本发明属于诊断领域。具体地，本发明涉及用于定量检测样品中的核酸靶标的重组病毒颗粒及其应用。
背景技术：
：：冠状病毒感染人体可导致肺炎，如covid-19等。对冠状病毒的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。自2019年12月由新型冠状病毒2019-ncov(2020年2月12日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“sars-cov-2”)，感染人体产生新型冠状病毒肺炎流行(世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“covid-19”)，发现2019-ncov携带者、易感人群、发病率、治病率和死亡率，已成为国内外政府和人们十分关注和敏感的问题。对2019-ncov的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。目前，国内外已针对2019-ncov研发试剂盒。3月6日，国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂10个，抗体检测试剂5个(图1)。但由于缺乏可用于2019-ncov核酸检测试剂盒及相关设备的与2019-ncov相似的阳性对照品，不能对这些已推出使用的核酸检测试剂盒，及其相关设备获得的检测结果的精确性(阳性和阴性)作出很好的判断，即便出现假阴性，也并不可靠，更不能计算待测样本的单位体积病毒颗粒数量(如500病毒颗粒/ml)。2月12日，美国cdc表示，他们自研的检测试剂盒被证实存在缺陷，随后被紧急撤回。这批测试套件中的一个部件缺陷，导致全美众多公共卫生实验室无法使用。鉴于此，迫切需要能准确反映检测准确性及定量2019-ncov的参照标准品去确认假阳性，并从定性提升到定量，以便更好地观察冠状病毒rna的动态分析，并用于对病人治疗标准的判断。此外，能准确反映检测准确性及定量2019-ncov的参照标准品也可用于新药实验，通过不同时期的病毒载量(viralload)(zou，etal.2020，kim，etal.2020，pan，etal.2020)来评估药物的作用及其质量。聚合酶链反应(pcr)自20世纪90年代初以来被广泛用作诊断工具。聚合酶链反应的使用通过在各种样品中提供快速、特异和灵敏的微生物核酸检测，彻底改变了微生物的诊断检测。最初，假阳性结果是以前产生的扩增子反应污染的结果，是使用这种新技术的人主要关心的问题。采取措施避免预扩增核酸的污染，并通过引入实时聚合酶链反应实现了实质性的改进。这是因为实时聚合酶链反应是一个封闭的管系统，不需要扩增子的聚合酶链反应后分析；当应用这项技术时，仍然被认为是污染和假阳性结果的主要来源。此外，人们越来越重视将假阴性结果的影响降至最低；即确保阴性结果真正代表聚合酶链反应诊断靶的缺失。这是因为假阴性结果可能由测试步骤之一(核酸提取、反转录反应、聚合酶链反应建立或扩增)的失败而产生。第一种控制假阴性结果的方法是在聚合酶链反应中加入与被检测靶标核酸序列不同的外源核酸，作为反应体系的掺入内标(spikeininternalcontrols)通常是质粒dna，在样品中存在任何pcr扩增抑制物质都会降低或完全抑制核酸的扩增。基于此原理，公开的文献已披露使用质粒的单个和多个内部质控品，用于几种病原体的诊断(etal.2003，dingleetal.2004，hymasetal.2005，maaroufietal.2006)。然而，这种掺入内标方法仅可用于评估扩增步骤引起的假阴性。在检测病毒核酸的情况下，也有必要控制扩增前的各个步骤，例如从血浆中收集病毒颗粒和提取病毒核酸，使用咽拭子采集新冠病毒并保存在一定的储存液，在一定的时限内提取病毒rna再进行rt-pcr核酸检测。需要使用新的方法克服这种局限性。最初，在核酸提取之前加入外源核酸，用来评估核酸提取的效率，但无法正确评估在样本采集过程中病毒颗粒的丢失。因此，理想的对照品(标准品)应该是能被保护的核酸，需要有在结构上和待检病毒颗粒有相似并存在与rt-ppcr病毒核酸检测的全过程。此外，受保护的dna或rna的构建将保护核酸在长期储存后免受核酸酶或水解的降解，如果病毒rna作为对照品，这一点尤其重要。病毒或假病毒颗粒，含有与待测核酸靶标相同种类的核酸(dna或rna)，结构稳定，设计为与待测病原体同时经历相同的步骤，已用于病毒靶标的检测分析(clelandetal.1999，garsonetal.2005，clancyetal.2008)。出于人类和动物的安全性，科学家优先选择了非致病性病毒为基本骨架进行改造，并可掺入待测样本的内标(dreieretal.2005，gerrietsetal.2008，ninoveetal.2011)。在本发明前，实时荧光pcr反应分析中使用了两类外源性内标。竞争性掺入内标具有与待测样本靶标相同引物的序列，可以在同一pcr反应中使用和待测靶标相同的引物对，但使用掺入内标和待测靶标的探针序列不同。非竞争性内标碱基百分比组成和序列与待测样本靶标完全不同的检测序列。竞争性内标可以模拟靶序列的扩增动力学；然而，它会在低浓度待测靶标pcr反应体系中与待测靶序列竞争。完全与靶标序列不同的非竞争性掺入内标可以被设计和制备成适合使用于几个待测靶序列；非竞争性质控品的扩增通常不能反映待测靶序列的扩增动力学(rosenstrausetal.1998，hoorfaretal.2004，sharmaetal.2014)。因此，需要根据不同的检测需求选择竞争性和非竞争性内标。已发表的相关文献中，利用牛腹泻病毒(clelandetal.1999)、犬瘟热病毒(clancyetal.2008)、鼠巨细胞病毒(garsonetal.2005)以及t4和ms2噬菌体(dreieretal.2005，rolfeetal.2007，gerrietsetal.2008，ninoveetal.2011)，制备非竞争性内标并用于包括丙型肝炎病毒(hcv)在内的多种dna和rna病毒的检测。以噬菌体λ和qβ为骨架基础研发的竞争性内标的模拟假病毒已用于多种病毒的检测(etal.2003，&berg2004，villanovaetal.2007，mengetal.2009)；针对待测靶标的竞争性假病毒内标包含病原体特异性靶标核酸序列和由噬菌体λ和病毒的外壳蛋白，例如基于ms2外壳蛋白制备的第一个被称为“装甲rna”的商业化竞争内标(pasloskeetal.1998)。还有多种竞争性内标使用的报道(walkerpeachetal.1999，drostenetal.2001，beldetal.2004，chengetal.2006，zhaoetal.2007，weietal.2008，mengetal.2009，zhanetal.2009，felder&2014，sharmaetal.2014)。zambenedetti等人报道了以ms2噬菌体为基础，构建了利用大肠杆菌为宿主制备的竞争性内标的模拟病毒，并经测试把各种竞争性内标的假病毒用于丙型肝炎病毒的诊断过程中的监控提取、反转录、扩增和检测等步骤。这种模拟病毒和待测病毒靶标序列的不同之处只限于荧光探针结合序列的21个碱基中的14个碱基排列的差别(zambenedettietal.2017)。此模拟病毒设计作为竞争性内标，并没有解决二十几年前gibson报道的竞争性内标设计的(gibsonetal.1996)。在实时定量pcr或rt-pcr反应体系中，含有竞争性内标的模拟病毒颗粒数和待测样本靶标病毒颗粒数相差太多时，多者减少少者的扩增效率，甚至完全完全抑制少者的扩增，这种抑制机制是很复杂的，包括在pcr或rt-pcr过程中反应体系的dntp、二价mg2+、酶活性和磷酸化(ppi)的变化引起的动力学的变化。本发明是为解决上述竞争性内标的缺点，利用含有掺入已精确定量的掺入内标使待测靶标的定性检测更准确，并且可根据掺入内标的模拟病毒拷贝数或由其衍生的dna、rna、cdna掺入内标分子数(拷贝数)，可以较精准的计算待测样本中待测靶标(病毒、dna或rna)的拷贝数。参考文献：beldm，minnaarr，weelj，solc，damenm，vanderavoorth，etal.highlysensitiveassayfordetectionofenterovirusinclinicalspecimensbyreversetranscription-pcrwithanarmoredrnainternalcontrol.jclinmicrobiol.2004；42(7)：3059-64.chengy，niuj，zhangy，huangj，liq.preparationofhis-taggedarmoredrnaphageparticlesasacontrolforreal-timereversetranscription-pcrdetectionofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus.jclinmicrobiol.2006；44(10)：3557-61.clancya，crowleyb，niestersh，herrac.thedevelopmentofaqualitativereal-timert-pcrassayforthedetectionofhepatitiscvirus.eurjclinmicrobiolinfectdis.2008；27(12)：1177-82.clelanda，nettletonp，jarvisl，simmondsp.useofbovineviraldiarrheavirusasaninternalcontrolforamplificationofhepatitiscvirus.voxsang.1999；76(3)：170-4.dingleke，crookd，jefferyk.stableandnoncompetitivernainternalcontrolforroutineclinicaldiagnosticreversetranscription-pcr.jclinmicrobiol.2004；42(3)：1003-11.dreierj，m，kleesiekk.useofbacteriophagems2asaninternalcontrolinviralreversetranscription-pcrassays.jclinmicrobiol.2005；43(9)：4551-7.drostenc，seifriede，rothwk.taqman5’-nucleasehumanimmunodeficiencyvirustype1pcrassaywithphage-packagedcompetitiveinternalcontrolforhigh-throughputblooddonorscreening.jclinmicrobiol.2001；39(12)：4302-8.feldere，r.developmentofaversatileandstableinternalcontrolsystemforrt-qpcrassays.jvirolmethods.2014；208：33-40.garsonja，grantpr，ayliffeu，fernsrb，tedderrs.real-timepcrquantitationofhepatitisbvirusdnausingautomatedsamplepreparationandmurinecytomegalovirusinternalcontrol.jvirolmethods.2005；126(1-2)：207-13.gerrietsje，greinertc，gebhartcl.implementationofat4extractioncontrolformolecularassaysofcerebrospinalfluidandstoolspecimens.jmoldiagn.2008；10(1)：28-32.hoorfarj，malornyb，abdulmawjooda，cookn，wagnerm，fachp.practicalco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载体，其中所述定量检测核酸片段选自下述一种或多种：检测靶向序列1(对应检测样品的orf1ab编码基因片段)包括选自seqidno：1至seqidno：2的序列或其组合或至少由选自seqidno：1至seqidno：2的序列或其组合组成；检测靶向序列2(对应检测样品的s蛋白编码基因片段)包括或至少由seqidno：3序列组成；检测靶向序列3(对应检测样品的e蛋白编码基因片段)包括或至少由seqidno：4序列组成；检测靶向序列4(对应检测样品的n蛋白编码基因片段)包括选自以下seqidno：5至seqidno：8的序列或其任意组合或至少由选自以下seqidno：5至seqidno：8的序列或其任意组合组成；9.项目8所述的模拟病毒载体，其中所述模拟病毒的序列seqidno：910.利用项目1-9任一项的模拟病毒载体制备的模拟病毒颗粒，优选将所述模拟病毒载体转染到人293t细胞株中来制备所述模拟病毒颗粒。11.项目1-9任一项所述的模拟病毒载体或项目10所述的模拟病毒颗粒在选自以下用途中的应用：(1)定性和定量检测样品中的核酸靶标；例如作为检测样品中核酸靶标存在(例如来自covid-19患者、sars-cov-2携带者、covid-19疑似患者或样品中sars-cov-2)的参照标准品(定性：如阳性和阴性的判断)的应用，例如用于样本采集、样品保存和样品rna提取过程中的质量分析和质量控制，或例如用于定量检测样品中sars-cov-2中的应用(2)制备检测样品中核酸靶标的试剂或试剂盒中的应用；(3)用于评价例如携带所述核酸靶标的患者治疗效果中的应用(4)用于评价或筛选治疗所述生物体(例如细胞，病毒或真菌)导致的疾病的药物中的应用。12.定性和定量参照标准品rna，其通过提取项目10所述模拟病毒颗粒制备，其中所述生物体为rna病毒。13.项目12所述的定性和定量参照标准品rna，其在检测rna病毒如sars-cov-2的过程涉及的从rna反转录为cdna的过程中用作参照标准品，例如用于以rna为样本的反转录反应体系中的质量分析和质量控制。14.定性和定量参照标准品cdna或dna，其中定性或定量参照标准品cdna通过反转录项目12所述的定性或定量参照标准品rna制备，定量参照标准品dna通过提取项目10的模拟病毒颗粒的dna制备，其中所述生物体的遗传物质为dna。15.项目14所述的定性和定量参照标准品cdna或dna，其用于检测rna病毒(如sars-cov-2)的过程中或用于检测遗传物质为dna的生物体的过程中涉及的dna扩增过程中扩增效率和荧光信号的质量分子和质量控制。16.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的试剂盒，其包含(1)项目10所述的模拟病毒颗粒、项目12或13的定性或定量参照标准品rna或项目14或15的定性或定量参照标准品cdna或dna，(2)用于扩增持家基因的引物和探针，(3)用于扩增项目12或13的定性或定量参照标准品rna或项目14或15的定性和定量参照标准品cdna或dna的引物和探针，(4)用于扩增检测样品的核酸靶标的引物和探针，其中(3)和(4)中的引物相同，(2)、(3)和(4)中的探针的标记彼此不同。17.项目16所述的试剂盒，其中所述引物的长度为12-30bp，探针长度20-30bp，引物与探针的退火温度差值10℃左右。18.项目16或17所述的试剂盒，其中(2)、(3)和(4)中的探针标记选自cy5，fam或hex或ap593。19.项目18所述的试剂盒，其中试剂盒中的引物和探针序列由持家基因的引物和探针以及检测靶向序列的引物和探针组成，具体如下：(1)持家基因的引物和探针序列见seqidno：10至seqidno：21；(2)检测靶向序列1(对应检测样品的orf1ab编码基因片段)的探针序列见seqidno：22、seqidno：23；(3)检测靶向序列2(对应检测样品的n蛋白编码基因片段)的探针序列见seqidno：24至seqidno：27；(4)检测靶向序列3(对应检测样品的s蛋白编码基因片段)的探针序列见seqidno：28；(5)检测靶向序列4(对应检测样品的e蛋白编码基因片段)的探针序列见seqidno：29；(6)扩增检测靶向序列1的引物见序列seqidno：30至seqidno：33；(7)扩增检测靶向序列2的引物见序列seqidno：34至seqidno：41；(8)扩增检测靶向序列3的引物见序列seqidno：42、seqidno：43；(9)扩增检测靶向序列4的引物见序列seqidno：44、seqidno：45；20.定性和定量检测样品的核酸靶标序列的方法，包括使用项目16-19任一项所述的试剂盒。21.项目20所述的方法，包括：扩增步骤1：用项目19所述试剂盒中的扩增检测靶向序列1-4的至少2对引物扩增样品sars-cov-2的orf1ab、s蛋白基因，e蛋白基因，n蛋白基因的至少2种，扩增步骤2：扩增所述检测靶向序列1-4；扩增步骤3：扩增持家基因。22.项目2-21任一项所述的方法，其中扩增步骤1-扩增步骤3在相同或不同的反应体系中进行。23.本发明的上述任一项项目可以用于任何dna或rna病毒，包括但不限于hbv，hcv，hpv，hiv。本发明的定量检测核酸片段的设计示意图参见图20(以及图28几种实例图)。以中国cdc推荐的新冠状病毒sars-cov-2的orf1ab基因和本发明选择的spike蛋白编码基因为例，定量检测核酸片段的设计示意图参见图21和图22。图24是用于新型冠状病毒(sars-cov-2)核酸检测试剂盒的原料和试剂盒生产流程中质量分析和质量控制的“质控品”。图25是新型冠状病毒(sars-cov-2)核酸检测试剂盒(定量)，显示了本发明的掺入阳性参考品添加到图24流程的采样管中。为了更好解决竞争和非竞争的定量检测核酸片段(掺入内标)存在的问题，需要更好的确定对待测靶标检测的最低极限值和精确的计算待测样本中待测靶标的分子数。对于一种特定生物体的待测靶标的核酸序列的竞争性和非竞争性的的定量检测核酸片段(掺入内标)的设计，按掺入内标扩增子区域的引物区域、探针区域及其之间的间隔区的序列和待测靶标序列扩增子区域的相对应的引物区域、探针区域和间隔区域的碱基序列排列的差异，可设计的掺入内标的种类很多，其设计基本原则见表a。表a掺入待测样本或样本采集装置(管)掺入内标(dna或rna)序列示例性的设计基本原则定义为了促进对本发明的理解，下文给出术语的解释：模拟病毒：又称假病毒(pseudovirus)。待测靶标：是指选自来源于已知dna或rna序列的生物体基因组的部分序列片段，例如待检测样品的核酸靶标序列，感染sars-cov-2病毒样本的sars-cov-2基因n靶标序列。质控品(referencestandard，refereneematerial)：是指含有和来自某种生物体待测靶标(dna或rna)序列相同的碱基百分比组成和相同排列序列的模拟病毒及其衍生的dna、rna或cdna。标准品(定性和定量参照标准品)(referencestandard，referencematerial)：是指含有和来自生物体待测靶标(dna或rna)碱基序列数目(bp)相同，碱基百分比组成也相同，但碱基排列序列可有8-25％，4-10％，2-5％相同的模拟病毒及其衍生的dna、rna或cdna。定量检测核酸片段：是指掺入内标(internalcontrols，简写ics)，其掺入片段是与标准品一样的核酸序列片段，也是指可掺入待测样品或样品采集装置(管)的标准品。例如，掺入内标设计标准包括：(1)可监测诊断程序的所有步骤(采样、核酸提取、rt、pcr，或rt-pcr)；(2)可用于dna或rna待测靶标；(3)生产模拟病毒(假病毒)载体的dna残留拷贝数需要有最低量限制；(4)可以是单一或多重的形式，用于一步或两步法rt-pcr反应。