用于检测调节性t细胞的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫学技术领域，涉及一种用于检测调节性T细胞的试剂盒。
【背景技术】
[0002]调节性T细胞(Regulatory cell,简称Treg)是在机体免疫系统中发挥负向调节作用的细胞，它既能抑制不恰当的免疫反应，又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间，对效应细胞的增殖、免疫活性的发挥起抑制作用。到目前为止已经发现了多种表型的Treg存在，其中⑶4+Treg的研宄最为广泛。⑶4+⑶25+Treg不仅具有免疫抑制的功能，而且抑制作用可过继转移。同时，去除⑶4+⑶25+Treg还能激发有效的肿瘤免疫反应。
[0003]天然⑶4+⑶25+Treg在正常人外周血中占总⑶4+T细胞的5%?10%，它构成性表达CD25、CD122、CTLA-4、GITR、CD103、CD62L等。但是，这些分子同样在活化的CD4+效应T细胞也有表达，所以它们都不是天然⑶4+⑶25+Treg的特异性标志。人⑶4+⑶25+T细胞上的CD25表达数量和荧光强度呈连续性表达状态，这种连续性表达使得采用CD4/CD25分子确定Treg细胞比例很困难。
[0004]研宄者们常常采用⑶25磁珠和流式细胞术体外分选的方法来纯化⑶4+⑶25+Treg，但不同研宄组报道的Treg所占比例差异很大。原因在于尽管采用限制性分离CD25高表达的细胞群，仍不能除外含有活化的CD4+CD25+效应T细胞，而且限制性分离CD25高表达的细胞群易导致Treg的丢失，因此需要更特异的表面标记和更好的检测手段来分选Treg。
[0005]有研宄者用CD4+CD25int/highCD1271ow来标记Treg，但是通过抗体的荧光强度的不同来标记细胞群容易受到仪器状态、个人主观印象的影响，不够客观，并且特异性不强。
【实用新型内容】
[0006]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测调节性T细胞的试剂盒，可以快速准确地检测调节性T细胞在外周血中的比例，大大提高检测的特异性。
[0007]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:一种用于检测调节性T细胞的试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，有荧光标记的单克隆抗体CD3的试剂管(4)、装有荧光标记的单克隆抗体CD4的试剂管
(5)、装有荧光标记的单克隆抗体CD25的试剂管(6)、装有荧光标记的单克隆抗体FoxP3的试剂管(7)、装有红细胞裂解液的试剂管(8)、装有PBS缓冲液的试剂管(9)、装有打孔固定液的试剂管(10)和装有破膜缓冲液的试剂管(11)被设置在所述小孔内。
[0008]其中，上述单克隆抗体使用不同的焚光标记；优选地，⑶3单克隆抗体使用Percp标记，⑶4单克隆抗体使用FITC标记，⑶25单克隆抗体使用APC标记，FoxP3单克隆抗体使用PE标记。
[0009]其中，所述红细胞裂解液、PBS缓冲液、打孔固定液和破膜缓冲液均为本领域常规试剂。
[0010]其中，所述衬垫(3)上设有8个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
[0011]通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下:
[0012](I)本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染；
[0013](2)由于FoxP3特异性地表达在CD4+CD25+Treg中，本申请的技术方案将FoxP3作为Treg的一个特异标志，使用⑶4+⑶25+FoxP3+标记Treg细胞，检测的特异性更强；
[0014](2)本实用新型的试剂盒在使用时，对实验室条件要求不高，只要有流式细胞仪的实验室即可开展检测，便于技术广泛推广，检测操作时间短、检测精度高，上机操作和数据分析方法简单，可以在第一时间得到临床所需资料。
【附图说明】
[0015]图1为本实用新型的结构示意图；
[0016]图2为采用本实用新型的试剂盒检测某患者的调节性T细胞的结果示意图。
[0017]图中，1-盒体，2-盒盖，3-衬垫，4-装有荧光标记的单克隆抗体⑶3的试剂管，5-装有荧光标记的单克隆抗体CD4的试剂管，6-装有荧光标记的单克隆抗体CD25的试剂管，7-装有荧光标记的单克隆抗体FoxP3的试剂管，8-装有红细胞裂解液的试剂管，9-装有PBS缓冲液的试剂管，10-装有打孔固定液的试剂管，11-装有破膜缓冲液的试剂管。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本实用新型的【具体实施方式】作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。
[0019]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]实施例用于检测调节性T细胞的试剂盒及其使用方法
