一种零背景载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种零背景载体及其制备方法和应用。
背景技术：
：目前，蓝白斑筛选是最常用的区分空载体和阳性克隆载体的方案，该方案中，报告基因laczα是蓝白斑筛选的标记基因。然而，基于蓝白斑筛选的载体在克隆时存在以下问题：(1)强启动子启动大量外源基因的转录、翻译，导致一些结构复杂的外源基因的转录或翻译产物对宿主有毒性；(2)载体在酶切时残留的限制性内切酶的外切酶活性、酶切载体的反复冻融以及线性化载体的长期保存等因素，使制备的载体在酶切位点缺失1～2个碱基，导致laczα基因移码突变，使不含外源基因的克隆显白色，产生大量假阳性克隆；(3)当插入的外源性dna片段较小、未能改变laczα基因的读码框时，有可能造成平板都是蓝斑的假阴性现象；(4)当载体在平末端克隆大于2kb的外源dna片段时，白斑较少，增加了挑选阳性克隆的难度。cn108118059a公开了一种改进的启动子及其组成的载体和应用，很好地解决了上述问题，克隆载体在进行克隆时需要使用含iptg的平板，不含插入序列的空载体在iptg的诱导下表达大量对大肠杆菌有毒性的ccdb，导致菌体无法生长形成菌落，因此平板上长出的菌落都是含有插入序列的阳性克隆，该技术方案显著简化了分子克隆的步骤，但是iptg价格昂贵且有毒性，生产成本高、对实验人员有潜在的危害。毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxinsystem，ta系统)普遍存在于细菌的质粒和染色体上，通过表达两种蛋白质从而保证质粒传代的稳定性，一种是稳定的毒性蛋白，另一种是解除毒性蛋白毒性的解毒蛋白，相比于毒性蛋白，解毒蛋白半衰期短，两种蛋白的基因形成一个短的操纵子，它们的表达量是自动调控的。ta系统通过杀死不含质粒的子代细胞，从而保持遗传元件在持续增殖细菌群体中的稳定性。含有ta系统的细菌在丢失质粒后，解毒蛋白由于半衰期短被很快降解，毒性蛋白被释放出来最终导致细胞死亡。随着研究的深入，越来越多的ta系统被发现，例如ccd、parde、phd/doc、kis/kid、pemi/k、pasabc、hig、ωεζ和yefm/yoeb等。ta系统的功能目前尚未清楚阐明，一种假说认为染色体ta系统通过下调基因的复制和翻译，调节dna和蛋白的合成效率，帮助细菌解决营养压力的问题；另一种假说认为当一个种群的ta系统通过牺牲群体中其它种群而使自身获益时，ta系统可能诱导程序性死亡。此外，ta系统是促进细菌持续性产生抗生素抗性和毒力的主要因素。因此，ta系统可能在未来成为独特的抗菌靶点。大肠杆菌f质粒的ccd系统(controlcelldeath)是第一个被发现的ta系统。ccd操纵子同时表达不稳定的解毒蛋白ccda(72个氨基酸)和稳定的毒性蛋白ccdb(101个氨基酸)，其中，ccda是一种双功能酶，主要功能是中和毒性和自我抑制。在正常的生长条件下，ccda与ccdb形成紧密的ccda2-(ccdb2)2复合体，从而抑制ccdb的毒性；当细菌失去质粒后，不稳定的ccda很快被降解，稳定的ccdb暴露于细胞质基质，捕获大肠杆菌的拓扑异构酶ⅱ(旋转酶)并破坏其活性，导致细胞发生不可恢复的dna损伤，最终造成细胞死亡。ccd系统利用ccda2-(ccdb2)2复合体与操纵子的操纵基因-启动子区域相结合，从而在转录水平进行负性自我调控。当大肠杆菌的拓扑异构酶ⅱ(旋转酶)a亚基的462精氨酸(arg)突变为半胱氨酸(cys)后，ccdb不会对大肠杆菌产生毒害作用，该突变称为gyra462，db3.1大肠杆菌由于含有gyra462突变因此能够表达ccdb。然而目前ta系统鲜有应用于基因克隆。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种零背景载体及其制备方法和应用，所述零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，在不依赖于iptg诱导的条件下即可筛选出包含外源基因的阳性克隆。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种零背景载体，所述零背景载体包括毒性基因表达元件和抗毒性基因表达元件；所述毒性基因表达元件包括毒性基因及所述毒性基因的启动子；所述抗毒性基因表达元件包括抗毒性基因及所述抗毒性基因的启动子；所述毒性基因的启动子含有限制性内切酶酶切位点。本发明中，零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，在不含有外源基因的条件下，毒素的表达量高于抗毒素的表达量，表达的抗毒素不能抑制毒素的毒性，包含零背景载体的重组细胞不能形成克隆；当外源基因插入毒性基因启动子的限制性内切酶酶切位点后，毒性基因的启动子活性显著降低，毒素的表达量也显著降低，表达的抗毒素抑制了毒素的毒性，包含零背景载体的重组细胞形成克隆，基于此原理可以快速筛选得到含有外源基因的阳性克隆，不仅解决了蓝白斑筛选的固有缺陷，而且不依赖于iptg诱导，显著简化了基因克隆步骤，具有重要的应用前景。优选地，所述毒性基因包括ccdb编码基因，所述抗毒性基因包括ccda编码基因。优选地，所述限制性内切酶包括ecorv、afei、pmli、afei、nrui、psii、scai、smai、sspi或stui中的任意一种，优选为ecorv，ccdb编码基因的启动子中包含限制性内切酶酶切位点，例如可以是gatatc(ecorv酶切位点)。优选地，所述ccda编码基因的启动子为组成型启动子，能够启动ccda编码基因的转录和翻译，表达的ccda的表达量低于未插入外源基因状态下ccdb的表达量。优选地，所述ccda编码基因的启动子包括seqidno:5、seqidno:10或seqidno:16所示的核酸序列，表达的ccda的表达量低于未插入外源基因状态下ccdb的表达量，含有这三种启动子的零背景载体导入宿主细胞后，不能形成克隆，sanger测序频数为0。优选地，所述零背景载体在ccdb表达元件的上游和下游还包括原核转录终止子，有效抑制了毒性基因和抗毒性基因启动子造成的通读(read-through)现象。优选地，所述零背景载体还包括抗生素抗性基因，优选为卡那霉素抗性基因。优选地，所述零背景载体还包括复制子。优选地，所述零背景载体包括seqidno:20所示的核酸序列，其中，n(18)含有限制性内切酶酶切位点，用于平末端连接外源基因，n(x)为ccda编码基因的启动子；seqidno:20：ctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgagtaatcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttattggcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgcagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaattatattccccagaacatcaggttaatggcgtttttgatgtcattttcgcggtggctgagatcagccacttcttccccgataacggacaccggcacactggccatatcggtcgtcatcatgcgccagctttcatccccgatatgcaccaccgggtaaagttcacgggagactttatctgacagcagacgtgcactggccagaggaataaccatccgtcgcccgggcgtgtcaataatatcactctgtacatccacaaacagacgataacggctctctcttttataggtgtaaaccttaaactgcatacgcgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatan(18)tgtaaagcctggcgcgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgctaatagtcaaaagcctccggtcggaggcttttgactttctgcgcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagttccctactctcgcatggggagaccccacactaccatcggcgctacggcgtttcacttctgagttcggcatggggtcaggtgggaccaccgcgctactgccgccaggcan(x)aggatacttccaatccatggcaacaaaacaaaaagtagaggaggtaaatatgaagcagcgcattacagtcaccgtcgacagtgacagctatcagttgctcaaggcatatgatgtcaatatctccgggctggtaagcaccaccctgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggcaggcagaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgccgacgagaacagggactggtgacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggccctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggaga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agattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgaggcgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。优选地，所述零背景载体包括零背景t载体，所述零背景t载体的双脱氧胸腺嘧啶核苷酸添加在零背景载体经限制性内切酶处理后获得的线性化载体的3’端，可以实现基于t-a克隆的外源基因连接。第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的零背景载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)构建缺失了ccda编码基因的启动子的载体；(2)以缺失了ccda编码基因的启动子的载体为模板，利用pcr获得引入ccda编码基因的启动子的dna片段；(3)将引入ccda编码基因的启动子的dna片段连接成环，获得所述零背景载体。优选地，所述方法还包括对步骤(3)获得的零背景载体进行限制性内切酶处理为线性化载体，在3’端添加双脱氧胸腺嘧啶核苷酸的步骤。优选地，步骤(1)所述缺失了ccda编码基因的启动子的载体包括seqidno:24所示的核酸序列；seqidno:24：ctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgagtaatcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttattggcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgcagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaattatattccccagaacatcaggttaatggcgtttttgatgtcattttcgcggtggctgagatcagccacttcttccccgataacggacaccggcacactggccatatcggtcgtcatcatgcgccagctttcatccccgatatgcaccaccgggtaaagttcacgggagactttatctgacagcagacgtgcactggccagaggaataaccatccgtcgcccgggcgtgtcaataatatcactctgtacatccacaaacagacgataacggctctctcttttataggtgtaaaccttaaactgcatacgcgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagatatcagcataaagtgtaaagcctggcgcgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgctaatagtcaaaagcctccggtcggaggcttttgactttctgcgcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagttccctactctcgcatggggagaccccacactaccatcggcgctacggcgtttcacttctgagttcggcatggggtcaggtgggaccaccgcgctactgccgccaggcaaggatacttccaatccatggcaacaaaacaaaaagtagaggaggtaaatatgaagcagcgcattacagtcaccgtcgacagtgacagctatcagttgctcaaggcatatgatgtcaatatctccgggctggtaagcaccaccctgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggcaggcagaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgccgacgagaacagggactggtgacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggccctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgaggcgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。优选地，步骤(2)所述pcr扩增的引物包括seqidno:25～seqidno:62所示的核酸序列。第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为含有外源基因的第一方面所述的零背景载体，所述外源基因连接于零背景载体的ccdb编码基因的启动子限制性内切酶酶切位点处。第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括第三方面所述的重组载体。第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的零背景载体。