如本文使用的术语“参照品”也有称“参照标准品(referencestandard)”，是指具有一种或多种足够均匀并很好确定了含量、序列、活性、结构或分型等生物测量特性(量)值，用以校准仪器、评价生物测量方法或给材料赋值的物质。在本发明中，“定量检测核酸片段的所述5’端序列a和所述3’端序列b之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列a’和所述3’端序列b’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同”是表示两者之间不存在连续三个碱基以上，例如，连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列，例如，优选8-30个碱基排序不同。在本发明中，可以使用的慢病毒载体(lentivirusvector)和腺病毒载体(adenovirusvector)为本领域中常规使用的载体，且已被证明无生物安全性问题，包括lentivirus病毒载体(genedeliverybylentivirusvector，cockrell，adams.，etal.，molecularbiotechnology36(3)，184-204；lentiviralvectorsystemforgenetransfer，gilbert，jamesr.，etal.，2003，https：//books.goole.com/books？)或fiv病毒载体(felineimmunodeficiencyvirus(fiv)asamodelforstudyoflentvirusinfections：parallelswithhiv，john，h.elderetal.，currhivres2010，january，8(1)：73-80；efficienttransductionofnondividinghumancellsbyfelineimmunodeficiencyviruslentiviralvectors，ericm.poeschlaetal.，naturemedicine，volume4，no.3，march1998；fiv：fromlentvirustolentivector，dyanat.saenzetal.，j.genemed2004，6，s95-s104)。在具体的实施方案中，所述慢病毒载体为pez-lv201。附图说明图1是截至2020年3月6日，国家药品监督管理局应急审批通过的新冠病毒检测试剂清单。图2是构建用于ngs、rt-pcr方法检测2019-ncov可掺入参照标准的“模拟病毒”载体骨架。图3是合成片段电泳图。lane1：marker6000；lane2：pcr合成产物l(362bp)。图4是菌落pcr检测结果电泳图。lane1：marker6000；lane2：菌落pcr产物(640bp)；lane3：菌落pcr产物(640bp)；lane4：菌落pcr产物(640bp)；lane5：菌落pcr产物(640bp)；lane6：菌落pcr产物(640bp)；lane7：菌落pcr产物(640bp)。图5是orf1ab与g119753的blast结果图。图6是重组慢病毒颗粒的制备流程示意图。图7是梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应ct值的标准曲线图。图注：将所有梯度稀释的参照标准品进行qpcr反应，获得每一个样品的ct值(扩增阈值循环数)，以log(起始拷贝数)为横坐标x、ct值为纵坐标y，获得标准曲线，并获得曲线公式及相关系数r2。图8是慢病毒感染h1299细胞后的荧光图。图注：将图中所有绿色荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点。图9是带egfp荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图图注：流式细胞仪测定带egfp荧光的细胞，获得标记荧光的细胞所占百分比。纵坐标：ssc-a指相对颗粒度或内部复杂程度；横坐标：fitc-a指颗粒相对大小；p1-1，p1-2，p1-3：指不是带荧光的目标细胞；p1-4指分选出来的带荧光的目标细胞，阳性率为2.23％。图10是梯度稀释cdna样品中orf1ab靶标(图a)，n基因靶标(图b)和s基因靶标(图c)的ddpcr一维液滴分布图与拷贝数浓度定量曲线(图d-f)。图11是ddpcr液滴一维图。蓝色液滴为阳性液滴，灰色液滴为阴性液滴，红色为基线。横坐标表示液滴数，纵坐标表示荧光强度。图12是rna扩增效率图。横坐标表示log10copies，其中copies为200000、100000、10000、1000、100，纵坐标表示ct。图13是ddpcr原始液滴数据图，横坐标为液滴数，纵坐标为荧光强度。以orf1ab为检测靶标，加入2ul模板进行反应，阳性液滴数为2360copies。图14是cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线——orf1ab，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值。图15是cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线——s，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值。图16是cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---e，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值。图17是cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---n，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值。图18是各基因扩增曲线。a，orf1ab-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn(△rn是rn扣除基线后得到的标准化结果)；b，n-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn；c，s-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn；d，e-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn。图19是根据ct值与拷贝数的标准曲线计算“可掺入”模拟病毒n基因的拷贝数浓度。图20是本发明的定量检测核酸片段的设计示意图。设计已知dna或rna序列的所有物种的可掺入待测样本或样本采集装置(管)的阳性标准品的方法。图21是以中国cdc推荐的新冠状病毒sars-cov-2的offlab基因为例，示例性显示本发明的定量检测核酸片段的设计示意图，其中a表示野生型sars-cov-2的rna序列(2019-ncovrnasequence)；b表示选择的用作检测样品的核酸靶标序列的sars-cov-2rna序列(ampliconforvirustargetdetection)，其中下划线表示的是与探针互补的序列，两个箭头分别表示用于扩增检测样品的核酸靶标序列的上游引物和下游引物；c表示含有本发明的定量检测核酸片段的rna序列(selectedampliconfor阳性参考品)，其中下划线表示的是与探针互补的序列，从c中显示的序列可见，定量检测核酸片段的5’端和3’端与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端和3’端的序列相同，序列相同的长度为用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物和3’端引物的长度分别与5’端引物的下游2个碱基和3’端引物的上游两个碱基长度之和。图22是以本发明选择的新冠状病毒sars-cov-2的spike蛋白编码基因为例，示例性显示本发明的定量检测核酸片段的设计示意图，图23是“可掺入的模拟病毒“cdna添加量对”模拟病毒“cdna中新冠病毒靶标定量结果的影响。横坐标为“可掺入的模拟病毒”edna添加量的对数，纵坐标为”模拟病毒“cdna中orf1ab和s靶标的ct值图24是用于新型冠状病毒(sars-cov-2)核酸检测试剂盒的原料和试剂盒生产流程中质量分析和质量控制的“质控品”。图25是新型冠状病毒(sars-cov-2)核酸检测试剂盒(定量)。图26是“模拟病毒”掺入标准品rna中n基因，s基因(图b)的one-steprt-ddpcr一维液滴分布图(图a-b)与拷贝数浓度定量曲线(图c)。图27标准品n基因浓度梯度标准曲线。图28是设计已知dna或rna序列的所有物种的可掺入待测样本或样本采集装置(管)的阳性标准品的方法图，其中，a：阳性标准品方法设计概念图；b：一种插入sars-cov-2的“n”基因靶标的实例；c：一种插入hpv的e6基因靶标的实例；d：一种插入人类基因组ace2基因靶标的实例。图29是rna扩增效率图，横坐标表示log10copies，其中copies为10000、1000、100、10，纵坐标表示ct。对系列点进行线性拟合，根据趋势线的斜率k来进行扩增效率e的计算：e＝(10(-1/k)-1)×100％。图30为掺入标准品rna之后的质控品rna定量标准曲线图，横坐标表示质控品rna的拷贝数浓度，纵坐标表示平均ct值。图31为掺入质控品rna之后的标准品rna定量标准曲线图，横坐标表示标准品rna的拷贝数浓度，纵坐标表示平均ct值。具体实施方式虽然本发明已对其具体实施方式进行描述，然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围之内。