白桦BpYAB1基因及其在创制卷曲叶白桦中的应用

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及白桦bpyab1基因及其在创制卷曲叶白桦中的应用。

背景技术：

白桦(betulaplatyphyllasuk.)是亚洲东部广布的落叶乔木品种，树干可达25米高，50厘米粗，木质坚硬，质地细白，其叶厚纸质，常为三角状卵形、三角状菱形或三角形，边缘具重锯齿，有时具缺刻状重锯齿或单齿。白桦除作为观赏树种外，在家具、建材、造纸等方面具有广泛用途，是非常重要的阔叶树种之一。

yabby家族是植物特有的转录因子，在植物器官形成、生长发育、信号转导以及胁迫响应等生物学过程发挥着重要调控作用。目前已经报道yabby基因家族中含有6个成员:crabsclaw(crc)、filamentousflower(fil)、yabby3(yab3)、innernoouter(ino)、yabby2(yab2)和yabby5(yab5)。然而现有技术中鲜有对白桦yabby家族基因的序列测定与功能研究的报道。

植物叶片的卷曲与接受光照、植物失水率、抗逆性等有密切关系。合适的叶片卷曲度可以提高植物叶片的直立性，增加植株的透光性，提高光合产量。因此，构建叶片卷曲的白桦，对后续针对白桦的品种改良与种植方法改进的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供白桦bpyab1基因及其在创制卷曲叶白桦中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过过表达白桦bpyab1基因使得转基因白桦叶片卷曲。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案之一，提供了一种白桦bpyab1基因，所述的白桦bpyab1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

技术方案之二，提供了一种所述的白桦bpyab1基因编码的蛋白质，所述的白桦bpyab1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。

技术方案之三，提供了一种包含所述的白桦bpyab1基因的表达载体。

在一些优选的实施方案中，所述包含所述的白桦bpyab1基因的表达载体为包含所述的白桦bpyab1基因的pgwb111质粒。

技术方案之四，提供了一种所述的白桦bpyab1基因或所述的蛋白质或所述的任一表达载体在白桦叶片卷曲程度调控中的应用。

技术方案之五，提供了一种卷曲叶白桦的创制方法，根据所述的白桦bpyab1基因序列构建表达载体，采用农杆菌介导法导入白桦中，使得转基因白桦中bpyab1基因过表达，叶片卷曲。

在一些优选的实施方案中，所述的表达载体采用gateway技术构建。

本发明公开了以下技术效果：

本发明首次公开了白桦中yabby家族基因bpyab1，并证明了其具有调控白桦叶片卷曲程度的功能。本发明基于白桦bpyab1基因序列，采用gateway法构建了bpyab1基因过表达载体，并采用农杆菌转化法将bpyab1基因转入白桦中，使得转基因白桦中bpyab1基因过表达，叶片出现卷曲。本发明提供了一种简单可行的卷曲叶白桦的创制方法，进一步加深了对白桦yabby家族功能的了解，为后续对白桦的进一步研究及育种提供了有用的工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为白桦bpyab1基因的扩增结果图；图中m为marker2000，1为扩增的bpyab1基因片段；

图2为转化入门载体单菌落的pcr电泳图；图中m为marker2000，1为水对照，2为阳性对照-bpyab1胶回收产物，3-6为pcr鉴定为阳性的单菌落，7为未转化成功的单菌落；

图3为构建成功的植物表达载体pgwb111-bpyab1质粒图谱；

图4为转入重组质粒pgwb111-bpyab1的农杆菌pcr电泳图；图中m为marker2000，1为水对照，2为构建成功的pentry质粒，为阳性对照，3为lr反应后的阳性克隆；

图5为白桦合子胚遗传转化过程图；

图6为白桦bpyab1过表达植株pcr检测电泳图；图中m为marker2000，1为水对照，2为wt野生型dna为模板，3为质粒阳性对照，4-6分别为oe2、oe3、oe9转基因株系dna为模板；

图7为wt、oe2、oe3、oe9株系中bpyab1表达量；

图8为白桦过表达植株的表形观察图；

图9为不同株系的侧卷系数图；

图10为不同株系的纵卷系数图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本发明所使用的材料、试剂及仪器如无特殊说明，均可由常规商业途径获得；所采用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法。

