一种产酸克雷伯氏菌及其菌剂和应用

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种产酸克雷伯氏菌及其菌剂和应用。
背景技术：
：泰乐菌素(tylosin，tyl)，别名泰农、泰乐霉素，于1959年美国研究人员从弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素，主要包含4个组成成分，其中泰乐菌素a占80％～90％且抗菌活性最高而其他泰乐菌素结构所占比较少。泰乐菌素a为主要的活性物质，其次是泰乐菌素b，泰乐菌素d不具有活性。泰乐菌素为一种白色板状结晶，微溶于水，呈碱性。其结构中包含酒石酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐及乳酸盐的具有易溶于水的性质。泰乐菌素是目前养殖业中应用比较广泛的大环内酯类兽用抗生素之一，泰乐菌素对革兰阳性菌、支原体、分枝杆菌、螺旋体及原虫等的抑制作用主要通过作用于细菌核蛋白体，通过阻碍细菌蛋白合成来达到抑菌的效果。由于动物机体对泰乐菌素不能达到完全吸收利用，导致至少67％的泰乐菌素会随着动物的粪便排到环境之中。目前已有研究报道了畜禽废弃物中泰乐菌素的残留浓度，a.hoese等在评估土壤中泰乐菌素的迁移特性时，测得猪粪浆中泰乐菌素的浓度是0.3mg·kg-1；李艳霞等检测了辽宁省部分规模化养殖场的猪粪、牛粪和鸡粪中的抗生素残留，发现泰乐菌素的残留浓度范围为0.23～0.35mg·kg-1，kolz等在研究泰乐菌素吸附性时，发现泰乐菌素在粪便池中的含量是1～30mg·l-1；同时畜禽粪便残留的泰乐菌素迁移也导致了严重的土壤抗生素残留和水环境抗生素的残留问题，在北京11个大型温室蔬菜生产基地中的土壤和中均检测出多种抗生素其中大环类脂类0.62μg·kg-1。王大祥等对浉河水环境抗生素分布特征调查中发现大环内酯类抗生素残留浓度较高，其中泰乐菌素的检出率为25％，浓度范围为0.1～0.3ng·l-1,mellon等在大型养殖场猪粪中含泰乐菌素89mg·kg-1。虽然泰乐菌素检出的残留量比较少，但是随着时间的推移，越来越多的泰乐菌素将会在水和土壤环境中蓄积，导致严重的生态危害，破坏生态系统的平衡以及危害人类的健康。现有的生物处理工艺如曝气生物滤池，只能消减废水中的微量泰乐菌素，更有效地降解环境中的泰乐菌素残留还要依靠特定的微生物。迄今为止，国内外对微生物降解红霉素的研究较少。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种能够高效降解泰乐菌素的产酸克雷伯氏菌及其菌剂和应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种产酸克雷伯氏菌，命名为klebsiellaoxytocatyl-t1，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2021098，保藏日期为2021年1月18日。第二方面，本发明提供了上述产酸克雷伯氏菌在降解泰乐菌素中的应用。第三方面，本发明提供了一种微生物菌剂，包含上述产酸克雷伯氏菌。第四方面，本发明提供了上述微生物菌剂的制备方法，将所述产酸克雷伯氏菌接种于培养基中得到所述微生物菌剂。进一步，所述培养基为lb培养基或以泰乐菌素为唯一碳源的无机盐培养基。第五方面，本发明还提供了上述微生物菌剂在降解泰乐菌素中的应用。第六方面，本发明提供了一种降解泰乐菌素的方法，向含有泰乐菌素的水样中添加权利要求3所述的微生物菌剂，对所述水样中的泰乐菌素进行降解。进一步，降解的条件为：温度为30-40℃，ph为5-7，180r/min振荡培养。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的产酸克雷伯氏菌tyl-t1对泰乐菌素具有极强的降解能力，能够以泰乐菌素为唯一碳源进行生长，在36h内对100mg/l的泰乐菌素的降解率能够达到80.86％，72h以后达到了最高降解率99.83％。对100mg/l的泰乐菌素在72h后能达到99％以上的降解率，具有良好的开发应用前景。附图说明图1为本发明产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1的形态照片，其中1a为菌落形态，1b和1c为透射电镜下单个细菌形态；图2为本发明产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1的系统发育树；图3为本发明本发明产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1的生长曲线图；图4为产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1对泰乐菌素的降解曲线；图5为不同底物浓度下产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1的生长曲线；图6为不同ph条件下产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1的生长曲线；图7为ph值对产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1降解能力的影响；图8为接种量对产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1降解能力的影响；图9为泰乐菌素初始浓度对产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1降解能力的影响；图10为温度对产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1降解能力的影响；图11为最优条件下产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytocatyl-t1对泰乐菌素的降解曲线。