KIR2DS3基因分型试剂盒和分型方法与流程

kir2ds3基因分型试剂盒和分型方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种kir2ds3基因分型试剂盒和分型方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)在人体内通过细胞因子和细胞毒作用，抵御感染和杀灭恶变细胞，在先天免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin
‑
like receptor，kir)是主要表达于nk细胞和部分t细胞表面的一组免疫球蛋白样超家族成员，能够特异性地识别人类主要组织相容性复合物mhc
‑
i类分子(human leukocyte antigen i，hla
‑
i)，介导调节nk细胞和部分效应t细胞的杀伤功能。越来越多的临床移植和动物实验证据提示，供、受者的kir不相容引发的nk细胞异源反应，有利于异基因造血干细胞移植和器官移植的预后。异源反应性nk细胞可以特异性杀伤宿主抗原呈递细胞和白血病细胞，从而降低移植物抗宿主病(graft
‑
versus
‑
host disease，gvhd)发生的风险，减轻排斥反应，起到移植物抗白血病效果。此外，kir还与众多疾病具有相关性，包括自身免疫病、病毒感染疾病、肿瘤、妊娠相关疾病等。
3.kir基因位于染色体19q13.4，具有高度多态性，目前已检测出14个kir功能基因和2个假基因。截止2019年12月，已发现1110个等位基因。杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir2ds3基因是kir基因家族中的一员，共有9个外显子，其中，第3外显子为假外显子。
4.随着移植免疫研究的深入，hla半相合移植的方案得到推广，如何在众多的供者中抉择出最优的供者成为临床专家面临的难题。在此形势下，kir基因分型得到越来越多临床专家的重视，检测技术的不断发展也使得高分辨分型成为趋势。kir分型方法包括序列特异性引物pcr(pcr
‑
ssp)、逆转录pcr(rt
‑
pcr)和pcr
‑
序列特异性寡聚核苷酸探针(pcr
‑
sso)等方法。但是，上述多种检测方法无法实现对kir2ds3基因的高分辨分型。
5.上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提出一种kir2ds3基因分型试剂盒，旨在实现对kir2ds3基因的高分辨分型。
7.为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种kir2ds3基因分型试剂盒，包括：
8.扩增引物一，核苷酸序列如seq id no.1所示；
9.扩增引物二，核苷酸序列如seq id no.2所示；
10.扩增引物三，核苷酸序列如seq id no.3所示；
11.扩增引物四，核苷酸序列如seq id no.4所示；
12.扩增引物五，核苷酸序列如seq id no.5所示；
13.扩增引物六，核苷酸序列如seq id no.6所示；
14.测序引物一，核苷酸序列如seq id no.7所示；
15.测序引物二，核苷酸序列如seq id no.8所示；
16.测序引物三，核苷酸序列如seq id no.9所示；
17.测序引物四，核苷酸序列如seq id no.10所示；
18.测序引物五，核苷酸序列如seq id no.11所示；
19.测序引物六，核苷酸序列如seq id no.12所示；
20.测序引物七，核苷酸序列如seq id no.13所示；
21.测序引物八，核苷酸序列如seq id no.14所示；
22.测序引物九，核苷酸序列如seq id no.15所示；
23.测序引物十，核苷酸序列如seq id no.16所示；
24.测序引物十一，核苷酸序列如seq id no.17所示；
25.测序引物十二，核苷酸序列如seq id no.18所示；
26.测序引物十三，核苷酸序列如seq id no.19所示；以及
27.测序引物十四，核苷酸序列如seq id no.20所示。
28.第二方面，本发明提出一种kir2ds3基因分型方法，包括以下步骤：
29.(1)获得待测样品的基因组dna；
30.(2)利用扩增引物一、扩增引物二、扩增引物三、扩增引物四、扩增引物五和扩增引物六，分别以所述基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得相应的扩增产物；
31.(3)利用测序引物一、测序引物二、测序引物三、测序引物四、测序引物五、测序引物六、测序引物七、测序引物八、测序引物九、测序引物十、测序引物十一、测序引物十二、测序引物十三以及测序引物十四，分别对相应的所述扩增产物进行扩增，获得相应的测序扩增产物；
32.(4)对所述测序扩增产物测序，分析核苷酸序列中的snp位点信息，将所述snp位点信息与公共数据库比对，获得kir2ds3的基因分型；
33.其中，所述扩增引物一的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述扩增引物二的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述扩增引物三的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述扩增引物四的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述扩增引物五的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述扩增引物六的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述测序引物一的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述测序引物二的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述测