本发明公开的白桦bpyab1基因核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列来源于白桦叶脉发育转录组中差异表达的基因，如seqidno.1和seqidno.2所示：

atgtcctcctcttctaccttgtctttggaccaccttcctccctccgagcagctctgttatgttcattgcaacatttgcgacactgttctcgcggtgagtgtcccttgcaccagtttgttcaagactgtaacggtaagatgtggccactgcaccaacctcctaccggtcaacatgcgagggttgctcctgccttcggccaatcagtttcatctgggtcactctttcttctcttcttcccataatcttctggaagagataccaaatccaacgccaaacttcttgatcaaccaaaccaatgcgagtgaattcactatgcctgcacggggaggagtcgatgagcttccccggcccccagtcataaatagacctccggagaagagacagagagttccctcagcgtacaaccgcttcatcaaggacgagatccaacgcatcaagtccgtaaatcccgatatatcccacagagaagccttcagcgccgctgccaagaattgggcccacttcccacacattcactttggtctcatgcctgaccagactgtgaagaagacaaacgtccgccagcaggaaggagaggatgtcctgatgaaagatgggtatttcgcttcagctaatgtgggtgtttctccctactaa(seqidno.1)。

msssstlsldhlppseqlcyvhcnicdtvlavsvpctslfktvtvrcghctnllpvnmrglllpsanqfhlghsffssshnlleeipnptpnflinqtnaseftmparggvdelprppvinrppekrqrvpsaynrfikdeiqriksvnpdishreafsaaaknwahfphihfglmpdqtvkktnvrqqegedvlmkdgyfasanvgvspy*(seqidno.2)。

实施例1

1、白桦bpyab1基因的扩增

根据白桦bpyab1基因cds序列636bp，去掉taa终止密码子，设计引物(f：caccatgtcctcctcttctaccttgtcr：gtagggagaaacacccacattag)进行扩增，为进行后续的入门载体连接上游引物前面需加cacc，扩增模板为白桦野生型dna，1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr条带，以获取目的片段。

pcr扩增反应体系为50μl反应体系：水10.5μl，buffer25μl，引物1.5μl，模板2μl，酶1μl，dntp10μl。

pcr扩增反应程序为：预变性94℃，2min；变性98℃，10s；退火55℃，30s；延伸68℃，30s；共35循环。

克隆结果如图1所示，显示白桦bpyab1基因克隆成功。

2、bpyab1基因与入门载体的连接

使用gateway克隆方法进行载体的连接，首先使用胶回收试剂盒，对bpyab1目的条带进行纯化回收，按照pentr/sd/d-topo试剂盒说明书进行topo反应，将pcr纯化产物、缓冲液、pentry-topo载体、水，混匀室温静置30min连接。将连接完毕的混合液加入大肠杆菌感受态进行热激：冰上静置30min后在42℃水浴锅中热激60s，立即埋入冰中静置1min，空lb复苏1h后涂板含卡那霉素的固体lb。第二天挑取5个单菌落，进行pcr检测，在浓度为1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，如图2所示，对已转入成功的单菌落摇菌培养，并送测序验证。

3.bpyab1基因与植物表达载体的连接

对测序验证正确的大肠杆菌提取质粒，使用gatewaylrclonasetmiienzymemix试剂盒进行lr反应。加入penyry质粒，目的植物表达载体pgwb111质粒，水，enzymemix混匀，25℃孵育1h，加入proteinasek，37℃孵育10min。连接后的混合液热激转化大肠杆菌感受态，涂板含有壮观霉素的固体lb。第二天挑取单菌落送测序，测序正确的大肠杆菌提取质粒，即pgwb111-bpyab1。构建成功的pgwb111-bpyab1质粒图谱如图3所示。

4.电击转化农杆菌

将重组质粒pgwb111-bpyab1通过电击转化法导入到eha105农杆菌感受态细胞中。涂板含有壮观霉素和利福平的固体lb。2天后挑取单菌落进行pcr检测，引物一端设计在基因上，另一端设计在载体上。在1％琼脂糖凝胶中电泳，检测结果如图4所示，检测为阳性的单菌落作为侵染植物用的工程菌保存。

5.合子胚法遗传转化

实验前一天摇菌含目的质粒的农杆菌，液体lb中加入利福平和壮观霉素，28℃培养过夜至od600＝0.8，在10ml空lb中加入2ml摇好的菌液，进行二次活化至od600＝0.8，作为侵染液。实验前将白桦种子在室温下，活水中浸泡两天至种子能沉于水底，将种子捞出消毒，75％乙醇消毒45s，20％双氧水消毒15min备用。用沾了侵染液的手术刀，将种子纵切，放于共培养培养基上(wpm+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)，暗培养两天后，将种子转移到筛选培养基上(wpm+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+50mg/lhyg)，在抗性筛选下获得转化子若干，诱导不定芽(另加+0.5mg/lga)并使其生根(wpm+0.4mg/liba)，生根后移入人工气候室，遗传转化过程如图5所示。

