一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片的制作方法

本发明属于核酸检测领域，涉及微流控技术领域，具体涉及一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片。

背景技术：

微流控芯片也被称为“芯片实验室”(labonachip)，其目的是将生物、化学、医学分析过程中所涉及的样品预处理、加样、混合、反应、分离、检测等操作单元部分或全部集成于一块微米尺度的芯片上，通过控制芯片微通道内的液体流动，可以实现对待测物进行快速、准确、高通量的自动分析。

目前，微流控芯片已应用于核酸检测领域，通过芯片的集成，简化了核酸检测复杂流程。但目前大多数用于核酸检测的微流控芯片均需通过注射泵、气压泵或离心机等设备控制液体流入芯片内部，这些仪器的使用不利于实现核酸的现场检测。虽然纸基芯片可利用纸片吸水作用力实现液体流动，但纸基芯片一般为开放体系，容易受到环境干扰并且易造成扩增产物污染。

因此，发展无需泵或离心机等设备驱动进样的微流控芯片对实现基于微流控芯片的核酸现场检测至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片，该芯片无需额外进样驱动仪器与电力供应，仅需将样品与试剂加入进样孔即可自动将其吸入各通道与单元，通过在一张芯片上设置多个反应单元，还可实现一次对多样本多靶标同时进行核酸扩增检测；芯片进样完成后可封闭进样口，使核酸扩增检测反应均在密闭的芯片内部完成，有效防止扩增产物的交叉污染。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片，该芯片是由基片(1)与盖片(2)键合而成的仅有一个加样孔的封闭芯片，所述的基片(1)上设有进样孔(3)、进样主通道(4)、反应单元(7)、真空腔(5)和真空通道(6)；所述的反应单元(7)通过桥接通道(8)与所述的进样主通道(4)相连通，所述进样主通道(4)的一端连通所述的进样孔(3)；所述的真空腔(5)与所述的真空通道(6)相连通，所述的真空腔(5)与反应单元(7)之间通过透气性隔膜(9)相间隔；所述的盖片(2)上设有与所述的进样孔(3)相配合的加样孔(10)。

所述反应单元(7)内可预载扩增检测所需试剂，所述芯片的材质为聚二甲基硅氧烷，其具有透气性，芯片预先放置在真空环境中可使芯片内部及设置的真空腔(5)与真空通道(6)形成负压，通过设置的透气性隔膜(9)使各反应单元(7)内也形成负压，从而通过桥接通道(8)与进样主通道(4)将加样孔(10)内液体吸入到反应单元内。由于材料透气较慢，会使芯片离开真空环境的一定时间内均具有自动吸液能力，从而实现自动进样。

作为一种优选技术方案，所述的桥接通道(8)与反应单元(7)重复设置在所述进样主通道(4)的左右两侧，可设置1个以上。所述反应单元个数可根据需要灵活设置，不同反应单元内预载不同靶标的扩增引物与检测探针，可实现核酸多重检测。

作为一种优选技术方案，所述桥接通道(8)的深度低于所述反应单元(7)与主通道(4)的深度。所述的桥接通道(8)深50μm，宽800μm，所述的反应单元(7)直径1.5mm，深300μm，所述的进样主通道(4)宽500μm，深300μm，所述的进样孔(3)直径1～8mm。由于桥接通道(8)深度低于反应单元(7)与主通道(4)深度，反应单元(7)与进样主通道(4)之间由桥接通道(8)形成较高的台阶，可有效防止反应单元内液体的回流，避免各单元间相互干扰。

作为一种优选技术方案，所述的真空腔(5)设置在所述反应单元(7)的外侧，深300μm，完全封闭。由于真空腔不与外界联通，再加上聚二甲基硅氧烷的透气性，将芯片在-95kpa除气5-30分钟以后真空腔内的空气会被排出，形成负压。

作为一种优选技术方案，所述的真空腔(5)与反应单元(7)之间的透气性隔膜(9)的宽度为300μm。反应单元(7)内的空气通过透气性隔膜渗透到外侧的真空腔内，使反应单元的内形成负压，因此加样孔液体会自动通过主通道(4)与桥接通道(8)流向反应单元(7)。

作为一种优选技术方案，所述的反应单元(7)内预载包括特异性引物探针、酶、酶的激活剂的核酸扩增检测用试剂，配合温控与检测装置，能够在芯片内完成包含重组酶聚合酶反应、环介导等温扩增反应、核酸侵入反应、聚合酶链式扩增反应等在内的核酸扩增反应。