优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶、pcr试剂或连接试剂中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明构建的零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，当未插入外源基因时，抗毒素不足以抑制毒素的毒性，使得重组细胞不能形成克隆，当插入外源基因后，毒素表达量降低，抗毒素抑制毒素的毒性，使得重组细胞形成克隆；(2)本发明基于零背景载体实现了不依赖于蓝白斑、不依赖于iptg诱导的基因克隆，显著简化了阳性克隆的筛选过程、避免了假阴性或假阳性结果，并降低了生产成本和生物危害性，在基因克隆领域具有重要意义。附图说明图1a为转化puc57-kan质粒的top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况，图1b转化puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒的top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况，图1c转化puc57-ccdb-ccda-promoter-5质粒的top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况，图1d转化puc57-ccdb-ccda-promoter-10质粒的top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况，图1e转化puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒的top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况；图2为在lacz启动子插入外源dna序列后，转化puc57-ccdb-ccda-pro-minus、puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16的top10感受态细胞在卡那霉素抗性平板中的生长情况；图3为在lacz启动子插入外源dna序列后，转化puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16的top10阳性克隆的菌落pcr的电泳结果；图4为在lacz启动子插入外源dna序列后，转化puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16的dh5α、stbl3、gt115、epi400阳性克隆的菌落pcr的电泳结果；图5为在lacz启动子插入外源dna序列后，转化puc57-ccdb-ccda-promoter-5t、puc57-ccdb-ccda-promoter-10t、puc57-ccdb-ccda-promoter-16t的top10阳性克隆的菌落pcr的电泳结果。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1质粒构建本实施例构建含有不同ccda启动子的质粒，包括以下步骤：(1)委托苏州金唯智生物科技有限公司合成puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒(seqidno:24)；(2)以puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒为模板，分别以seqidno:25+seqidno:26、seqidno:27+seqidno:28、seqidno:29+seqidno:30、seqidno:31+seqidno:32、seqidno:33+seqidno:34、seqidno:35+seqidno:36、seqidno:37+seqidno:38、seqidno:39+seqidno:40、seqidno:41+seqidno:42、seqidno:43+seqidno:44、seqidno:45+seqidno:46、seqidno:47+seqidno:48、seqidno:49+seqidno:50、seqidno:51+seqidno:52、seqidno:53+seqidno:54、seqidno:55+seqidno:56、seqidno:57+seqidno:58、seqidno:59+seqidno:60或seqidno:61+seqidno:62为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系和反应程序如表1和表2所示，引物如表3所示，得到的pcr产物引入ccda编码基因的启动子(seqidno:1～19)，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化；表1组分用量模板1μl(约70ng)正向引物(10pm)1μl反向引物(10pm)1μldntps(10mm)1μl5×pfu反应缓冲液20μlpfudna聚合酶(5u/μl)1μlh2o75μl表2表3seqidno:1(promoter1)：ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc；seqidno:2(promoter2)：ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc；seqidno:3(promoter3)：tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc；seqidno:4(promoter4)：ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc；seqidno:5(promoter5)：ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc；seqidno:6(promoter6)：tttacggctagctcagtcctaggtactatgctagc；seqidno:7(promoter7)：tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc；seqidno:8(promoter8)：tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc；seqidno:9(promoter9)：ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc；seqidno:10(promoter10)：tttacagctagctcagtcctagggactgtgctagc；seqidno:11(promoter11)：tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc；seqidno:12(promoter12)：ctgatggctagctcagtcctagggattatgctagc；seqidno:13(promoter13)：tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc；seqidno:14(promoter14)：tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc；seqidno:15(promoter15)：ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc；seqidno:16(promoter16)：ttgacagctagctcagtcctagggattgtgctagc；seqidno:17(promoter17)：ttgacggctagctcagtcctaggtattgtgctagc；seqidno:18(promoter18)：tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagt；seqidno:19(promoter19)：tttatagctagctcagccctaggtacaatgctagc。