一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体及其应用的制作方法

本发明涉及一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

肌钙蛋白(troponin，tn)是横纹肌收缩的一种调节蛋白，是骨骼肌和心肌的结构蛋白，由tnt、tnc和tni3个亚基组成的复合体，与原肌球蛋白一起和肌动蛋白结合，90％位于横纹肌肌丝上，参与调节肌肉收缩。其中，tnt是原肌球蛋白结合亚基，调节肌钙蛋白复合物和细肌丝间的相互作用；tnc是钙离子结合亚基，对于钙离子依赖型的肌肉收缩起主要调节作用，而tni是肌钙蛋白-肌球蛋白调节复合物中的抑制蛋白，起防止肌肉收缩的作用。当心肌缺血导致心肌损伤时，胞浆中游离的少量心肌肌钙蛋白i(ctni)迅速释放进入血液循环，外周血中浓度迅速升高。随着心肌肌丝持续的降解，ctni不断释放进入血液，于12-18h后达峰值，ctni升高持续时间为4-10d。ctni在骨骼肌中不表达，其生化性质决定了其作为心肌损伤指标的高度特异性和敏感性，特别是当心电图检测无异常时，可以用ctni指标作为辅助判断。因此有必要针对ctni的检测进行进一步的研究和改善。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体，该适配体适用于多种蛋白的寡核苷酸检测方法，具有更大的检测区间，消除了钩状效应，检测灵敏度更高。

本发明的第二个目的在于提供一种上述心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体的应用。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体，适配体的序列为seqidno.1-10之一，或适配体为与序列seqidno.1-10之一功能等同的变体。

进一步地，心肌肌钙蛋白为心肌肌钙蛋白i。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体的应用，制备包括适配体的药物。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：制备包括适配体的试剂盒。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：为将适配体用于非诊断目的心肌肌钙蛋白的检测。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：为将适配体用于心肌肌钙蛋白的分离纯化。

进一步地，心肌肌钙蛋白的分离纯化包括：

封闭步骤：以封闭液封闭经孵育的样品；

结合步骤：在经封闭处理的样品中加入经生物素修饰的适配体，温育后除去液体，得到适配体和蛋白的结合物；

洗涤步骤：将结合物进行洗涤。

进一步地，心肌肌钙蛋白的分离纯化包括：

封闭步骤：在链霉亲和素中加入经生物素修饰的适配体，温育后除去液体，以封闭液封闭适配体；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中加入样品进行孵育，再加入经地高辛修饰的适配体进行温育，得到适配体和蛋白的结合物；

洗涤步骤：将结合物进行洗涤。

进一步地，心肌肌钙蛋白的分离纯化包括：

封闭步骤：在链霉亲和素中加入经生物素修饰的适配体，温育后除去液体，以封闭液封闭适配体；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中加入样品进行孵育，再加入心肌肌钙蛋白抗体进行温育，得到适配体、蛋白和抗体的结合物；

洗涤步骤：将结合物进行洗涤。

进一步地，心肌肌钙蛋白的分离纯化包括：

封闭步骤：将心肌肌钙蛋白抗体以封闭液进行封闭；

结合步骤：在经封闭处理的心肌肌钙蛋白抗体中加入样品进行孵育，再加入经地高辛修饰的适配体进行温育，得到以抗体、蛋白和适配体的结合物；

洗涤步骤：将结合物进行洗涤。

本发明的设计原理如下：

适配体(aptamer，又译为适体或适配子)，通常称为“化学抗体”，为短的单链dna或rna，是目前公认的最具潜力的靶向物质。适配体制备过程可控且可以完全通过体外程序生产合成，批间差异低，无污染或低污染风险，具有方便，快速，成本低等优点，可通过各种修饰或偶联，运用于疾病诊断和治疗。

目前临床上对ctni的检测方法最灵敏的是蛋白抗体的试剂盒贝克曼化学发光检测方法，其检测限为0.5-50ng/ml，但是该方法有一个很明显的缺点就是有钩状效应(hook效应)。该效应是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性结果，其中抗体过量叫前带效应，抗原过量叫后带效应。也就是说当抗原含量高于50ng/ml时，用该方法就无法得出准确的结果，容易出现假阴性结果，会给临床医生或患者错误的提示，延误治疗或影响疗效判断。因此以消除hook效应作为研究的出发点，对适配体进行了进一步的研发。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的适配体可用于单适配体elona检测、双适配体夹心elona检测、适配体-抗体夹心elona检测、抗体-适配体夹心elona检测法，并具有更大的检测区间，消除了钩状效应，检测灵敏度更高；

2、本发明的适配体积小、稳定性好、易于生产，适配体能够被绑定到第二个分子上，适配体与第二个分子结合的结果是一个复合物，表现出两者功能的结合，即具有特异性结合能力的复合物，并具有与第二个分子相关的活性；