通过以下实施例对本发明进行阐述，以下实施例不以任何方式限制本发明。实施例1：重组质粒的构建方法1.实验材料试剂：dnapolymerase(gencopoeia，c0103a)；引物oligo(invitrogen)；克隆载体pez-lv201(genecopoeia)；fast-fusiontmcloningkit(gencopoeia，ffpc-c020)；胶回收试剂盒(omega)；2t1感受态(genecopoeia，u0104a)；stbl3感受态(genecopoeia，u0103a)；限制性内切酶(fermentas)；dnaladder(genecopoeia)；e.z.n.a.gelextractionkit(omega)；ultrapftmdnapolymerasekit(genecopoeia，c0103a)；e.z.n.a.plasmidminikiti(omega)；无内毒素质粒小/中提试剂盒(omega)。2.实验步骤本实施例将冠状病毒核酸检测靶向序列和荧光蛋白基因序列插入慢病毒载体，具体步骤如下：a.载体设计1.载体骨架如图2所示2.表达克隆信息将sars-cov-2特异靶向orflab序列片段克隆至慢病毒克隆载体。sars-cov-2特异靶向orflab序列见seqidno：13.构建步骤(1)sars-cov-2特异靶向orf1ab序列片段合成根据插入序列设计并合成表1中片段合成引物表1.插入片段合成引物将表1中引物进行稀释至50pmol/μl，各取1μl混合均匀，备用；插入序列进行合成pcr扩增：以表1中引物混合物为模板，以ccdc-orf1ab-pf1+ccdc-orf1ab-pf10为引物，采用表2的反应体系和表3的反应程序，扩增获得插入片段m，电泳检测结果见图3，得到产物l片段约362bp，随后用omega的cyclepurekit纯化pcr产物和合成片段。合成用于可掺入的例如ngs、rt-pcr方法检测2019-ncov参照标准的“模拟病毒”的靶向序列插入片段m，其序列见seqidno：46；表2.pcr反应体系试剂名称1×体积5×ultrapftmbuffer5μldntp(25mm)0.2ulmg2+(50mm)0.75ulultrapftmdnapolymerase(5u/μl)0.2μl表1引物混合物1μl引物(5pmol/l)2μlddh2o加至25μl表3.pcr反应程序b.将合成插入片段m克隆至目的载体1.载体的酶切按表4建立酶切体系。用omega的e.z.n.a.gelextractionkit回收载体酶切产物。表4酶切体系试剂用量pez-lv2013μg10×nebbuffer4μlecorl(neb)0.4μl(10μ/μl)xhol(neb)0.4μl(10μ/μl)ddh2o加至40μl2.合成插入片段m和质粒载体的连接用fast-fusioncloningkit进行in-fusion反应，反应结束后取5ul用于转化大肠杆菌感受态细胞2t1。3.pcr法筛选基因重组克隆每个pcr反应体系分装16μlddh2o和1μl载体引物seqidno：47和seqidno：48(5pmol/μl，)，pcr反应程序如表5；电泳检测pcr产物，检测结果见图4，对照marker估计dna片段的大小，选择出含目的dna片段的阳性克隆。用omega的e.z.n.a.plasmidminikiti提取质粒dna，质粒送测序，通过图5中比对结果获知测序质粒g119753为预期正确克隆，其中表达出rna序列从5’ltr到3’ltr序列(插入2019-ncov“模拟病毒”rna序列)为片段n，见序列seqidno：49，质粒全序列(“模拟病毒”载体全序列)为片段w，见序列seqidno：9；表5.pcr反应程序实施例2：慢病毒制备获得重组慢病毒载体后，可以制备重组慢病毒颗粒。流程检测图6。1.实验材料试剂：培养基(corning，10-013-cv)，胎牛血清(excellbio，fsp500)，lenti-pactmhiv慢病毒包装试剂盒(genecopoeia，lt003)2.实验步骤慢病毒制备步骤如下：1.293t(crl-3216tm)细胞在10％胎牛血清的dmem培养基中、在含5％co2、37℃下培养，按照lenti-pactmhiv慢病毒包装试剂盒推荐流程使用实施例1制备的重组质粒和含有gag-pol和rev的辅助质粒共转染细胞)；2.转染12h后，更换含有新鲜培养基，继续培养24h；3.收集培养细胞的上清液，上清液中含有慢病毒颗粒(命名为lpp-wh-fragment3-lv201)。实施例3：慢病毒浓缩1.实验材料试剂：lentivirusconcentrationsolution(6x)(genecopoeia，lt007)，pbs(genecopoeia，pe002)。2.实验步骤1).从工具细胞培养板或培养瓶收集上清液，上清液即含有慢病毒颗粒。上清液可通过4℃2000g离心10min去除细胞碎片。2).浓缩试剂购买于genecopoeia公司(lenti-pactm慢病毒浓缩试剂，lt007)。按慢病毒液体积∶浓缩试剂体积＝5∶1的比例混合慢病毒上清液和浓缩试剂(直接添加慢病毒浓缩试剂6x原液即可)，在0～4℃温度下孵育2h或以上(也可孵育过夜)。在慢病毒的稳定保存期内，适当延长孵育时间可提高慢病毒的回收率。注意：慢病毒在0～4℃下可稳定保存约3天。3).完成孵育后，混合液在4℃下3500g离心25min。4).离心后，小心吸走、弃去上清液，留下沉淀物为慢病毒颗粒。注意：请避免吸走离心沉淀物，该沉淀物为慢病毒颗粒(部分情况下，沉淀物不一定肉眼可见)。5).根据步骤1收集并用于浓缩的慢病毒上清液体积，量取其1/10-1/100体积的dmem或pbs，重新吹打悬起慢病毒沉淀(举例：如步骤1收集的上清液有10ml，则本步骤量取的dmem或pbs为0.1ml-1ml)。注意：重新悬浮慢病毒沉淀时，吹打操作要轻柔。6).重悬的慢病毒液已完成浓缩操作，可分装后保存在-80℃，并同时取少量测定浓缩后的慢病毒检测滴度。实施例4：慢病毒定量1.实验材料试剂：培养基(corning，10-013-cv)，胎牛血清(excellbio，fsp500)，pbs(genecopoeia，pe002)，trypsin(corning，25-053-ci)，lenti-pactm慢病毒滴度检测试剂盒(genecopoeia，lt006)，青霉素-链霉素双抗溶液(hyclone)，rnaselocktmrnase抑制剂。2.实验步骤我们可以采用四种方法测定慢病毒滴度：方法i：使用实时荧光定量pcr仪检测慢病毒物理滴度。方法ii：使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)。方法iii：使用流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度。方法iv：ddpcr方法检测慢病毒rna拷贝数。表6.四种测定结果比较：具体方法i：实时荧光定量pcr仪检测慢病毒物理滴度1.rna提取按照分子克隆实验操作指南提取rna。最后用50μl的te缓冲液溶解rna沉淀(此处te缓冲液为depc处理过的水配制成100μmte缓冲液，其在本发明中溶解rna沉淀均使用此te缓冲液)。2.用dnasei处理(去除游离细胞基因组及质粒)dnasei反应。用1.5ml管子，按表7进行以下反应(总体积25μl)：表7dnasei反应体系试剂用量depc水1.5μllentiviralrna20.0μldnaseibuffer(10×)2.5μldnasei1.0μl总量25.0μl孵育：1)37℃，30-60min；2)75℃，10min(使dnasei失活)注意：如果遗漏了dnasei消化步骤，必须在qpcr反应步骤中加上以未反转录的rna样品为模板的qpcr反应作为对照，该对照确定(未经过dnasei消化的)样品中所携带的质粒dna拷贝数，用反转录产物作为模板进行的qpcr反应所确定的拷贝数减去该对照确定的质粒dna拷贝数，即为样品中rna拷贝数。3.反转录按表8制备rna-primermix，混匀rna-primermix，在70℃温育5min后，将离心管立即置于冰上至冷却。表8rna和cdnasynthesisprimer结合反应体系试剂用量rna(经过dnasei消化过的)10.0μlcdnasynthesisprimer(4.0μm)5.0μl(终浓度1.0μm)注意：试剂盒里的随机引物(在反转录反应液中的终浓度为10μm)可用于替代hivcdnasynthesisprimer。无需同时使用cdnasynthesisprimer和随机引物。1)按表9准备反转录反应体系，继续加入其它组分(总体积20μl)，37℃温育60min。表9反转录反应体系试剂用量reversetranscriptionbuffer(10×)2.0μl25mmdntp1.0μlrnaselocktmrnase抑制剂1.0μlreversetranscriptionenzyme1.0μl总量20.0μl2)90℃，10min。该产物作为待测样品可直接用于qpcr检测实验，或者保存于-20℃。4.qpcr反应1)准备制作标准曲线样品稀释阳性参照标准品(来自试剂盒lenti-pactm慢病毒滴度检测试剂盒(genecopoeia，lt006)，其拷贝数为1x109copies/μl)。制作标准曲线(后续每个稀释梯度取2μl作为模板进行qpcr反应)。①起始拷贝数：1x108copies/μl(操作方法：5μlqpcrstandard(dna)+45μlddh2o)②起始拷贝数：1x107copies/μl(操作方法：5μl①+45μlddh2o)③起始拷贝数：1x106copies/μl(操作方法：5μl②+45μlddh2o)④起始拷贝数：1x105copies/μl(操作方法：5μl③+45μlddh2o)⑤起始拷贝数：1x104copies/μl(操作方法：5μl④+45μlddh2o)⑥起始拷贝数：ix103copies/μl(操作方法：5μl⑤+45μlddh2o)2)按表10进行准备qpcr反应体系(总体积20μl)：表10qpcr反应体系注意：①将反应体系中的各个组分进行预混(除了阳性参照标准品和样品)后再进行分管。