[0022]如图1所示，本实用新型提供了一种用于检测调节性T细胞，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体I内的衬垫3，所述衬垫3上设有8个小孔，所述小孔在所述衬垫3上分成两排平行排列，装有荧光标记的单克隆抗体CD3的试剂管4，装有荧光标记的单克隆抗体CD4的试剂管5，装有荧光标记的单克隆抗体CD25的试剂管6、装有荧光标记的单克隆抗体FoxP3的试剂管7、装有红细胞裂解液的试剂管8、装有PBS缓冲液的试剂管9、装有打孔固定液的试剂管10和装有破膜缓冲液的试剂管11被设置在所述小孔内。
[0023]其中，⑶3单克隆抗体使用Percp标记，⑶4单克隆抗体使用FITC标记，⑶25单克隆抗体使用APC标记，FoxP3单克隆抗体使用PE标记。
[0024]其中，所述红细胞裂解液、PBS缓冲液、打孔固定液和破膜缓冲液均为本领域常规试剂。红细胞裂解液购买自美国BD公司，PBS缓冲液购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，打孔固定液购买自eB1science公司，破膜缓冲液为购买自eB1science公司的Permeabilizat1n Buffer。
[0025]检测步骤如下:
[0026](I)取一支流式专用管，向管中加入 CD3-PerCP 20 μ 1、CD4-FITC 20 μ 1、CD25-APC 5 μ I；
[0027](2)对待检测的外周血标本进行白细胞计数，将细胞浓度调至5X106/ml，向管内加入待检测的外周血标本70 μ 1，低速涡旋混匀，2°C至8°C避光孵育20分钟；
[0028](3)向管内加入红细胞裂解液1ml，低速涡旋混匀，在2°C至8°C避光裂解红细胞10分钟；
[0029](4)裂解结束后立即以1500转/分钟离心5分钟，离心结束后弃上清，然后向管内加入Iml PBS缓冲液，低速涡旋混匀，以1500转/分钟离心5分钟；离心结束后弃上清；
[0030](5)加入IX打孔固定液1ml，4°C避光打孔固定30分钟；
[0031](6)打孔固定结束后向管内加入Iml破膜缓冲液，振荡混匀后以1500转/分钟离心5分钟，弃上清，并重复该操作I次；
[0032](7)加入FoxP3_PE抗体20 μ I，室温避光孵育40分钟；
[0033](8)孵育结束后向管内加入Iml破膜缓冲液，以1500转/分钟离心5分钟；离心结束后弃上清；
[0034](9)向各管内加入0.5ml PBS缓冲液重悬，低速涡旋混匀，24h内使用流式细胞仪上机检测；
[0035](10)在检测时，调节好个通道电压，收集细胞10万个，分析数据。
[0036]结果分析:数据如图2，以散点图形式显示，取⑶3+⑶4+⑶25+FoxP3+细胞占CD3+⑶4+细胞的比例。
【主权项】
1.一种用于检测调节性T细胞的试剂盒，其特征在于:包括盒体(1)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，有荧光标记的单克隆抗体CD3的试剂管(4)、装有荧光标记的单克隆抗体CD4的试剂管(5)、装有荧光标记的单克隆抗体CD25的试剂管出)、装有荧光标记的单克隆抗体FoxP3的试剂管(7)、装有红细胞裂解液的试剂管(8)、装有PBS缓冲液的试剂管(9)、装有打孔固定液的试剂管(10)和装有破膜缓冲液的试剂管(11)被设置在所述小孔内。2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体使用不同的荧光标记，其中，CD3单克隆抗体使用Percp标记，CD4单克隆抗体使用FITC标记，CD25单克隆抗体使用APC标记，FoxP3单克隆抗体使用PE标记。3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述衬垫(3)上设有8个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于检测调节性T细胞的试剂盒，其特征在于：包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，有荧光标记的单克隆抗体CD3的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体CD4的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体CD25的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体FoxP3的试剂管、装有红细胞裂解液的试剂管、装有PBS缓冲液的试剂管、装有打孔固定液的试剂管和装有破膜缓冲液的试剂管被设置在所述小孔内。本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染，在检测时检测的特异性更强。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN204649750
【申请号】CN201520364068
【发明人】刘丽媛, 秦晓明, 吴纯斌, 王显凤, 王绪华, 梁超, 陈忠, 方国伟, 黄士昂
【申请人】北京海思特临床检验所有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月29日