胃液中的耐受性

表2植物乳杆菌ccfm1117在人工模拟肠液中的耐受性

实施例2：植物乳杆菌ccfm1117对c57bl/6j小鼠无毒副作用

将植物乳杆菌ccfm1117菌体重悬于3％(w/v)的蔗糖溶液中，制成浓度为5.0×10⁹cfu/ml的菌悬液。取体重14-16g左右的健康雄性c57bl/6j小鼠6只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次(每次0.2ml)，观察一周，记录死亡和体重情况。

这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度5.0×10⁹cfu/ml的植物乳杆菌ccfm1117未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。

表3小鼠体重的变化及死亡情况

注：-：小鼠无死亡

实施例3：植物乳杆菌ccfm1117在缓解uc小鼠疾病症状中的应用

取体重14-16g的健康雄性c57bl/6j小鼠30只，适应环境1周，每组6只小鼠，随机分为5组：空白组、模型组、药物组、植物乳杆菌ccfm1117干预组(ccfm1117)、植物乳杆菌qs6-12对照组(qs6-12)。灌胃菌悬液的剂量为5.0×10⁹cfu/ml，重悬于3％(w/v)的蔗糖溶液中。第5周在饮水中添加终浓度为2.5g/100ml的葡聚糖硫酸钠(dextransulphatesodium，dss)持续7天以诱导小鼠结肠炎。

实验动物分组及处理方法见表4，小鼠每次灌胃相应的蔗糖溶液0.2ml：

表4动物实验设计

第五周，造模期间(即用dss处理期间)，每天定时称量小鼠体重并计算其变化的百分比。此外，每日观察小鼠的粪便性状，将其分为三个等级：第一，正常小鼠的粪便成型，且为颗粒状；第二，粪便粘度增加且易散，但不粘附于肛门则为“松散”；第三，粪便呈稀水样或不成形且粘附于肛门，即为“稀便”。同时，使用匹拉米洞法测定小鼠粪便隐血情况，若小鼠粪便含有肉眼可见的红褐色或鲜红色血液，则判定为肉眼便血。最后，根据小鼠体重、粪便性状和便血情况，计算得出小鼠的疾病活动指数(diseaseactivityindex，dai)，具体评分项目的得分如表5，具体结果如表6。

表5动物疾病活动指数(dai)评分系统

造模期间，uc模型组小鼠出现明显的便血，粪便松散和体重下降，如图2所示，模型组小鼠体重从第5天开始显著下降，在第七天时体重下降率接近10％，此外，模型组小鼠的疾病活动指数从造模第4天开始显著上升，第7天时增长至2.99±0.5(表6)，而植物乳杆菌ccfm1117的摄入可减少uc小鼠的体重下降，并改善粪便性状和便血情况，显著降低dai值，这表明本发明筛选的植物乳杆菌ccfm1117具有缓解uc小鼠疾病症状的功能。

表6小鼠患病期间疾病活动指数

实施例4：植物乳杆菌ccfm1117在缓解uc小鼠结肠长度变短中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

在第36天处死小鼠后，测量小鼠结肠长度并记录。

实验结果如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠的结肠长度显著缩短，植物乳杆菌ccfm1117干预后显著改善了uc小鼠的结肠长度变短，且效果优于药物美沙拉嗪和植物乳杆菌qs6-12。

实施例5：植物乳杆菌ccfm1117在改善小鼠结肠粘膜损伤中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织，制作结肠石蜡切片并进行he染色，实验步骤为：(1)取距肛门1cm处的一段远端结肠1cm用4％多聚甲醛固定48h；(2)将固定好的结肠组织流水冲洗8h后进行脱水，样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min；(3)将结肠样品放入1:1的二甲苯和酒精混合液中15min，然后放入二甲苯i和二甲苯ii各15min；(4)将结肠组织转移至二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡ⅰ、石蜡ⅱ透蜡各1h，温度保持60℃。(5)用莱卡石蜡包埋机将结肠包埋于重新融化的蜡块中。(6)用组织切片机对包埋好的组织切片，厚度为5μm；(7)粘片后晾干，置于62℃烘箱中1h。