(3)将步骤(2)纯化的pcr扩增产物分别使用gibsonmastermix试剂盒进行连接反应，反应体系如表4所示，反应条件为50℃连接1h；表4(4)将步骤(3)的连接产物转化db3.1感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的lb平板、37℃培养过夜，次日挑取单克隆进行sanger测序，保留测序正确的质粒，这些质粒含有不同的组成型启动子用于调控ccda的表达，质粒分别命名为：puc57-ccdb-ccda-promoter-1(seqidno:25+seqidno:26)puc57-ccdb-ccda-promoter-2(seqidno:27+seqidno:28)puc57-ccdb-ccda-promoter-3(seqidno:29+seqidno:30)puc57-ccdb-ccda-promoter-4(seqidno:31+seqidno:32)puc57-ccdb-ccda-promoter-5(seqidno:33+seqidno:34)puc57-ccdb-ccda-promoter-6(seqidno:35+seqidno:36)puc57-ccdb-ccda-promoter-7(seqidno:37+seqidno:38)puc57-ccdb-ccda-promoter-8(seqidno:39+seqidno:40)puc57-ccdb-ccda-promoter-9(seqidno:41+seqidno:42)puc57-ccdb-ccda-promoter-10(seqidno:43+seqidno:44)puc57-ccdb-ccda-promoter-11(seqidno:45+seqidno:46)puc57-ccdb-ccda-promoter-12(seqidno:47+seqidno:48)puc57-ccdb-ccda-promoter-13(seqidno:49+seqidno:50)puc57-ccdb-ccda-promoter-14(seqidno:51+seqidno:52)puc57-ccdb-ccda-promoter-15(seqidno:53+seqidno:54)puc57-ccdb-ccda-promoter-16(seqidno:55+seqidno:56)puc57-ccdb-ccda-promoter-17(seqidno:57+seqidno:58)puc57-ccdb-ccda-promoter-18(seqidno:59+seqidno:60)puc57-ccdb-ccda-promoter-19(seqidno:61+seqidno:62)。实施例2筛选用于克隆外源dna的零背景载体(1)本实施例筛选用于克隆外源dna序列的零背景载体，步骤如下：分别吸取实施例1步骤(4)构建的19种质粒进行等摩尔数(分子数)混合，转化top10感受态细胞，涂布不含iptg的卡那霉素抗性lb平板，次日挑取94个单克隆进行sanger测序，根据测序结果统计质粒出现的频数，结果如表5所示；表5质粒名称sanger测序频数puc57-ccdb-ccda-promoter-14puc57-ccdb-ccda-promoter-27puc57-ccdb-ccda-promoter-36puc57-ccdb-ccda-promoter-46puc57-ccdb-ccda-promoter-50puc57-ccdb-ccda-promoter-67puc57-ccdb-ccda-promoter-76puc57-ccdb-ccda-promoter-85puc57-ccdb-ccda-promoter-99puc57-ccdb-ccda-promoter-100puc57-ccdb-ccda-promoter-114puc57-ccdb-ccda-promoter-122puc57-ccdb-ccda-promoter-139puc57-ccdb-ccda-promoter-143puc57-ccdb-ccda-promoter-155puc57-ccdb-ccda-promoter-160puc57-ccdb-ccda-promoter-177puc57-ccdb-ccda-promoter-188puc57-ccdb-ccda-promoter-196将sanger测序频数为0的质粒puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16以及puc57-kan、puc57-ccdb-ccda-pro-minus分别转化top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞，涂布不含iptg的卡那霉素抗性lb平板中，37℃培养过夜。次日检查发现，如图1a所示，转化puc57-kan质粒的五个平板菌落生长正常，表明top10、dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞效价正常；如图1b、图1c、图1d和图1e所示，转化puc57-ccdb-ccda-pro-minus、puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10和puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒的平板都没有菌落生长，原因在于puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒的ccda基因没有启动子，不能表达ccda，lacz启动子本底表达的ccdb使得平板没有菌落形成，puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16三个质粒对ccda的表达量很低，表达的ccda不能抑制lacz启动子本底表达的ccdb对大肠杆菌的毒性。