3、本发明的适配体用途多样，特别是用于心肌肌钙蛋白的分离纯化，纯化效果好。

附图说明

图1-10为实施例1的适配体二级结构示意图；

图11为适配体的斑点印迹图；

图12为实施例296bp文库量效曲线；

图13-22为实施例2seqidno.1-10适配体量效曲线；

图23为实施例3的标准曲线；

图24为实施例4的标准曲线；

图25为实施例5的标准曲线；

图26为实施例6的标准曲线；

图27为实施例7的标准曲线；

图28为实施例8的标准曲线；

图29为实施例9的标准曲线；

图30为实施例10的标准曲线；

图31为实施例11的标准曲线。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种心肌肌钙蛋白i的寡核苷酸适配体，适配体的序列为seqidno.1-10之一，或适配体为与序列seqidno.1-10之一功能等同的变体。

功能等同的变体是指与seqidno.1-10之一的序列基本相似，保持与心肌肌钙蛋白i特异结合的能力。也可以是从seqidno.1-10之一中衍生的核酸序列，包括多个核苷酸的添加、替换或修饰。例如可以由至少1个寡核苷酸修饰在seqidno.1-10之一的3’端或5’端，并且保持着至少50％的与心肌肌钙蛋白i的结合特异性。上述的修饰包括但不限于修饰核酸骨架、替代键、修饰核苷酸、修饰核酸肽链等。经过修饰的适配体，其对心肌肌钙蛋白i的特异结合能力至少有50％。

上述心肌肌钙蛋白i的寡核苷酸适配体的应用之一，为制备包括适配体的药物。

上述心肌肌钙蛋白i的寡核苷酸适配体的应用之一，为制备包括适配体的试剂盒。

上述心肌肌钙蛋白i的寡核苷酸适配体的应用之一，为将适配体用于非诊断目的心肌肌钙蛋白i的检测。

上述心肌肌钙蛋白i的寡核苷酸适配体的应用之一，为将适配体用于心肌肌钙蛋白i的分离纯化，为以下四种方法之一。

1)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：将样品20-2000μl置于酶标板中进行孵育，4℃过夜，除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭1-2h经孵育的样品；

结合步骤：在经封闭处理的样品中加入经生物素修饰的1-200nm适配体20-200μl，酶标板覆膜，37℃温育0.5-2h后除去液体，得到适配体和蛋白的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次。

此方法得到心肌肌钙蛋白i之后还可以对之进行检测：每孔加streptavidin/hrp20-200μl(1:5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min-1h；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液20-200μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约15-30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)。

2)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：在预包被链霉亲和素的酶标板中加入经50-200nm生物素修饰的适配体20-200μl，37℃温育0.5-2h后除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭适配体1-2h；50-200nm浓度范围下加入的适配体，能最大程度将链霉亲和素与生物素牢固结合，在最大成本效益下使适配体稳固吸附在酶标板上；温育温度在37℃时，适合发生反应；若封闭时间低于1h，则封闭效果不足，非特异性位点未被封闭完全，导致样品中的其他物质产生非特异性结合；若封闭时间大于2h，则封闭过量，导致本可以与适配体结合的蛋白结合不牢固而脱落；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中加入样品20-200μl在37℃条件下孵育1-4h，再加入50-200nm经地高辛修饰的适配体50-200μl，酶标板覆膜，37℃温育0.5-2h，得到适配体和蛋白的结合物；

此浓度范围下的适配体可与目标蛋白充分结合，使得适配体与目标蛋白均在最适比例，避免了抗原-抗体结合产生的hook效应；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次；

洗涤液能将非特异性结合的其他蛋白和杂质除去，最大限度保留了适配体与目标蛋白的结合复合物。

此方法得到心肌肌钙蛋白i之后还可以对之进行检测：每孔加抗地高辛抗体/hrp20-200μl(1:500-5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液20-200μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约15-30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)；

该方法以生物素修饰的适配体为底物捕获目的蛋白，以地高辛修饰的适配体对目的蛋白进行定性定量分析，形成适配体-蛋白-适配体的三明治夹心结构；同时，固定与酶标使用不同的系统，有效避免交叉反应，避免假阳性的发生。该方法中适配体与目的蛋白结合的浓度范围较大，有效避免了抗原-抗体反应中因未达到抗原与抗体之间最优的浓度比例而产生的hook效应；同时，适配体作为一种dna序列具有的自身稳定性和低免疫原性，是抗体所无法达到的优势。

3)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：在预包被链霉亲和素的酶标板中加入50-200nm经生物素修饰的适配体100μl，37℃温育0.5-2h后除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭适配体1-2h；