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实验材料泰乐菌素降解菌分离的土壤取自浙江省湖州市德清市某有机肥生产厂长期堆放畜禽粪便堆体的土壤。磷酸泰乐菌素(tylosin，tyl)(分析纯，95％)，购自源叶生物科技有限公司。泰乐菌素高效液相色谱测定方法仪器为agilent1260型液相色谱仪(美国安捷伦公司)；xterrarpc18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，美国waters公司，色谱条件为流动相：0.1％甲酸水溶液(a相)：乙腈(b相)，柱温：35℃，检测波长：285nm；流速为1ml·min-1，进样量10ul，洗脱程序如表1；根据所测得的高效液相色谱出峰面积与对应抗生素标准品浓度构建线性回归方程，通过所得的线性回归方程计算抗生素的浓度，为屏蔽实验过程中泰乐菌素的自降对降解菌降解的影响，泰乐菌素降解率y计算公式如下：cck表示不接菌对照处理残留抗生素浓度，ct表示接菌处理抗生素残留浓度。表1泰乐菌素液相测定梯度洗脱程序时间(min)a相(％)b相(％)09010273.526.5572.327.78722896535114060144060162080181090201090培养基：无机盐培养基的主要成分为：nh4cl：1g·l-1、kh2po4：0.5g·l-1、k2hpo4：1.5g·l-1、mgso4：0.2g·l-1、nacl：1g·l-1、2ml/l微量元素溶液，ph：7.0；微量元素溶液：cocl2·6h2o：0.1g·l-1，mncl2·4h2o：0.425g·l-1，zncl2：0.05g·l-1，nicl2·6h2o：0.01g·l-1，cuso4·5h2o：0.015g·l-1，na2moo4·2h2o：0.01g·l-1，na2seo4·2h2o：0.01g·l-1lb培养基主要成分：胰蛋白胨：10g·l-1、酵母提取物：5g·l-1、氯化钠：10g·l-1，ph：7.0；lb固体培养基：在相应液体培养基基础上添加琼脂粉15g·l-1。使用2mol·l-1的hcl溶液与2mol·l-1的naoh溶液进行ph。所有培养基均经过121℃、30min高压灭菌后备用。实施例1泰乐菌素降解菌的筛选和鉴定1、泰乐菌素降解菌的驯化、分离、纯化将100ml的无机盐培养基加入250ml锥形瓶灭菌后使用，加入10g土壤，加入泰乐菌素50mg·l-1，酵母提取物0.2g，葡萄糖0.1g，30℃，180r·min-1振荡培养3d后补加100mg·l-1泰乐菌素，30℃，180r·min-1振荡培养3d；以10％接种量转接至含100ml无机盐液体培养基的锥形瓶，加入泰乐菌素100mg·l-1，酵母提取物0.1g，葡萄糖0.05g，30℃，180r·min-1振荡培养3d；补加mg·l-1泰乐菌素，30℃，180r·min-1振荡培养3d；经过四轮驯化之后将菌液在含有100mg·l-1泰乐菌素的lb固体培养基上，放入30℃恒温培养箱避光培养24h，挑取单菌落，转接至新的含100mg·l-1泰乐菌素的lb固体培养基上，经历5次分离纯化，获得单一菌株。2、泰乐菌素降解菌tyl-t1的保存与鉴定a、泰乐菌素降解菌tyl-t1的保存将获得的单一菌株接种到含100mg·l-1泰乐菌素的lb液体培养基中，30℃，180r·min-1振荡培养24h后，在无菌操作台中取0.75ml菌液加入到事先灭菌的0.75ml的50％的甘油离心保存管中，用胶带封口之后放入-80℃超低温冰箱保存。b、泰乐菌素降解菌tyl-t1的形态学特征菌株在含100mg·l-1泰乐菌素的lb固体培养基上生长24h，菌落形态如图1a所示，菌落呈圆形、白色不透明并且边缘整齐表面有黏稠性，挑取单一菌落送至浙江省农业科学研究院测试中心进行电子显微镜观察，如图1b和1c所示，单个细菌在电镜下为短杆状、无芽孢、无鞭毛。c、泰乐菌素降解菌tyl-t1的分子学鉴定挑取对数生长期菌株，送至有康生物工程有限公司进行测序：扩增模板为细菌的总dna，细菌的16srdna的pcr扩增引物为通用引物(正向引物27f，5′-agagtttgatcctggctcag-3′；反向引物1492r，5′-tacggctaccttgttacgactt-3′)，其16srdna序列如seqidno:1所示：ggcacgggccgcaggcctacacatgcagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcttgtaggtgaggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtgaggttaataacctcattcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctggagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccacttggattcagggcc测序完成后将获得序列通过blast与genbank中的已知序列进行同源性比较，确定与泰乐菌素降解菌株同源性程度高的序列，基于获得的泰乐菌素降解菌株16srdna基因序列(1447bp)，使用mega7.0软件对泰乐菌素降解菌株tyl-t1及其近缘属种进行遗传距离分析，系统发育进化树的构建采用邻接法进行，系统发育进化树如图2所示。