(2)本实施例进一步利用ecorv限制性内切酶分别酶切puc57-ccdb-ccda-pro-minus、puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10和puc57-ccdb-ccda-promoter-16，反应体系如表6所示，反应条件为37℃酶切1小时；表6组分用量10×酶切缓冲液6μl质粒20μl(约3μg)ecorv3μl灭菌去离子h2o31μl使用axygen凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，nanodrop2000测定纯化的酶切产物的浓度为15ng/μl～25ng/μl；以λdna为模板，seqidno:63+seqidno:64为引物进行pcr扩增，pcr反应体系和反应程序如表7和表8所示；seqidno:63：gcaactcaaccctgtccgatttcaac；seqidno:64：tcctccagtaccgcgaactgactc；表7组分用量λdna模板1μl(约50ng)正向引物(10pm)1μl反向引物(10pm)1μldntps(10mm)1μl5×pfu反应缓冲液20μlpfudna聚合酶(5u/μl)1μlh2o75μl表8pcr扩增结束后采用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，目的片段大小约1100bp；对目的片段进行切胶回收纯化，nanodrop2000测定纯化的dna浓度约100ng/μl；按照表9配制连接反应体系，将纯化的pcr片段分别与ecorv酶切的线性化puc57-ccdb-ccda-pro-minus、puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10或puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒连接，22℃连接1h；表9连接产物分别转化top10感受态细胞，菌液涂布于不含iptg的卡那霉素抗性lb平板中，37℃培养过夜。次日检查发现，如图2所示，使用puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒作为克隆载体，平板中形成正常的单克隆，使用puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒作为克隆载体，平板中没有菌落生长。由此表明，在lacz启动子中插入外源dna序列，启动子仍然有本底表达，puc57-ccdb-ccda-pro-minus由于不含有ccda启动子而不表达ccda，本底表达的毒性ccdb造成平板中没有菌落形成；但是puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒具有ccda启动子，能够表达足以抑制启动子插入外源基因的本底毒性ccdb的ccda，因此能够在平板中形成菌落。(3)从接种puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒的平板中分别随机挑取24个单克隆进行菌落pcr，引物如seqidno:65+seqidno:66所示，结果如图3所示，不含插入序列的pcr产物大小为321bp，含有外源插入序列的pcr产物大小约1400bp，表明所有克隆均含有外源插入序列，每个平板随机抽取4个阳性克隆进行sanger测序，测序结果显示序列正确；seqidno:65：atccacaaacagacgataacggctc；seqidno:66：ggctcagtcgaaagactgggcc。(4)为了进一步验证puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒可以用于克隆大肠杆菌，本实施例将三种质粒分别转化dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞进行克隆检测；以λdna为模板、seqidno:67+seqidno:68为引物进行pcr扩增，pcr反应体系和反应程序如表7和表8所示；seqidno:67：aatccgcaggccagaatcaaag；seqidno:68：tcgacggacgtcccacattggtgac；pcr扩增结束后采用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，目的片段大小约1200bp；对目的片段进行切胶回收纯化，nanodrop2000测定纯化的dna浓度约140ng/μl；按照表10配制连接反应体系，将纯化的pcr片段分别与ecorv酶切的线性化puc57-ccdb-ccda-pro-minus、puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10或puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒连接，22℃连接1h；表10组分用量线性化质粒2μlpcr产物3μl10×酶切缓冲液2μlt4dna连接酶1μl灭菌去离子h2o12μl连接产物分别转化dh5α、stbl3、gt115、epi400感受态细胞，菌液涂布于不含iptg的卡那霉素抗性lb平板中，37℃培养过夜。次日检查发现，puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒对应的平板能够形成正常的菌落，puc57-ccdb-ccda-pro-minus质粒对应的平板没有菌落生长。从接种puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒的平板中随机挑取8个单克隆进行菌落pcr，引物如seqidno:65+seqidno:66所示，结果如图4所示，不含插入序列的pcr产物大小为321bp，含有外源插入序列的pcr产物大小约1500bp，表明所有克隆均含有外源插入序列，每个平板随机送2个阳性克隆进行sanger测序，测序结果显示序列正确。由此进一步证明，puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10、puc57-ccdb-ccda-promoter-16质粒能够作为零背景载体用于克隆外源dna片段。实施例3构建t载体进行ta克隆本实施例利用ecorv限制性内切酶分别酶切puc57-ccdb-ccda-promoter-5、puc57-ccdb-ccda-promoter-10和puc57-ccdb-ccda-promoter-16，反应体系如表11所示，反应条件为37℃酶切1小时；表11组分用量10×酶切缓冲液8μl质粒30μl(约4μg)ecorv4μl灭菌去离子h2o38μl使用axygen凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，nanodrop2000测定纯化的酶切产物的浓度为25ng/μl～40ng/μl；使用taqdna聚合酶将单个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸(ddttp)添加到线性化载体的3’端制备t载体，反应体系如表12所示，反应条件为68℃连接1h，反应结束后使用axygen试剂盒进行回收纯化得到t载体，分别命名为puc57-ccdb-ccda-promoter-5t、puc57-ccdb-ccda-promoter-10t、puc57-ccdb-ccda-promoter-16t载体；表12组分用量线性化平末端载体50μl(～2μg)10×缓冲液10μlddttp(5mm)0.5μltaqdna聚合酶(5u/μl)1μl灭菌去离子h2o38.5μl以λdna为模板、seqidno:69+seqidno:70为引物进行pcr扩增，pcr扩增反应体系和反应程序如表13和表8所