序引物三的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述测序引物四的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述测序引物五的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述测序引物六的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述测序引物七的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述测序引物八的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述测序引物九的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述测序引物十的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述测序引物十一的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述测序引物十二的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述测序引物十三的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述测序引物十四的核苷酸序列如seq id no.20所示。
34.本发明kir2ds3基因分型试剂盒包括扩增引物一、扩增引物二、扩增引物三、扩增引物四、扩增引物五、扩增引物六、测序引物一、测序引物二、测序引物三、测序引物四、测序引物五、测序引物六、测序引物七、测序引物八、测序引物九、测序引物十、测序引物十一、测序引物十二、测序引物十三以及测序引物十四；通过多种扩增引物对kir2ds3基因进行pcr扩增，多种测序引物对扩增的pcr产物进行测序扩增，进而对测序扩增产物进行测序，发现
其他方法不易鉴定的新等位基因型，实现对kir2ds3基因的高分辨分型。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
36.图1为实施例一pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
37.图2为实施例一样本
②
第13794位snp比对结果图。
38.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
39.需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案，或b方案，或a和b同时满足的方案。
40.本发明提出一种kir2ds3基因分型试剂盒。
41.请参阅表1和表2，本发明提出的kir2ds3基因分型试剂盒包括扩增引物一、扩增引物二、扩增引物三、扩增引物四、扩增引物五、扩增引物六、测序引物一、测序引物二、测序引物三、测序引物四、测序引物五、测序引物六、测序引物七、测序引物八、测序引物九、测序引物十、测序引物十一、测序引物十二、测序引物十三以及测序引物十四；其中，所述扩增引物一的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述扩增引物二的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述扩增引物三的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述扩增引物四的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述扩增引物五的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述扩增引物六的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述测序引物一的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述测序引物二的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述测序引物三的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述测序引物四的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述测序引物五的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述测序引物六的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述测序引物七的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述测序引物八的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述测序引物九的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述测序引物十的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述测序引物十一的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述测序引物十二的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述测序引物十三的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述测序引物十四的核苷酸序列如seq id no.20所示。