he染色过程如下：(1)石蜡切片经二甲苯ⅰ、ⅱ脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min；(2)用苏木精染色20s；(3)蒸馏水洗去未结合的苏木精；(4)伊红染色2s，依次进入95％乙醇ⅰ、ⅱ，70％乙醇中，并快速拿出，然后进入80％乙醇中50～55s，进入无水乙醇中2min；(5)切片放入1:1的二甲苯和酒精混合液中1min，接着放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各2～3min；(6)用中性树胶封片。

实验结果如图4、图5所示。模型组小鼠结肠可见大量黏膜上皮细胞变性、坏死，杯状细胞数量明显减少和肠隐窝损伤，炎细胞浸润等病理变化(图3)，结肠组织损伤评分显著高于空白对照组(图4)，灌胃植物乳杆菌ccfm1117能显著降低结肠组织病理评分(图4)，改善了uc小鼠的结肠粘膜损伤(图5)，且效果优于药物美沙拉嗪和植物乳杆菌qs6-12。

实施例6：植物乳杆菌ccfm1117在降低结肠中促炎因子含量中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织。小鼠结肠组织按1:9比例加入预冷pbs缓冲液进行组织研磨，12000×g，离心15min，取上清，分别按照tnf-α、il-1β、il-6和ifn-γ酶联免疫试剂盒的检测方法测定结肠中tnf-α、il-1β、il-6和ifn-γ的含量。

实验结果如图6所示，模型组小鼠结肠中促炎因子tnf-α、il-1β、il-6和ifn-γ含量显著增高，灌胃植物乳杆菌ccfm1117显著降低了小鼠结肠中促炎因子il-1β、il-6含量，并在一定程度上减少tnf-α和ifn-γ含量，且效果优于植物乳杆菌qs6-12。

实施例7：植物乳杆菌ccfm1117在增强肠道屏障功能中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织测定结肠中紧密连接相关蛋白claudin-3、zo-1、zo-2和occludin以及抗菌肽cramp的转录水平。测定方法如下：合成claudin-3、zo-1、zo-2、occludin、cramp和gapdh的引物序列，引物信息如表7。取小鼠同部位的结肠组织1cm，迅速放入液氮中，置于负80℃冰箱冻存，取出冻存结肠组织放入已加入1mltrizol和3粒锆珠的1.5ml无酶离心管中，用组织研磨匀浆机充分匀浆，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡30s，静置10min。接着以12000g，4℃离心15min。小心吸取上层水相至一新的无酶1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，室温静置10min。接着以12000g，4℃离心15min。弃去上清，加入1ml预冷75％乙醇，轻弹洗涤沉淀。以12000g，4℃离心5min，小心吸取弃去上清，于超净台内吹干沉淀，加入50μl无酶超纯水溶解rna。使用微量分光光度计测定提取的rna浓度，od260/od280在1.9～2.0之间的质量合格。以提取质量合格的总rna为模板，按照反转录试剂盒说明书的步骤合成cdna。反转录得到的cdna进行qrt-pcr检测，pcr体系为：5μlsybrgreensupermix，3μl去离子水，0.5μl上游引物(10μmol/l)，0.5μl下游引物(10μmol/l)和1μl的cdna模板(100ng/μl)。qpcr运行程序设定：94℃，2min，(94℃，30s；61℃，30s；72℃，20s)39个循环；目的基因经过real-timepcr检测后，以gapdh为内参基因，采用2^-δδct法进行相对基因表达分析。