6.白桦bpyab1过表达植株pcr检测

将获得的转基因株系oe2、oe3、oe9提取dna，经过pcr扩增，pcr产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，结果如图6所示：在转基因植株中能扩增出抗性基因目的条带，且位置与阳性质粒对照一致，而野生型中没有，从而确定外源bpyab1已经插入到白桦的基因组中。

7.白桦过表达植株中bpyab1表达量检测

对野生型和转基因白桦的叶片提取rna，并进行反转录，qrt-pcr检测pp2c1基因的表达量，按照2-△△t方法计算基因的表达量，结果如图7所示，证明外源bpyab1基因不但成功插入白桦基因组中，并且成功过表达了，oe2、oe3、oe9表达量是wt的75倍、529倍、2121倍。

8.白桦过表达植株的表形观察

对45天的白桦进行表型观察拍照，结果如图8所示，可观察到植物的叶片向下卷曲。

以每株系十棵苗的一叶、二叶、三叶为对象，测量自然状态下的叶宽叶长和拉平状态下的叶宽叶长。如叶片两边上卷，则侧卷指数＝[自然叶宽(cm)/拉平叶宽(cm)-1)]x100％，如叶片两边下卷，则侧卷指数＝[1-自然叶宽(cm)/拉平叶宽(cm)]x100％。纵卷指数＝[1-自然叶长(cm)/拉平叶长(cm)]x100％。统计侧卷指数(图9)可以发现，野生型wt的叶片两边上翘，侧卷指数为负数，而bpyab1过表达转基因植株叶片的卷曲指数大于wt，叶片两边下卷，其中oe9的卷曲程度最高，oe2次之，oe3最低。统计纵卷指数(图10)可以发现，白桦叶片的纵卷指数总是大于0，但过表达bpyab1后，叶片在纵向的卷曲程度增大，其中oe9的卷曲程度最高，oe2次之，oe3最低。

上述结果表明，bpyab1在白桦中的过表达可以导致白桦叶片的下卷。以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>东北林业大学

<120>白桦bpyab1基因及其在创制卷曲叶白桦中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>636

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtcctcctcttctaccttgtctttggaccaccttcctccctccgagcagctctgttat60

gttcattgcaacatttgcgacactgttctcgcggtgagtgtcccttgcaccagtttgttc120

aagactgtaacggtaagatgtggccactgcaccaacctcctaccggtcaacatgcgaggg180

ttgctcctgccttcggccaatcagtttcatctgggtcactctttcttctcttcttcccat240

aatcttctggaagagataccaaatccaacgccaaacttcttgatcaaccaaaccaatgcg300

agtgaattcactatgcctgcacggggaggagtcgatgagcttccccggcccccagtcata360

aatagacctccggagaagagacagagagttccctcagcgtacaaccgcttcatcaaggac420

gagatccaacgcatcaagtccgtaaatcccgatatatcccacagagaagccttcagcgcc480

gctgccaagaattgggcccacttcccacacattcactttggtctcatgcctgaccagact540

gtgaagaagacaaacgtccgccagcaggaaggagaggatgtcctgatgaaagatgggtat600

ttcgcttcagctaatgtgggtgtttctccctactaa636

<210>2

<211>211

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metserserserserthrleuserleuasphisleuproproserglu

151015

glnleucystyrvalhiscysasnilecysaspthrvalleualaval

202530

servalprocysthrserleuphelysthrvalthrvalargcysgly

354045

hiscysthrasnleuleuprovalasnmetargglyleuleuleupro

505560

seralaasnglnphehisleuglyhisserphepheserserserhis

65707580

asnleuleuglugluileproasnprothrproasnpheleuileasn

859095

glnthrasnalasergluphethrmetproalaargglyglyvalasp

100105110

gluleuproargproprovalileasnargproproglulysarggln

115120125

argvalproseralatyrasnargpheilelysaspgluileglnarg

130135140

ilelysservalasnproaspileserhisargglualapheserala

145150155160

alaalalysasntrpalahispheprohisilehispheglyleumet

165170175

proaspglnthrvallyslysthrasnvalargglnglngluglyglu

180185190

aspvalleumetlysaspglytyrphealaseralaasnvalglyval

195200205

serprotyr

210