作为一种优选技术方案，所述基片(1)的基质为聚二甲基硅氧烷，所述的基片(1)与盖片(2)经等离子处理后键合形成仅有一个加样孔的封闭芯片；所述芯片的上表面与下表面贴有高透光性、无自发荧光、无透气性的密封膜。芯片-95kpa除气后真空包装，可长时间放置，随拆随用，芯片始终保持真空自动进样性能。

作为一种优选技术方案，该芯片的基片(1)与盖片(2)的厚度为3-5mm。

作为一种优选技术方案，该芯片在抽真空5-30分钟后，由于聚二甲基硅氧烷材料的透气性会使芯片内部保持一段时间负压，可将液体从加样孔吸入芯片主通道与桥接通道，并最终流入反应单元。

与现有技术相比，本发明具有以下特点及优势：

(1)芯片利用材料透气性可预先抽真空形成内部真空腔负压，使用时无需进样驱动仪器与电力供应即可实现自动进样；

(2)芯片在进样主通道两侧设置多个反应单元，可实现核酸多重检测；

(3)反应单元与进样主通道之间桥接通道的设置可形成阻隔台阶，有效避免反应单元内体系外流，防止各反应单元间相互干扰；

(4)芯片的反应单元通过预载不同试剂可以适配环介导等温扩增反应、重组酶聚合酶反应、核酸侵入反应、pcr扩增反应等，应用范围广。

附图说明

图1为一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片的爆炸图；

图2为一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片的基片俯视图；

图3为本发明芯片的细节放大图。

图4为本发明芯片的组装图。

其中，1.基片；2.盖片；3.进样孔；4.进样主通道；5.真空腔；6.真空通道；7.反应单元；8.桥接通道；9.透气性隔膜；10.加样孔。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片、制备方法及使用方法

如图1～3所示，一种可自动进样的核酸多重检测微流控芯片，该芯片是由基片1与盖片2键合而成的仅有一个加样孔的封闭芯片，所述的基片1上设有进样孔3、进样主通道4、反应单元7、真空腔5和真空通道6；所述的反应单元7通过桥接通道8与所述的进样主通道4相连通，所述进样主通道4的一端连通所述的进样孔3；所述的真空腔5与所述的真空通道6相连通，所述的真空腔5与反应单元7之间通过透气性隔膜9相间隔；所述的盖片2上设有与所述的进样孔3相配合的加样孔10。

所述的桥接通道8与反应单元7重复设置在所述进样主通道4的左右两侧，可设置2～60个。所述反应单元个数可根据需要灵活设置，不同反应单元内预载不同靶标的扩增引物与检测探针，可实现核酸多重检测。

所述反应单元7内可预载扩增检测所需试剂，所述芯片的材质为聚二甲基硅氧烷，其具有透气性，芯片预先放置在真空环境中可使芯片内部及设置的真空腔5与真空通道6形成负压，通过设置的透气性隔膜9使各反应单元7内也形成负压，从而通过桥接通道8与进样主通道4将加样孔10内液体吸入到反应单元内。由于材料透气较慢，会使芯片离开真空环境的一定时间内均具有自动吸液能力，从而实现自动进样。

作为一种优选技术方案，所述桥接通道8的深度低于所述反应单元7与主通道4的深度。所述的桥接通道8深50μm，宽800μm，所述的反应单元7直径1.5mm，深300μm，所述的进样主通道4宽500μm，深300μm，所述的进样孔3直径4mm。由于桥接通道8深度低于反应单元7与主通道4深度，反应单元7与进样主通道4之间由桥接通道8形成较高的台阶，可有效防止反应单元内液体的回流，避免各单元间相互干扰。

所述的真空腔5设置在所述反应单元7的外侧，深300μm，完全封闭。由于真空腔不与外界联通，再加上聚二甲基硅氧烷的透气性，将芯片在-95kpa除气5-30分钟以后真空腔内的空气会被排出，形成负压。

所述的真空腔5与反应单元7之间的透气性隔膜9的宽度为300μm。反应单元7内的空气通过透气性隔膜渗透到外侧的真空腔内，使反应单元的内形成负压，因此加样孔液体会自动通过主通道4与桥接通道8流向反应单元7。

所述的反应单元7内预载包括特异性引物探针、酶、酶的激活剂等的核酸扩增检测用试剂，配合温控与检测装置，能够在芯片内完成包含重组酶聚合酶反应、环介导等温扩增反应、核酸侵入反应、聚合酶链式扩增反应等在内的核酸扩增反应。