②qpcr反应中要设置无模板(ntc)组。③参考品取样，每个稀释管取2μl：3)qpcr反应程序按表11反应程序适用于bio-radiq5realtimepcr检测系统。溶解曲线程序见表12。本领域技术人员可以根据所使用的检测系统进行常规微调。表11qpcr反应程序表12溶解曲线程序4)数据分析①qpcr反应后，读取每一个参考品的ct值(扩增阈值循环数)，以log(起始拷贝数)为横坐标、ct值为纵坐标绘制标准曲线，如图7(梯度稀释的参考品log(起始拷贝数)对应ct值的标准曲线图)，并获得曲线公式。标准曲线的相关系数应高于0.99。图7备注：将所有梯度稀释的参考品进行qpcr反应，获得每一个样品的ct值(扩增阈值循环数)，以log(起始拷贝数)为横坐标x、ct值为纵坐标y，获得标准曲线，并获得曲线公式及相关系数r2。②将读取待测样品的ct值，代入①中(图7中所示)标准曲线的公式(y＝-3.4363x+35.451)，计算其对应的log(起始拷贝数)及其起始拷贝数。③将上述起始拷贝数乘以稀释系数(以下为稀释倍数的计算公式)，得到原始样本的拷贝数(copies/ml)。注意：(a)rna体积：50μl(根据本实验流程)(b)原始样品体积：用于rna抽提的慢病毒颗粒溶液体积10μl(c)dnase反应体积：25μl(根据本实验流程)(d)dnase反应中的rna体积：20μl(根据本实验流程)(e)rt反应体积：20μl(根据本实验流程)(f)rt反应中的rna体积：10μl(根据本实验流程)(g)pcr反应中的cdna体积：2μl(根据本实验流程)④由于每一个慢病毒颗粒含有2个单股正链的rna基因组，因此，得到的慢病毒颗粒数应为拷贝数的1/2。故而，慢病毒颗粒数物理滴度(copies/ml)为原始样本拷贝数除以2。表13为慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表。表13慢病毒颗粒物理滴度计算过程数据表具体方法ii：使用荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒生物拷贝数(滴度)第一天：培养h1299细胞(crl-5803tm)1.使用24孔培养板，每孔各加入细胞5×104、dmem全培养基0.5ml(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗)，在5％co2、37℃条件下培养过夜(约24h)。第二天：感染h1299细胞2.细胞培养24h后，去除细胞培养液，先加入250μl的dmem培养基(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液)，再加入以下步骤3所示的稀释慢病毒。每种慢病毒分别对应细胞培养板的3个板孔。3.慢病毒带有荧光标记可使用荧光显微镜细胞计数法测定检测滴度。先梯度接种慢病毒，每孔添加0.03μl、0.3μl、0.3μl慢病毒原液(各三个复孔)。各孔分别加入适当dmem培养基(添加10％热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液)至终容量为每孔0.5ml。空白对照孔作为参照。第三天：更换培养基4.去除旧培养基，以dmem培养基(添加5％热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液)培养24小时。5.使用倒置荧光显微镜，以荧光显微镜细胞计数法测定慢病毒滴度选取荧光细胞数量能在显微镜下计算的孔，在显微镜下随机挑选5个视野拍照，计算孔板里荧光数量。在加入0.03μl病毒的孔中，荧光细胞数量适中能计算细胞数，孔里5个视野的荧光细胞平均数是x，按下面的公式计算：慢病毒液滴度(tu/ml)＝x(荧光细胞平均数)×63.3(24孔板的面积/显微镜观察视野的面积)/0.03μl(实际添加的慢病毒液体积)。得到表14使用荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度。表14荧光显微镜细胞计数法测定的慢病毒生物滴度备注：1tu/ml约等于100copies/ml慢病毒感染h1299细胞后，通过倒置荧光显微镜，得到如图8的荧光图片。(用倒置荧光显微镜，100倍视野，用gfp荧光拍照计数，将图中所有荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点)。图8注：将图中所有荧光亮点计数，图中箭头表示其中一个荧光点。具体方法iii：流式细胞荧光计数法测定慢病毒生物滴度步骤1～4，与方法ii中1-4步骤相同。第四天：以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度5.以流式细胞荧光计数法测定慢病毒滴度(流式细胞仪型号：bdfacsmelody)带上egfp荧光的细胞可用facs(流式细胞分析技术)进行计数。使用荧光显微镜可进行egfp荧光观察。观察荧光状态后，细胞以胰酶消化，用dmem完全培养基终止消化，再离心500g，10min，使用1mlpbs悬浮细胞，用血细胞计数器测定每孔细胞总数。然后上流式细胞仪进行分析，得出荧光细胞百分比，获得如下图9(带egfp荧光的细胞流式细胞仪分析的数据图)，按下面的公式计算：慢病毒液滴度(tu/ml)＝荧光细胞百分比×孔的细胞总数÷实际添加的慢病毒液体积(单位：ml)。慢病毒的生物滴度表见表15。表15慢病毒的生物滴度表备注：1tu/ml约等于100copies/ml图9备注：流式细胞仪测定带egfp荧光的细胞，获得标记荧光的细胞所占百分比。纵坐标：ssc-a指相对颗粒度或内部复杂程度；横坐标：fitc-a指颗粒相对大小；p1-1，p1-2，p1-3：指不是带荧光的目标细胞；p1-4指分选出来的带荧光的目标细胞，阳性率为2.23％。具体方法iv：ddpcr方法检测慢病毒rna拷贝数(一)实验材料试剂：bio-radddpcrtmsupermixforprobes(nodutp)设备：bio-radqx200dropletdigitalpcrsystem(二)实验步骤1.将逆转录慢病毒颗粒rna得到的cdna用ddh2o(dnasefree)进行10倍梯度稀释，得到4个ddpcr待测样品；2.将ddpcrtmsupermixforprobes(nodutp)在室温下融解，上下颠倒混匀并进行短暂离心；3.按表16配制ddpcrreactionmix(fam/hex双通道)表16ddpcr反应体系4.配好的体系震荡混匀离心后，小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内，并在下排的孔中加入70μl微滴发生油，然后在微滴生成仪中生成微滴。5.将生成好微滴的样品(40μl)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddpcr专用96孔板中，盖上铝膜后用px1热封仪对96孔板进行封膜。6.封好膜之后应该在30min内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4h之内进行pcr，按表17进行pcr反应，升降温速度设置为2℃/sec。表17pcr反应7.pcr结束后，将96孔板取出，在微滴读取仪上进行微滴读取。8.微滴读取结束后，在bio-radquantasoft软件上分析数据结果，按图10计算“模拟病毒”cdna中orflab和n基因的拷贝数浓度。图10.为梯度稀释cdna样品中orf1ab靶标(图a)，n基因(图b)和s基因(图c)的ddpcr一维液滴分布图与拷贝数浓度定量曲线(图d-f)实施例5：提取rna1.实验材料试剂：genecopoeiarnazoltmrtrnaisolationreagent，异丙醇，75％乙醇，ddh2o(rnaseanddnasefree)。设备：漩涡震荡器。2.实验步骤1.样品处理取约400μl病毒悬液加入装有1mlrnazolrt的1.5～2ml离心管中，振荡混匀后室温静置约5min；2.相分离每1mlrnazolrt加入400μlddh2o(rnaseanddnasefree)，或补充ddh2o(rnaseanddnasefree)至1.4ml，盖上盖子，振荡混匀约15sec，室温静置5～15min。10000rpm离心15min；3.沉淀转移上清至新的1.5～2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min。10000g离心10min。4.洗涤弃上清，余下沉淀加入400μl75％乙醇，混匀后7500g离心1～3min，此步重复一次。5.溶解弃上清，自然风干沉淀，加入50μlte(rnaseanddnasefree)溶解，即为总rna。实施例6：cdna制备1.实验材料试剂：genecopoeiasurescripttmfirst-strandcdnasynthesiskit，慢病毒rna，depc水。设备：普通pcr仪。2.实验步骤1).配制逆转录体系按genecopoeiatmsurescripttmfirst-strandcdnasynthesiskit说明书的表18配制逆转录体系：表18cdna制备的逆转录体系2).逆转录反应在普通pcr仪上按19表进行逆转录程序。表19cdna制备的逆转录程序反应温度时长25℃5min50℃60min85℃5min逆转录后的cdna置于-20℃保存。实施例7：rna制备方法和质控分析1.