42.请参阅表1，所述扩增引物一为扩增上游引物，所述扩增引物二为扩增下游引物，所述扩增引物一和所述扩增引物二特异性地扩增kir2ds3基因的5’端utr区、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子(假外显子)、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子和部分第5内含子的序列，此序列命名为p1；所述扩增引物三为扩增上游引物，所述扩增引物四为扩增下游引物，所述扩增引物三和所述扩增引物四特异性地扩增
kir2ds3基因的部分第5内含子、第6外显子和部分第6内含子的序列，此序列命名为p2；所述扩增引物五为扩增上游引物，所述扩增引物六为扩增下游引物，所述扩增引物五和所述扩增引物六特异性地扩增kir2ds3基因的部分第6内含子、第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子和部分3’端utr区的序列，此序列命名为p3。
43.选取从kir公共数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/)获取的2ds3*0010301基因作为对照基因，比对上述各引物在基因组中的位置。所述对照基因的总长度覆盖了kir2ds3基因的5’端utr区至3’端utr区，共15103bp。
44.表1 pcr扩增引物信息
[0045][0046]
所述测序引物一、所述测序引物二、所述测序引物三、所述测序引物四、所述测序引物五、所述测序引物六、所述测序引物七、所述测序引物八、所述测序引物九、所述测序引物十、所述测序引物十一、所述测序引物十二、所述测序引物十三和所述测序引物十四，对纯化后的pcr扩增产物进行测序扩增。
[0047]
请参阅表2，所述测序引物一为扩增上游引物，所述测序引物二为扩增下游引物，所述测序引物一和所述测序引物二对p1中的第1外显子序列进行测序扩增；所述测序引物三为扩增上游引物，所述测序引物四为扩增下游引物，所述测序引物三和所述测序引物四对p1中的第2外显子序列进行测序扩增；所述测序引物五为扩增上游引物，所述测序引物六为扩增下游引物，所述测序引物五和所述测序引物六对p1中的第4外显子序列进行测序扩增；所述测序引物七为扩增上游引物，所述测序引物八为扩增下游引物，所述测序引物七和所述测序引物八对p1中的第5外显子序列进行测序扩增；所述测序引物九为扩增上游引物，所述测序引物十为扩增下游引物，所述测序引物九和所述测序引物十对p2中的第6外显子序列进行测序扩增；所述测序引物十一为扩增上游引物，所述测序引物十二为扩增下游引物，所述测序引物十一和所述测序引物十二对p3中的第7外显子进行测序扩增；所述测序引
物十三为扩增上游引物，所述测序引物十四为扩增下游引物，所述测序引物十三和所述测序引物十四对p3中的第8外显子和第9外显子进行测序扩增。
[0048]
因为kir2ds3基因的第3外显子为假外显子，所以本发明没有针对第3外显子来设计测序引物进行测序扩增。
[0049]
表2测序引物信息
[0050]
[0051][0052]
本发明还提出一种kir2ds3基因分型方法，包括以下步骤：
[0053]
(1)获得待测样品的基因组dna；(2)利用扩增引物一、扩增引物二、扩增引物三、扩增引物四、扩增引物五和扩增引物六，分别以所述基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得相应的扩增产物；(3)利用测序引物一、测序引物二、测序引物三、测序引物四、测序引物五、测序引物六、测序引物七、测序引物八、测序引物九、测序引物十、测序引物十一、测序引物十二、测序引物十三以及测序引物十四，分别对相应的所述扩增产物进行扩增，获得相应的测序扩增产物；(4)对所述测序扩增产物测序，分析核苷酸序列中的snp位点信息，将所述snp位点信息与公共数据库比对，获得kir2ds3的基因分型；其中，所述扩增引物一的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述扩增引物二的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述扩增引物三的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述扩增引物四的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述扩增引物五的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述扩增引物六的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述测序引物一的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述测序引物二的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述测序引物三的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述测序引物四的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述测序引物五的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述测序引物六的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述测序引物七的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述测序引物八的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述测序引物九的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述测序引物十的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述测序引物十一的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述测序引物十二的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述测序引物十三的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述测序引物十四的核苷酸序列如seq id no.20所示。