菌株tyl-t1与产酸克雷伯氏菌属(klebsiellaoxytoca)为同一类群，与产酸克雷伯氏菌klebsiellaoxytoca10-5243strainoct-43supercont1.1(nz_jh603143.1)亲缘关系最近，结合透射电镜以及其他表征，将tyl-t1鉴定为产酸克雷伯氏菌属，命名为产酸克雷伯氏菌tyl-t1(klebsiellaoxytocatyl-t1)。klebsiellaoxytocatyl-t1已经于2011年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为cctccno:m2021098。实施例2产酸克雷伯氏菌tyl-t1(klebsiellaoxytocatyl-t1)的降解特性a、生长曲线及降解曲线测定将获得的产酸克雷伯氏菌tyl-t1(klebsiellaoxytocatyl-t1)接种至含100mg·l-1的泰乐菌素lb液体培养基中，30℃，180r·min-1条件下进行振荡培养，设置不同时间段取样，采用分光光度法在波长600nm的条件下测定菌液的od600值，确定降解菌株的生长曲线；使用高效液相色谱对样品中抗生素的浓度进行测定，并且计算降解菌株对泰乐菌素的降解率，绘制降解曲线，生长曲线如图3所示，在0～12h降解菌生长迅速，而12～36h生长速度放缓，36h到达了菌株生长稳定期并持续到84h，84h之后菌株开始进入衰退期。降解曲线如图4所示，菌株对泰乐菌素的降解并未出现明显迟滞，在24h就达到了58.95％的降解率，并且在36h达到了80.86％的降解率，最终72h以后达到了最高降解率99.83％。b、产酸克雷伯氏菌tyl-t1的环境适应特性将获得的纯化降解菌株接种至含不同浓度(0、100、200、300、400、500mg·l-1)泰乐菌素的lb液体培养基以及不同ph值(3、4、5、6、7、8、9、10)的lb培养基中，30℃，180r·min-1条件下进行振荡培养，设置不同时间段取样，采用分光光度法在波长600nm的条件下测定菌液的od600值，确定降解菌株的生长曲线。结果分别如图5和图6所示。在同样的培养条件下，tyl-t1菌株在泰乐菌素底物浓度为0～500mg·l-1的范围内均能正常生长，在泰乐菌素浓度为100mg·l-1时生长最优，而在泰乐菌素浓度为400mg·l-1和500mg·l-1比其他底物浓度条件下更早地进入生长衰退期，推测是在对数生长期和稳定期营养物质快速消耗后并且由于高浓度的泰乐菌素的抑制作用，导致400mg·l-1和500mg·l-1条件下，降解菌株更早进入生长衰退期。事实证明在泰乐菌素底物浓度为0～500mg·l-1的范围内tyl-t1菌株有很好的适应性。菌株在初始培养ph为3时，生长受到严重抑制，不能正常生长，当初始培养ph为4的时候，降解菌的生长od600值最大，生长稳定期的od600值也高于其他条件，ph值为5～9的条件下随着ph值的升高，降解菌生长od600值依次降低，在初始培养ph值为10的时候影响最为显著。由此得出结论在初始培养ph值为5～9的条件下较为适宜降解菌株生长，tyl-t1菌株对不同环境ph有着较好的适应能力。c、底物浓度、ph、温度以及接种量对产酸克雷伯氏菌tyl-t1降解能力的影响将获得的纯化降解菌株以1％的接种量接种至含不同浓度泰乐菌素(0、100、200、300、400、500mg·l-1)、ph(4、5、6、7、8)以及温度(20、25、30、35、40℃)的lb液体培养基中，并按照不同的接种量(1％、2％、3％、4％、5％)于lb培养基中进行培养，设置不同时段取样，测定培养基中泰乐菌素的残留浓度。每个试验均设置3重复1不接菌空白对照。ph值对降解特性的影响结果如图7所示，初始培养ph对降解菌的降解效果有显著影响，当ph值为4时，降解菌在0～12h的降解受到抑制，12h时降解率仅为2.47％，12～24h降解速率显著加快，在24h降解率为56.78％，在60h达到最大降解率95.99％，推测是由于降解菌生长过程产生碱性物质，导致降解环境ph值改变，最终导致最后降解的提高；ph值为5～7的范围内降解菌降解并没有太大差异，ph为5时在72h达到最大降解率98.24％，ph为6和ph为7在72h降解率分别为99.29％和99.59％；当ph为8时，降解菌的降解速率较其他ph值有所放缓，12h降解率为16.53％，高于ph为4，但低于ph为5～7(24.54％、39.47％、35.5％)，在其他时间段，ph为8的降解效率均低于其他ph值范围，但是在72h达到最大降解率为99.67％，高于在其他ph值72h的最大降解率，推测可能由于降解菌株在碱性条件下的功能受到一定抑制，并且由于泰乐菌素在碱性条件易分解，结合推测降解菌可能产生碱性物质改变降解环境ph所导致的。接种量对降解特性的影响结果如图8所示，不同接种量之间降解率并无明显差异，4％与5％接种量实验组在48h降解率低于其他组，分别为94.88％与95.50％，而1％接种量实验组在0～48h降解率均略高于其他实验组，推测是由于初始培养菌株数量较少，竞争压力较小，在培养过程快速繁殖对抗生素快速降解，在本研究中不同接种量并未最终影响降解效果，各实验组在72h均达到最高降解率(分别为99.57％、99.70％、99.79％、99.78％、99.33％)，证明初始降解菌数量并不会对降解效果造成影响。底物浓度对降解特性的影响结果如图9所示，泰乐菌素浓度为25mg·l-1时，降解菌对目标抗生素降解速率最快，在12h就达到了79.97％，在24h就达到了90.98％的降解效率，当泰乐菌素浓度为50mg·l-1时，降解菌也有较快的降解速率24h达到了94.99％，而泰乐菌素浓度分别为100mg·l-1、150mg·l-1、200mg·l-1时，降解菌降解特性没有较大差异，随着浓度升高，降解菌降解速率略有减慢，但最终72h都能达到最大降解率，均高于99％，证明该降解菌在针对较低浓度泰乐菌素时降解迅速，同时有着很高的降解效果，而当泰乐菌素浓度为200mg·l-1时，在72h也能达到99％以上的降解率。