实验材料试剂：rnazolrnaisolattionreagent(genecopoeia)、mgcl2.6h2o(sigma)、depc(mbchem)、异丙醇(广州化学试剂厂)、trizmabase(sigma)、edta(sigma)、rnaselock(genecopoeia)、dnasei(neb)、1-steptaqmanqpcrmix(genecopoeia)、2-steptaqmanqpcrmix(genecopoeia)、blazetaqrtasemix(genecopoeia)、ddpcrsupermixforprobes(nodutp)(bio-rad)、fam标记探针(invitrogen)、移液吸头(axygen)、50ml离心管(biofil)、1.5ml离心管(axygen)。2.实验步骤1)准备80ml模拟病毒培养液，经peg浓缩沉淀后，病毒保存于pbs缓冲液中，体积为10ml，并经过benzonase处理2次，以去除质粒dna的残留；2)冰上操作：300μl模拟病毒+1mlrnazol，混匀，静置5min，再加入100μldepc水，补齐至1.4ml体积；3)10,000rpm，4℃离心10min后，集中所有的上清至50ml离心管中，加入等体积异丙醇；4)混匀后，分装1.4ml/管，室温静置5min；5)10000rpm，4℃离心15min，弃上清，沉淀加入400μl75％乙醇(depc水配制)，混匀，7500rpm，4℃离心2min，再重复洗涤一次；6)弃上清，室温放置约5min自然风干沉淀后，加入50μlte(含rnaselock：0.02u/μl)溶解，将所有rna溶液混匀后分装，并保存于-80℃冰箱中；7)采用dnasei处理rna中残留质粒dna，dnasei活性单位为7u/1.5μgrna。各成分的用量为：rna58μl、dnasei14μl、10×dnaseibuffer8μl，37℃15min或75℃10min；8)采用qpcr检测dna残留，相关引物如表20，各成分的加入量为：5×2-steptaqmanmix4μl、primersandprobemix(10um)0.25μl、rna2μl、depch2oto20μl，反应体系如表21所示。表20采用qpcr检测dna残留的相关引物表21qpcr检测dna残留的反应程序9)采用ddpcr检测rna拷贝数与dna残留，各成分的加入量为2×ddpcrsupermix10μl、primermix900nm、probe250nm、rna2μl，depch2oto20μl，反应程序如表22所示。表22采用ddpcr检测rna拷贝数与dna残留的反应程序10)rt-qpcr检测rna扩增效率，各成分的加入量为5×1-steptaqmanmix4μl、primersandprobemix(10μm)0.25μl、rna2μl，depch2oto20μl，反应程序如表23所示。表23.rt-qpcr检测rna扩增效率的反应程序3.实验结果1)根据表24进行rna标准品的dna残留检测表24.rna标准品的dna残留检测结果检测基因orf1ab-fams-famqpcr(ct)35.635.6ddpcr(copies)08dnasei消化后质粒残留率相较于rna在万分之一以下，对rna参考标准品的定量分析无影响。2)rna拷贝数定量选择orflab-fam进行rna拷贝数定量，如图11，混匀后分装的每份rna靶标基因(1ab)的总拷贝数为1.75×107copies。图11.ddpcr液滴一维图。蓝色液滴为阳性液滴，灰色液滴为阴性液滴，红色为基线。横坐标表示液滴数，纵坐标表示荧光强度。3)rna扩增效率，如表25和图12所示。表25rna扩增效率图12.rna扩增效率图。横坐标表示log10copies，其中copies为200000、100000、10000、1000、100，纵坐标表示ct。实施例8：cdna制备和质量分析1.实验材料试剂：dnasei(neb2u/μl)、5×blazetaqtmprobeqpcrmastermix(withrox)(genecopoeia，cat.qp036)、5×flsurescripttmrtbuffer(genecopoeia)、10×rtasemix(s+m)(genecopoeia)、ddpcrtmsupermixforprobes(nodutp)(bio-rad)、depc水、pd-10desaltingcolumns(gehealthcarelifesciences)、fam标记探针(invitrogen)、移液吸头(axygen)、50ml离心管(biofil)、1.5ml离心管(axygey)、200μlpcr管(sarstedt)、microampoptical96-wellreactionplate(abi)。2.实验步骤(1)将-80℃保存的模拟病毒rna(100ng/μl，50μl/管)置于冰上溶解，涡旋震荡混匀，瞬时离心dnasei消化rna中的dna，在通风橱中按下表26的消化体系配制，配置好的体系瞬时离心后水浴消化。dnasei消化程序如表27所示。涡旋震荡混匀消化后的体系，并瞬时离心待用。表26dna消化体系表成份1×体积10×dnaseibuffer8μldnasei(2u/μl)14μl模拟病毒rna(100ng/μl)50μldepc水8μl表27dna消化程序表反应温度时长37℃15min75℃15min(2)取出38个200μlpcr管(rnaseanddnase-free)，在通风橱中按下表28的逆转率体系配制，配置好的体系瞬时离心后普通pcr上机，按照表29程序进行逆转录。逆转录后涡旋震荡混匀逆转后的体系，并瞬时离心待用。表28rna逆转录体系表成份1×体积5×flsurescripttmrtbuffer4μl10×rtasemix(s+m)2μldnasei消化后的rna2μldepc水12μl总体积20μl表29rna逆转录程序表反应温度时长25℃5min45℃60min85℃5min(3)在通风橱中将38管逆转录产物全部收集于1个1.5ml离心管(rnaseanddnase-free)，涡旋震荡混匀，瞬时离心。(4)取500μl逆转录后的cdna样品，在通风橱中进行p10柱子凝胶过滤层析法纯化，具体纯化步骤如下：1)将p10柱子固定于试管架上，用已经酒精消毒的剪刀将柱子底部剪开；2)往柱子中央加入1ml1×tebuffer平衡柱子，流出液废弃于废液缸中(重复5次)；3)往柱子中央加入1ml1×dillutionbuffer，流出液废弃于废液缸中；4)往柱子中央加入1ml1×tebuffer，流出液废弃于废液缸中(重复6次)；5)待柱子液体流完后，往柱子中央加入500μlcdna样品；6)向柱子周围缓慢加入500μl1×tebuffer，并同时用1.5ml离心管收集流出液，标记①号管；7)向柱子周围缓慢加入500μl1×tebuffer，并同时用1.5ml离心管收集流出液，标记②号管；8)重复上述收集流出液的步骤，直到收集到第20管流出液即可停止收集流出液，标记好①②③...；9)将收集管⑤⑥⑦混为一管(标记为cdnamix)，涡旋震荡混匀，瞬时离心。(5)取50μlcdnamix，进行ddpcr检测拷贝数，ddpcr具体操作步骤如下：1)将cdnamix进行100倍稀释：20μlcdnamix+180μl1×tebuffer，涡旋混匀并进行短暂离心。2)将ddpcrtmsupermixforprobes(nodutp)在室温下融解，上下颠倒混匀并进行短暂离心。3)配制ddpcrreactionmix(fam/hex双通道)，体系配制如表30。表30.ddpcr反应体系表成份1×体积终浓度2×supermixforprobes(nodutp)10μl1×orf1abprimermix(10μm)1.8μl0.9μmorf1abtaqmanprobe(5μm)1μl0.25μm稀释后的cdna2μlddh2o加至20μl总体积20μl4)配好的体系震荡混匀离心后，小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内，并在下排的孔中加入70μl微滴发生油，然后在微滴生成仪中生成微滴。5)将生成好微滴的样品(40μl)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddpcr专用96孔板中，盖上铝膜后用px1热封仪对96孔板进行封膜。6)封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr，pcr程序如表31，其中升降温速度设置为2℃/s。表31pcr反应程序7)pcr结束后，将96孔板取出，在微滴读取仪上进行微滴读取。8)微滴读取结束后，在bio-radquantasoft软件上分析数据结果。9)以ddpcr结果为准，将cdnamix(1.18×105copies/μl)至于冰上解冻并混匀离心后，使用1×tebuffer稀释为cdnastandard#1(cdna浓度为1×105copies/μl)：1000μlcdnamix+180μl1×tebuffer，上下颠倒混匀并进行短暂离心。再使用1×tebuffer将cdnastandard#1进行梯度稀释。具体稀释步骤如下：1)cdnastandard#2-1(5×104copies/μl)：50μlcdnastandard#1+50μl1×tebuffer；2)cdnastandard#2-2(5×103copies/μl)：20μlcdnastandard#2-1+180μl1×tebuffer；3)cdnastandard#2-3(5×102copies/μl)：20μlcdnastandard#2-2+180μl1×tebuffer；4)cdnastandard#2-4(5×10copies/μl)：20μlcdnastandard#2-3+180μl1×tebuffer；5)将cdnastandard#2的样品进行qpcr检测扩增效率，按表32和表33的体系和程序进行配制和上机。