表7引物序列

实验结果如图7所示。由图7可以看出，模型组小鼠结肠中四种主要紧密连接蛋白claudin-3、zo-1、zo-2和occludin均发生了显著下调，灌胃植物乳杆菌ccfm1117显著提高了结肠中四种紧密连接相关蛋白的转录水平，且效果优于药物美沙拉嗪和植物乳杆菌qs6-12。此外，植物乳杆菌ccfm1117干预后显著提高了结肠中抗菌肽cramp的转录水平。以上结果说明植物乳杆菌ccfm1117能够增强uc小鼠的肠道屏障功能。

实施例8：植物乳杆菌ccfm1117在提高uc小鼠粪便中短链脂肪酸含量中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃。首先对粪便进行冻干处理，称取50mg粪便，用500μl饱和nacl溶液重悬，加入20μl的10％h2so4酸化；加入800μl无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后18000g离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水na2so4进行干燥；静置30min后18000g离心10min取上层乙醚相，利用gc-ms测定小鼠冻干粪便中的短链脂肪酸含量。使用rtx-wax柱(柱长30m，内径。25μm)；载气为he，流速为2ml/min；进样体积1μl，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min，离子化温度20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法值得标准曲线，从而计算出各短链脂肪酸浓度。

实验结果如附图8所示。由实验结果可以看出，与空白组相比，模型组小鼠粪便中短链脂肪酸总量减少，尤其是丁酸含量显著减少；植物乳杆菌ccfm1117灌胃处理显著提高了小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，包括乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸含量，且效果优于药物美沙拉嗪和对照菌qs6-12。

实施例9：植物乳杆菌ccfm1117在增加产短链脂肪酸菌粪球菌属coprococcus以及产丁酸菌粪杆菌属faecalibacterium的相对丰度中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，用dna快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的dna，对样本16srdna的v3-v4区进行pcr扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在illuminamiseqpe300平台进行高通量测序，采用qiime2分析平台对扩增子进行分析。

pcr扩增引物：

f：5’-aytgggydtaaagng-3’，seqidno.13，

r：5’-tacnvgggtatctaatcc-3’，seqidno.14。

实验结果如附图9所示。由实验结果可以看出，与空白组相比，模型组小鼠中coprococcus、faecalibacterium的相对丰度显著降低，植物乳杆菌ccfm1117干预后显著提高了coprococcus、faecalibacterium的相对丰度。

实施例10：植物乳杆菌ccfm1117在提高uc小鼠肠道菌群多样性中的应用

c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。

试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，用dna快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的dna，对样本16srdna的v3-v4区进行pcr扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在illuminamiseqpe300平台进行高通量测序，采用qiime2分析平台对扩增子进行分析。

pcr扩增引物：

f：5’-aytgggydtaaagng-3’，seqidno.15，

r：5’-tacnvgggtatctaatcc-3’，seqidno.16。

实验结果如附图10所示，与空白组相比，模型组小鼠shannon指数显著降低，说明uc小鼠肠道菌群多样性下降。植物乳杆菌ccfm1117干预后提高了shannon指数，说明植物乳杆菌ccfm1117可提高结肠炎小鼠肠道菌群的多样性。

实施例11：利用植物乳杆菌ccfm1117制造发酵食品

发酵菌剂的制备：将植物乳杆菌ccfm1117在mrs培养基中培养，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养18-24h，用ph为7.0-7.4磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬，使菌浓度达到10¹⁰cfu/ml；接着，悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，进行真空冷冻干燥得到发酵菌剂；其中所用的冻干保护剂为100g/l-150g/l脱脂奶粉、和/或100g/l-150g/l麦芽糊精、和/或140g/l-160g/l海藻糖。

选用新鲜的水果和蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的植物乳杆菌ccfm1117或含有植物乳杆菌ccfm1117的发酵菌剂，使其浓度达到1.0×10⁶cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明植物乳杆菌ccfm1117活菌的果蔬饮料。

利用本发明能够使用植物乳杆菌(ccfm1117)发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括酸奶、奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

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<210>13

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>nisa,c,g,ort

<400>13

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<222>(4)..(4)

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