证明降解菌对不同浓度泰乐菌素都有着很好的降解潜力。温度对降解特性的影响结果如图10所示，温度对降解菌降解有着较大的影响，在低温条件下降解菌对泰乐菌素的降解受到了严重的抑制，20℃条件下24h的降解率仅为27.94％，在72h降解率为64.19％；但随着温度升高，降解效率明显提高，25℃，在24h降解率为31.21％，在72h为77.25％，而培养温度为30℃，72h降解率为99.47％；培养温度为35℃与40℃时降解菌对泰乐菌素降解有了显著提升，在24h降解率分别为78.30％和76.97％,72h降解率分别为99.78％和99.45％，推测在30℃～40℃能够促进微生物对泰乐菌素的作用，促进了降解菌株所分泌的降解酶或者其他分泌物与泰乐菌素之间的化学反应，从而促进泰乐菌素的降解。降解最优条件：培养条件为180r·min-1、温度为35℃、泰乐菌素浓度为25mg·l-1、培养初始ph为7、接种量1％，恒温摇床培养72h，每12h取样测定泰乐菌素的浓度，绘制泰乐菌素降解曲线，结果如图11所示，在本实验条件设定下降解菌在24h对泰乐菌素的降解率为97.24％，在36h就达到了最高降解率99.34％，验证了降解菌株tyl-t1对泰乐菌素降解的最优培养条件为温度为35℃，泰乐菌素浓度为25mg·l-1，培养初始ph为7，接种量1％。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江农林大学<120>一种产酸克雷伯氏菌及其菌剂和应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1447<212>dna<213>产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)<400>1ggcacgggccgcaggcctacacatgcagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcggg60tgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataacta120ctggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcc180tcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcttgtaggtgaggtaacggctcacctag240gcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtcc300agactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagc360catgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggg420agtgaggttaataacctcattcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccg480tgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag540cgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgca600ttcgaaactggcaggctggagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaa660atgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacg720ctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaa780acgatgtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagt840cgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgca900caagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgac960atccagagaatttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgca1020tggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct1080tatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccagtgataaactgg1140aggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgct1200acaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgt1260cgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtg1320gatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1380ggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccacttggatt1440cagggcc1447当前第1页12