表32.qpcr反应体系表成份1×体积5×blazetaqtmprobeqpcrmastermix4μlorf1ab/n/s/eprimersandprobe(10μm)0.25μl各稀释梯度的cdna样品2μlrox(30μm)0.1μldepc水12μl表33.qpcr反应程序表3.实验结果(1)cdnamix的ddpcr结果1)ddpcr原始液滴数据图13图13.ddpcr原始液滴数据图，横坐标为液滴数，纵坐标为荧光强度。以orf1ab为检测靶标，加入2ul模板进行反应，阳性液滴数为2360copies。2)结果计算：表34以ddpcr数据计算cdnamix浓度样品计算过程及最终浓度cdnamix稀释100倍的浓度2360÷2＝1180copies/μlcdnamix原液浓度1180×100＝1.18×105copies/μl注释：cdnamix为cdna纯化⑤⑥⑦管的混合液(2)cdnastandard#2各梯度的qpcr检测扩增效率结果：1)ct值，计算过程表10表35.cdnastandard#2梯度qpcrct值注释：e＝10[(-1/斜率)-1]cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线见图14-17。图14.cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---orf1ab，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值图15.cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---s，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值图16.cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---e，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值图17.cdnastandard#2梯度qpcr标准曲线---n，横坐标为log10copies，纵坐标为ct值2)各基因扩增曲线见图18图18.为各基因扩增曲线。a，orf1ab-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn(△rn是rn扣除基线后得到的标准化结果)；b，n-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn；c，s-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn；d，e-fam基因的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为△rn。实施例9：可掺入标准品的扩增效率1.实验材料试剂：genecopoeiablazetaqsybrgreenqpcrmix设备：abiviia7qpcr仪2.实验步骤1)按照“模拟病毒”cdna和“可掺入的模拟病毒”cdna的预实验结果，参考ddpcr定量数据，在生物安全柜中将两种cdna进行10倍梯度稀释，得到得到105拷贝/ul-102拷贝/ul的待测样品2)在生物安全柜中进行染料法qpcr反应的配制，待测的靶标分别orf1ab，s，e，n；体系见表36表36qpcr反应体系组分体积5×blazetaqsybrgreenqpcrmix4μlprimermix2μm)2μlcdna(105～102copies/μl)5μlddh2o9μl总计20μl3)体系配制完成后，在qpcr仪(abiviia7)上进行qpcr定量检测与熔解曲线分析，qpcr反应程序和溶解曲线程序分别如表37和表38：表37qpcr反应程序表38溶解曲线程序温度间隔温度时长95℃→60℃1.6℃1sec/each4)根据梯度稀释样品的ct值，计算不同cdna的不同靶标扩增效率，结果如表39表39：“模拟病毒cdna”与“可掺入的模拟病毒cdna”中四个新冠病毒靶标的扩增效率计算图19：根据ct值与拷贝数的标准曲线计算“可掺入”模拟病毒n基因的拷贝数浓度。图19注：以拷贝数的对数为横坐标，ct值为纵坐标绘制x-y散点图，对系列点进行线性拟合，根据趋势线的斜率k来进行扩增效率e的计算：e＝(10^(-1/k)-1)×100％实施例10：“可掺入的模拟病毒“cdna添加量对”模拟病毒“cdna中新冠病毒靶标定量结果的影响1.实验材料试剂：genecopoeiablazetaqqpcrmixforprobes2.实验步骤1)根据染料法qpcr对“可掺入的模拟病毒”cdna的靶标定量结果，估算orf1ab和s两个靶标的拷贝数浓度2)在生物安全柜中，往用于检测试剂盒原料和质控品的“模拟病毒”cdna中添加不同浓度梯度(5×105拷贝-50拷贝)的“可掺入的模拟病毒”cdna3)在生物安全柜中进行探针法qpcr反应的配制，待测的靶标是orf1ab和s；qpcr体系与探针法qpcr试剂盒说明书中的相同3.实验结果，见图23。图23“可掺入的模拟病毒“cdna添加量对”模拟病毒“cdna中新冠病毒靶标定量结果的影响。横坐标为“可掺入的模拟病毒”cdna添加量的对数，纵坐标为”模拟病毒“cdna中orf1ab和s靶标的ct值。实施例11：慢病毒定量的具体方法v：一步法rt-ddpcr方法检测“模拟病毒”掺入标准品rna中n基因和s基因拷贝数浓度(一)实验材料试剂：bio-radone-steprt-ddpcradvancedkitforprobes设备：bio-radqx200dropletdigitalpcrsystem(二)实验步骤1.将“模拟病毒”掺入标准品rna用ddh2o(dnase-free)进行100倍稀释后，再10倍稀释两个梯度，得到3个rt-ddpcr待测样品；2.将bio-radone-steprt-ddpcradvancedkitforprobes的所有组分在室温下融解，上下颠倒混匀并进行短暂离心；3.按表40配制rt-ddpcrreactionmix表40rt-ddpcr反应体系4.配好的体系震荡混匀离心后，小心地将其转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内，并在下排的孔中加入70μl微滴发生油，然后在微滴生成仪中生成微滴。5.将生成好微滴的样品(40μl)从微滴发生卡的上排孔中转移到ddpcr专用96孔板中，盖上铝膜后用px1热封仪对96孔板进行封膜。6.封好膜之后在30min内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4h之内进行pcr，按表17进行pcr反应，升降温速度设置为2℃/sec。表41pcr反应7.pcr结束后，将96孔板取出，在微滴读取仪上进行微滴读取。8.微滴读取结束后，在bio-radquantasoft软件上分析数据结果，计算“模拟病毒”掺入标准品rna中n基因和s基因的拷贝数浓度，参见图26。实施例12：新型冠状病毒2019-ncov核酸定性定量检测试剂盒(荧光pcr法)及可掺入阳性标准品及质控品rna模型检测本方法基于一步法rt-pcr技术(rna逆转录反应以及聚合酶链式反应(pcr)结合taqman技术)，选取2019新型冠状病毒(2019-ncov)n基因和s基因特异性保守序列作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针(n基因探针采用hex标记，s基因探针采用fam标记)用于标本中2019新型冠状病毒rna的检测；同时包括内源性内标检测系统(内标基因h探针采用cy5标记，独有阳性标准品s基因和n基因探针采用ap593标)，即3对引物，4个探针对目的基因进行定性定量分析。标准品：核酸序列长度、碱基百分比、tm值、引物与质控品(或待测靶标)相同，但序列片段排列不同。1.实验材料1.1.仪器pcr仪器：abiviia7离心机：labnet，c1301生物安全柜：苏州净化1.2.耗材96孔板：abi，n80105601.3.试剂rtrnaisolationreagent：广州易锦生物技术有限公司，qp020dnasei：neb，m0303l引物：见表42taqman探针：见表43表42：引物序列及相关信息表43：探针序列及荧光标记信息注：fl：广州复能基因有限公司，ccdc：中国疾病预防控制中心2.实验步骤2.1.rna提取参照rtrnaisolationreagent试剂盒说明书提取标准品rna和质控品rna，最后使用50μl的te缓冲液溶解rna沉淀(此处te缓冲液为depc处理过的水配制成100μmte缓冲液，其在本发明中溶解rna沉淀均使用此te缓冲液)。2.2.dnasei消化rna两种rna提取后使用dnasei处理，目的是去除rna中的基因组dna和质粒dna残留。参照表44的反应体系进行dnasei处理rna，加样完成后瞬时离心，37℃加热10min，72℃加热10分钟使dnasei失活，-80℃储存备用。表44dnasei反应体系试剂用量/μldepc水10rna30dnaseibuffer(10×)5dnasei5总量50qpcr及rt-pcr检测基因组dna和质粒dna残留，待qpcr检测不到目的基因时说明消化干净，rna可用于后续实验。以n基因靶点为例，qpcr反应体系见表45，rt-pcr反应体系1见表46，上机程序见表47。表45.qpcr反应体系成分体积/μl(5×)twostepqpcrmix410μmccdc-nprimer0.2510μmfl-n-ap5930.25rox0.1depc水10.4rna5表46rt-pcr反应体系1成分体积/μl5×)probeonesteprt-qpcrmix410×rtasemix210μmccdc-nprimer0.2510μmfl-n-ap5930.25rox0.1depc水8.4rna5表47.qpcr及rt-pcr上机程序2.3.