所述基片1的基质为聚二甲基硅氧烷，所述的基片1与盖片2经等离子处理后键合形成仅有一个加样孔的封闭芯片；所述芯片的上表面与下表面贴有高透光性、无自发荧光、无透气性的密封膜。芯片-95kpa除气后真空包装，可长时间放置，随拆随用，芯片始终保持真空自动进样性能。

该芯片的基片1与盖片2的厚度为3-5mm。该芯片在抽真空5-30分钟后，由于聚二甲基硅氧烷材料的透气性会使芯片内部保持一段时间负压，可将液体从加样孔吸入芯片主通道与桥接通道，并最终流入反应单元。

上述可自动进样的核酸多重检测微流控芯片的制备方法：

autocad绘制芯片结构图，主要包括以下细节：桥接通道8与反应单元7重复设置在进样主通道4左右两侧，可设置2～60个，桥接通道8宽800μm，深50μm，反应单元7直径1.5mm，深300μm，进样主通道(4)宽500μm，深300μm，进样孔3直径4mm，真空腔5设置在反应单元7外侧，深300μm，完全封闭，真空腔5与反应单元7之间的透气性隔膜9的宽度为300μm。

上述结构加工掩膜，整个芯片有两种深度，其中300μm深度的结构加工铬版掩膜，50μm深度的结构加工菲林掩膜。

准备一片4英寸硅片，依次使用超纯水、异丙醇冲洗干净，氮气吹干后放置在150℃热板上烘烤30min，使其表面达到强憎水状态。

第一层铺胶，将硅片放置在匀胶机中，开启真空吸附固定硅片，加4mlsu-82050到硅片中心位置，转速500rpm10s，1725rpm30s。第一次曝光前烘，65℃1min，95℃7min。第一次曝光，光强12mw/cm²泛曝光，15s。曝光后烘，65℃1min，95℃7min。

第二层铺胶，将硅片放置在匀胶机中，开启真空吸附固定硅片，加4mlsu-82150到硅片中心位置，转速500rpm10s，2150rpm30s。第二次曝光前烘，65℃5min，95℃50min。第二次曝光，光强12mw/cm²接近式曝光，35s。曝光后烘，65℃5min，95℃25min。

显影，将模具放入显影液中不停晃动，持续20min，再依次使用新鲜的显影液、异丙醇冲洗。氮气吹干，备用。

将聚二甲基硅氧烷预聚物与固化剂10：1比例混合，-95kpa除气后浇筑到上述的模具表面20g，同时在洁净的玻璃板表面倾倒20g，之后-95kpa除气，80℃放置2h。

将固化的聚二甲基硅氧烷从模具表面揭下，并进行切割，此为基片，厚3mm。将固化的聚二甲基硅氧烷从玻璃板表面揭下，按基片大小切割，并在进样孔对应的位置打孔作为加样孔，此为盖片，厚3mm。

在基片反应单元加入引物、酶、酶激活剂，并真空干燥。

将基片与盖片待键合面等离子处理，空气源，18w，60s。处理完成后迅速将基片与盖片贴合，按压静置30min。

芯片表面贴附pcr用96孔板密封膜，-95kpa排气5-30分钟后真空包装。至此芯片制备完成，待使用时直接拆开加样。

上述可自动进样的核酸多重检测微流控芯片的使用方法：

本发明的芯片内可以适用多种核酸检测方法，这里以基于重组酶聚合酶反应的核酸检测为例。

在芯片制备过程的试剂预载阶段，将2×浓度的待检测病原体对应的特异性引物及探针点在反应单元处，真空干燥后等离子处理键合基片与盖片。

将预载引物探针且键合好的芯片贴上密封膜并在-95kpa抽真空30min，取出后真空袋包装储存。

配制重组聚合酶反应体系，加入待测核酸样本，混合好后加入芯片加样孔。待反应体系填充完所有反应单元后将加样孔10贴胶带密封，37℃恒温孵育30min。

在470-480nm波长的led灯下用手机对芯片进行拍照检测，手机摄像头前预置518nm滤光片用于采集阳性反应单元内的发射光。拍照显示强绿色荧光的反应单元为阳性，无荧光或微弱荧光的反应单元为阴性。由于每个与反应单元内加入的是不同引物，因此不同的反应单元可以检测不同的核酸靶标。

以上描述了本发明的原理、主要特征及优点，本芯片适用范围广，不受上述实施例的限制。在不脱离本发明的原理及主要特征的前提下还会有各种改进调整，如各个腔室(反应单元、试剂预载单元、真空腔)的大小、深度、位置做出一些变化，这些变化都在本发明要求的保护范围内。