[0054]
具体方法步骤如下：
[0055]
1)pcr扩增
[0056]
扩增引物信息请参阅表1，反应体系请参阅表3，反应条件请参阅表4。
[0057]
表3 pcr反应体系
[0058]
试剂体积基因组dna(30～200ng/μl)3.0μlvazyme lamp(5u/μl)0.3μlvazyme 5
×
enhancer5.0μl10
×
pcr buffer2.5μldntp(2.5mm)2.0μl
上游引物(10μm)1.0μl下游引物(10μm)1.0μlddh2o补至总体积为25.0μl
[0059]
表4 pcr反应程序
[0060][0061]
2)pcr产物纯化
[0062]
pcr扩增完成后，对扩增产物进行纯化，避免pcr反应试剂对后续测序反应产生干扰。扩增产物纯化的反应体系请参阅表5，纯化条件请参阅表6。
[0063]
表5扩增产物纯化体系
[0064][0065][0066]
表6扩增产物纯化条件
[0067]
步骤温度时间137℃90min280℃15min
[0068]
3)测序扩增
[0069]
对纯化后的扩增产物进行测序扩增。测序扩增引物的信息请参阅表2，反应体系请参阅表7，反应条件请参阅表8。
[0070]
表7测序扩增反应体系
[0071]
试剂体积bigdye terminator v3.10.5μl5
×
bigdye sequencing buffer0.75μl测序引物(3.2μm)1.0μl纯化后的pcr扩增产物1.5μlddh2o加至总体积为5.0μl
[0072]
表8测序扩增反应程序
[0073][0074]
4)测序扩增产物纯化
[0075]
测序扩增反应完成后，对测序扩增产物进行纯化，以免测序扩增试剂干扰测序过程，步骤如下：
[0076]
a)将无水乙醇与ddh2o混合，配制85％乙醇和70％乙醇；
[0077]
b)测序反应板离心后，每个反应孔分别加入edta溶液2μl，85％乙醇40μl，盖上硅胶垫，充分震荡3min，4℃、3,000
×
g离心30min；
[0078]
c)离心结束后取出测序反应板，在离心吊篮中平铺足够厚度的吸水纸，轻轻揭开测序反应板的硅胶垫，将测序反应板倒置于吸水纸上，一同离心至离心力达到185
×
g时立即停止；
[0079]
d)每孔加入70％乙醇50μl，盖上硅胶垫，充分震荡2min，4℃、3,000
×
g离心15min；
[0080]
e)重复c步骤；
[0081]
f)测序反应板避光晾干20min，每孔加入10μl超纯甲酰胺，盖上硅胶垫，瞬时离心后在pcr仪中96℃条件下反应2min；
[0082]
g)使用abi3730xl测序仪对纯化后的测序反应产物进行测序；
[0083]
h)使用snapgene软件(https://www.snapgene.com)，将测序仪产生的测序序列文件与2ds3*0010301参考序列进行比对，生成对应的snp及其位置信息，通过与kir公共数据库比对，获得kir2ds3基因的高分辨型别。
[0084]
本发明kir2ds3基因分型试剂盒包括扩增引物一、扩增引物二、扩增引物三、扩增引物四、扩增引物五、扩增引物六、测序引物一、测序引物二、测序引物三、测序引物四、测序引物五、测序引物六、测序引物七、测序引物八、测序引物九、测序引物十、测序引物十一、测序引物十二、测序引物十三以及测序引物十四；通过多种扩增引物对kir2ds3基因进行pcr扩增，多种测序引物对扩增的pcr产物进行测序扩增，进而对测序扩增产物进行测序，发现其他方法不易鉴定的新等位基因型，实现对kir2ds3基因的高分辨分型。
[0085]
实施例一
[0086]
随机选择两例进行过kir2ds3基因低分辨分型的阳性样本，采用本发明试剂盒和分型方法对该样本进行kir2ds3基因分型，以验证本发明的分型效果。提取所述样本的基因组dna，对所述基因组dna进行pcr扩增。pcr扩增的结果请参阅图1。图1中，琼脂糖凝胶电泳图的条带由左往右依次为dl15000 dna marker、样本
①
的p1序列、样本
②
的p1序列、样本
①
的p2序列、样本
②
的p2序列、样本
①
的p3序列和样本
②
的p3序列。p1的序列长度为6388bp，p2的序列长度为1543bp，p3的序列长度为3495bp，图中的结果与实际相符，表明已成功扩增出上述序列。
[0087]
对纯化后的测序扩增产物进行测序，得到14个测序峰图。分别将14个测序峰图导入snapgene软件，使用snapgene软件的“align with a sequence trace”功能，与2ds3*
0010301的序列进行比对。
[0088]
比对结果显示，样本
①
相对于2ds3*0010301参考序列未发现snp，即在第1、第2、第4、第5、第6、第7、第8和第9外显子的序列与参考序列2ds3*0010301完全相同。
[0089]
请参阅图2，比对结果显示，样本
②
相对于2ds3*0010301参考序列共有1个snp，位于第7外显子第13794位，样本
②
在此位点的碱基为a(黑框标出)，2ds3*0010301参考序列在此位点的碱基为g。样本
②
在第1、第2、第4、第5、第6、第8和第9外显子的序列与2ds3*0010301完全一致，未发现其他snp。
[0090]
本实施例样本
①
比对得到的snp结果与参考序列一致，因此，样本
①
kir2ds3高分辨分型结果为2ds3*00103纯合子。查询kir公共数据库发现，样本
②
比对得到的snp结果与2ds3*00201一致，样本
②
kir2ds3高分辨分型结果为2ds3*00201纯合子。以上结果说明本发明试剂盒和分型方法可以实现kir2ds3的高分辨分型。
[0091]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。