样品稀释及标准曲线制备将处理干净的rna使用bioradddpcr定量，之后使用稀释液(te缓冲液+0.25u/μlrnaseinhibitor+10pg/μlttrna)10梯度稀释进行标准曲线制备，此外稀释两个低浓度拷贝数标准品rna进行后续实验，低浓度拷贝数选择100copies/μl及12.5copies/μl。rna稀释操作步骤详见表48。表48.rna稀释操作步骤2.4.rt-pcr检测反应将稀释好的标准品rna进行标准曲线制定；同时，固定标准品拷贝数，进行质控品浓度梯度检测。rt-pcr反应体系配制详见表49，配置好pcr反应mix(除质控品外的其他成分)后开始加样，加样时每个反应孔先加入15μl配制好的mix，然后再加入5μl质控品或待测样本。表49：rt-pcr反应体系22.5.仪器检测加样完成后，在abiivva7上检测样品信号，其中上机程序同表47，其中fam通道检测质控品或临床样本s基因，vic(hex)通道检测质控品或临床样本n基因，cy5通道检测内源人gapdh基因，rox(ap593)通道检测标准品中的s基因或n基因。3.实验结果3.1.标准品n基因浓度梯度标准曲线制定对母液浓度为2.4×106的标准品n基因参照表48进行10倍梯度稀释6个梯度，然后进行了单通道信号检测，选择了rox通道检测标准品n基因的信号强度，以拷贝数的对数为横坐标，ct值为纵坐标，计算出了标准品n基因的浓度梯度标准曲线，结果如图27，公式为y＝-3.284x+38.363，其中v代表一定拷贝数测得的ct值，k为-3.284，可参照这个公式计算出相应拷贝数的对数，从而计算出拷贝，对病毒拷贝数进行准确的定量，而r2＝0.9998，说明结果可信。3.2.可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型测定固定标准品n基因的拷贝数，对质控品rna进行了梯度检测，3对引物4个探针，选择4色通道对可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型测定，比对质控品和标准品定量是否准确，同时检测质控品的检测灵敏度。选择标准品n基因拷贝数100copies/rxn和12.5copies/rxn进行质控品梯度检测，结果如表50和表51。表50.可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qpcr测定结果1注：固定标准品n基因检测浓度为100copies/rxn；na表示：未检测到ct值。表51可掺入待测样本的阳性标准品和质控品参数模型qpcr测定结果2注：固定标准品n基因检测浓度为12.5copies/rxn；na表示：未检测到ct值。结果发现，在标准品n基因拷贝数为100copies/rxn，ct值平均值为28.62，与质控品rna100拷贝数时ccdc-n-hex组的ct值28.67接近，说明定量比较准确；在标准品n基因拷贝数为12.5copies/rxn，ct值平均值为33.3，与质控品rna12.5拷贝数时ccdc-n-hex组的ct值有2个ct的差异。以上结果说明本方法所建立的参数模型较为准确，可用于人群对新型冠状病毒携带者的筛选；对检测人群中有体温升高的，入院后诊断新型冠状病毒肺炎的重要依据之一；用于新冠病毒肺炎药物筛选、治疗方案的确定以及疗效的评估；利用该模型对新型冠状病毒rna载量(2019-ncov，sars-cov-2rnaload)的动态分布进行分析；还可以用于新型冠状病毒肺炎后期药物使用指导参考依据，是对甄别正在治疗的新冠肺炎患者是否可以出院，进入正常的生活社区的重要指标之一。3.3.新冠病毒阳性样本实验数据：使用与3.2相同的反应体系，将质控品rna替换为临床样本进行检测。检测结果如表52，临床样本为用已获中国审批的试剂盒检测过的5份阳性和5份阴性样本。其中样本1-4为阳性临床样本，样本5-9为阴性临床样本，样本10为阴性对照。结果如表11所示，其中mixc#1为50分子阳性标准品；mixc#3为200分子阳性标准品，在选择四色通道检测临床样本时，所有样本中的s靶标均未检测到信号，即noct(n等同noct)，所有样本均能检测到cy5和rox，即能检测到人源rna和掺入的标准品rna，说明整个反应正常，结果可信。本公司产品结果为样本1/3/4/5为阳性，样本2/6/7/8/9/10为阴性，与中国审批试剂盒结果有差异，即2号阳性样本被鉴定为阴性样本。所以，本产品可与其他公司同时检测进行综合分析，杜绝病毒携带者流入社会。表52.临床样本检测结果注：n靶标是指待测靶标为n；gapdh靶标，是指内标；rna-s靶标，是指可掺入内标。实施例13：人239细胞中新型冠状病毒受体ace2的mrna分子数的测定1.实验步骤采用qpcr&rt-pcr检测dna残留，采用one-steprt-ddpcr检测rna拷贝数浓度，质粒构建及qpcr检测的相关引物及探针如表53。带有掺入内标模拟病毒的制备(实施例2)、rna提取(实施例4中具体方法i)和ddpcr定量方法(实施例4方法iv)已在上述章节中表述。表53质粒构建及qpcr检测的相关引物及探针质控品全长序列见seqidno：50标准品(掺入内标)序列见seqidno：512.实验结果1)参入内标根据新冠实验方法进行rna拷贝数浓度的rt-ddpcr定量，结果显示混匀后分装的每份质控品rna(检测探针ace2-hex)的拷贝数浓度约为2×109copies/μl，标准品参入内标rna(检测探针ace2-rox)的拷贝数浓度约为1×109copies/μl。据我们已获得的资料信息，至今尚未有较好方法测定人体细胞中待测基因转录mrna分子数，在新冠病毒受体ace2的orf稳转细胞株中，将我们设计的掺入内标用于测定其中受体ace2mrna分子数。2)标准品及质控品引物扩增效率检测将体外转录制备的质控品rna及标准品rna浓度梯度稀释至10000/1000/100/10/0copies/rxn，检测引物扩增效率，确认标准品引物与质控品引物扩增效率一致。结果如表54、图29。表54引物扩增效率4)sl221-293trna及293trna质量检测使用表53中的引物及探针检测所提取的两种细胞rna的质量，结果如表55、表56所示，参照nanodropnd-1000微量紫外分光光度计检测结果，本次提取的rna质量较好，可用于后续检测。表55sl221-293trna质量检测表56293trna质量检测实施例14：可掺入的标准品对细胞内靶标ace2mrna定量结果的影响1.实验材料试剂：5×probesone-steprt-qpcrmix(genecopoeia)10×blazetaqtmrtasemix(genecopoeia)primer(ace2-1，ace2-2，gapdh)(金唯智)probe(ace2-hex，ace2-rox，gapdh-cy5)(上海百力格)sl221-293trna/293trna(genecopoeia)设备：abiviia7qpcr仪2.实验步骤1)按照质控品rna、可掺入标准品rna及sl221-293trna的预实验结果，参考ddpcr定量数据，在生物安全柜中将质控品rna、标准品rna、293trna分别进行梯度稀释，得到2000/200/20/2copies/μl的质控品rna、1000/100/50copies/μl标准品rna及1000/333/111/37/12/4/1/0pg/μl的sl221-293trna/293trna。2)在生物安全柜中进行rt-qpcr反应的配制，待测的靶标分别ace2-hex，ace2-rox；体系见表57，当检测质控品rna和标准品rna时，需要添加293trna模拟细胞检测情况；当检测细胞内ace2表达情况时，不用添加293trna。表57三重rt-qpcr反应体系组分体积5×one-steprt-qpcrmixforprobes5μl10×blazetaqrtasemix2.5ulace2-primerl0.25ulace2-primer20.25μlgapdh-primer0.25ulace2-hex-primerl0.25μlace2-rox0.25ulgapdh-cy50.25μl293trna1μl标准品rna(1000/100/50copies/μl)1μl质控品rna/sl293trna5μlddh2o10ul总计25ul3)体系配制完成后，在qpcr仪(abiviia7)上进行rt-pcr定量检测。3.实验结果1)标准品及质控品标准曲线制备标准品及质控品标准曲线如图30、图31所示。固定标准品掺入内标rna拷贝数时，质控品rna浓度梯度稀释，结果如表58所示；在固定质控品rna拷贝数时，标准品掺入内标rna浓度梯度稀释，结果如表59所示。表58固定标准品rna拷贝数，质控品rna浓度梯度检测表59固定质控品rna拷贝数，标准品rna浓度梯度检测结果分析：在质控品rna浓度为100copies/rxn时，检测ace2-hex的ct值与标准品rna100copies/rxn时ace2-rox的ct值差异不大，△ct为0.1，说明定量准确，反应体系良好。2)细胞内ace2表达情况检测在固定标准品rna拷贝数时，浓度梯度稀释sl221-293trna，检测ace2表达情况，结果如表60所示。表60固定标准品掺入内标rna拷贝数，sl221-293trna浓度梯度检测结果分析：参照质控品rna检测结果，ace2在细胞中转录的mrna分子数为50copies/10pgrna。因一个细胞提取的总rna约为10pg，即10pg/cell。因此，ace2在sl221-293t细胞中的表达情况约为50±5copies/cell。我们的结果表明本发明的掺入内标不仅可以用于生物体如rna(新冠2019-ncov)病毒拷贝数、病毒rna分子拷贝数的较精确测定。也可用于生物体细胞中内源基因，或用基因编辑方法整合到基因组中的外源基因，因在生理变化时和不同调节因素变化情况下，转录水平的评估和相关mrna分子数较精确测定，有着广泛地应用价值。当前第1页12当前第1页12