示；seqidno:69：tgcgcagaaggtgtcggcatatac；seqidno:70：tcagtaacgtcagcctgcgaag；表13组分用量λdna模板1μl(约50ng)正向引物(10pm)1μl反向引物(10pm)1μldntps(10mm)1μl10×taq反应缓冲液20μltaqdna聚合酶(5u/μl)1μlh2o75μlpcr扩增结束后采用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，目的片段大小约250bp；对目的片段进行切胶回收纯化，nanodrop2000测定纯化的dna浓度约120ng/μl；按照表14配制连接反应体系，使用t4dna连接酶将纯化的pcr片段分别与puc57-ccdb-ccda-promoter-5t、puc57-ccdb-ccda-promoter-10t、puc57-ccdb-ccda-promoter-16t载体进行连接，22℃连接1小时；表14组分用量t载体1μlpcr产物3μl10×酶切缓冲液1μlt4dna连接酶1μl灭菌去离子h2o4μl连接产物分别转化top10感受态细胞，菌液涂布于不含iptg的卡那霉素抗性lb平板中，37℃培养过夜。次日，从每个平板中随机挑取8个单克隆进行菌落pcr，引物如seqidno:65+seqidno:66所示，结果如图5所示，含有外源插入序列的pcr产物大小约600bp，表明所有克隆均含有外源插入序列，每个平板随机送2个阳性克隆进行sanger测序，测序结果显示序列正确。综上所述，本发明的零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，基于所述零背景载体的基因克隆方法不依赖于iptg诱导即可筛选得到含有外源基因的阳性克隆，简单高效、成本低、安全性高、准确性好。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>苏州金唯智生物科技有限公司<120>一种零背景载体及其制备方法和应用<130>20210305<160>70<170>patentinversion3.3<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列<400>1ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc35<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列<400>2ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc35<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列<400>3tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc35<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<400>4ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc35<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<400>5ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc35<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<400>6tttacggctagctcagtcctaggtactatgctagc35<210>7<211>35<212>dna<213>人工序列<400>7tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc35<210>8<211>35<212>dna<213>人工序列<400>8tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc35<210>9<211>35<212>dna<213>人工序列<400>9ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc35<210>10<211>35<212>dna<213>人工序列<400>10tttacagctagctcagtcctagggactgtgctagc35<210>11<211>35<212>dna<213>人工序列<400>11tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc35<210>12<211>35<212>dna<213>人工序列<400>12ctgatggctagctcagtcctagggattatgctagc35<210>13<211>35<212>dna<213>人工序列<400>13tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc35<210>14<211>35<212>dna<213>人工序列<400>14tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc35<210>15<211>35<212>dna<213>人工序列<400>15ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc35<210>16<211>35<212>dna<213>人工序列<400>16ttgacagctagctcagtcctagggattgtgctagc35<210>17<211>35<212>dna<213>人工序列<400>17ttgacggctagctcagtcctaggtattgtgctagc35<210>18<211>35<212>dna<213>人工序列<400>18tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagt35<210>19<211>35<212>dna<213>人工序列<400>19tttatagctagctcagccctaggtacaatgctagc35<210>20<211>3344<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(714)..(731)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(1062)..(1062)<223>nisa,c,g,ort<400>20ctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactag60cataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaacta120tatccggatgaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgagtaatcacactg180gctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttattggcgcgtttcggtgatgacggtgaaaa240cctctgacacatgcagctcccgcagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggag300cagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaatta360tattccccagaacatcaggttaatggcgtttttgatgtcattttcgcggtggctgagatc420agccacttcttccccgataacggacaccggcacactggccatatcggtcgtcatcatgcg480ccagctttcatccccgatatgcaccaccgggtaaagttcacgggagactttatctgacag540cagacgtgcactggccagaggaataaccatccgtcgcccgggcgtgtcaataatatcact600ctgtacatccacaaacagacgataacggctctctcttttataggtgtaaaccttaaactg660catacgcgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatannnnnnn720nnnnnnnnnnntgtaaagcctggcgcgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgt780tgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgctaatagtcaaaagcctccg840gtcggaggcttttgactttctgcgcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaa900tccaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagttccctac960tctcgcatggggagaccccacactaccatcggcgctacggcgtttcacttctgagttcgg1020catggggtcaggtgggaccaccgcgctactgccgccaggcanaggatacttccaatccat1080ggcaacaaaacaaaaagtagaggaggtaaatatgaagcagcgcattacagtcaccgtcga1140cagtgacagctatcagttgctcaaggcatatgatgtcaatatctccgggctggtaagcac1200caccctgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggcaggcagaaaatcagga1260agggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgccgacgagaacag1320ggactggtgacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat1380tgggccctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcg1440agcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgc1500aggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgtt1560gctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaag1620tcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctc1680cctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctccc1740ttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggt1800cgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcctt1860atccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagc1920agccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaa1980gtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaa2040gccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctgg2100tagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaaga2160agatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagg2220gattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatg2280aagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactc2340atcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttg2400aaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaag2460atcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttccc2520ctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtga2580gaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctc2640gtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgag2700gcgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcg2760caggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatac2820ctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacg2880gataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccat2940ctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgc3000atcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagc3060ccatttatacccatataaatcagc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