浓度范围下加入的适配体，能最大程度将链霉亲和素与生物素牢固结合，在最大成本效益下使适配体稳固吸附在酶标板上；温育温度在37℃时，适合发生反应；若封闭时间低于1h，则封闭效果不足，非特异性位点未被封闭完全，导致样品中的其他物质产生非特异性结合；若封闭时间大于2h，则封闭过量，导致本可以与适配体结合的蛋白结合不牢固而脱落；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中加入样品20-200μl在37℃条件下进行孵育1-4h，再加入心肌肌钙蛋白抗体(1:100-1000稀释)50-200μl在37℃下温育0.5-2h，弃去液体，得到适配体、蛋白和抗体的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次；

洗涤液能将非特异性结合的其他蛋白和杂质除去，最大限度保留了适配体与目标蛋白的结合复合物。

此方法得到心肌肌钙蛋白i之后还可以对之进行检测：每孔加二抗/hrp50-200μl(1:500-10000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液50-200μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约15-30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)。

该方法以适配体为底物捕获目的蛋白，以抗体为酶标物对目的蛋白进行定性定量分析，形成适配体-蛋白-抗体的三明治夹心结构。此方法实现了适配体与抗体的共同作用，发挥了各自优势。

4)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：预包被心肌肌钙蛋白抗体的酶标板以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)进行封闭0.5-2h；

若封闭时间低于1h，则封闭效果不足，非特异性位点未被封闭完全，导致样品中的其他物质产生非特异性结合；若封闭时间大于2h，则封闭过量，导致本可以与适配体结合的蛋白结合不牢固而脱落；

结合步骤：在经封闭处理的心肌肌钙蛋白抗体中加入样品20-200μl进行孵育1-4h，再加入50-200nm经地高辛修饰的适配体50-200μl酶标板覆膜，37℃进行温育1h，得到以抗体、蛋白和适配体的结合物；

此浓度范围下的适配体可与目标蛋白充分结合，使得适配体与目标蛋白均在最适比例，避免了抗原-抗体结合产生的hook效应；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次；

洗涤液能将非特异性结合的其他蛋白和杂质除去，最大限度保留了适配体与目标蛋白的结合复合物。

此方法得到心肌肌钙蛋白i之后还可以对之进行检测：每孔加抗地高辛抗体/hrp50-200μl(1:500-5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液50-200μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约15-30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)。

该方法以抗体为底物捕获目的蛋白，以适配体为酶标物对目的蛋白进行定性定量分析，形成抗体-蛋白-适配体的三明治夹心结构。此方法实现了适配体与抗体的共同作用，发挥了各自优势。

实施例1：

适配体的获得：

将96bp的ssdna文库(500-600pmol)序列两端为固定序列，中间60个核苷酸为随机序列，设计上游引物和下游引物，上游引物用生物素(biotin)进行标记，下游引物无标记，以ctni为正筛蛋白用量为10-200μg，以正常人血清为反筛蛋白用量为200-600μl；

ssdna经epcr扩增，扩增体系为：水相，ssdna模板0.1-3.3μg、1xpcrmix缓冲液25μl、上游引物50pmol、下游引物50pmol、补加去离子水到50μl；油相，在15ml离心管中加入5ml矿物油、270μlspan80、24μltween80、3μltritonx-100后加矿物油至6ml，旋涡混匀后4℃保存；按水相:油相＝2:1的比例配制pcr扩增体系；扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性40s，68℃退火1min，72℃再延伸7min。

采用epcr将每轮分离后的dna重新富集：dna溶于pbs中，通过一条带生物素标记链与霉亲和素磁珠结合，变性，从链亲和素磁珠上洗脱带生物素标记的链，用少量盐酸中和后，加入2倍体积无水乙醇于-80℃冰箱沉淀过夜，14000rpm/min离心40min，去掉上清，加入600μl70vt％乙醇洗涤再离心20min，空气中干燥后溶于少量pbs中，超微量紫外分光光度计测定ssdna浓度；

再制备单链次级文库，以进行下一轮selex筛选，epcr可减少非特异性条带的出现。约500-600pmol随机双链文库，加入到1.5ml离心管中，95℃变性5min，室温复性，加入到链霉亲和素磁珠中，摇床孵育30min后，加入naoh断开双链的氢键使没有标记的链脱落，然后加入心肌肌钙蛋白i重组蛋白孵育1h，上清使用酚氯仿法提取dna，加入1/10体积的乙酸钠溶液，2.5倍体积的无水乙醇，-80℃冰箱过夜沉淀ssdna；14000rpm离心40min后，75vt％乙醇洗涤一次，空气中干燥，溶于少量te或灭菌水中，紫外分光光度计测量ssdna浓度，用biotin标记的引物pcr扩增的dsdna用于下一轮筛选；

每一轮的筛选根据以下epcr体系选择富集的条件：l-mix25μl、水22μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl(浓度分别为1ng/μl、0.5ng/μl)；扩增条件：退火温度为72℃，71℃，70℃，69℃，68℃循环数分别为13、11、9。

重复以上步骤多轮的筛选后将epcr产物进行验证和测序：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，使用12wt％的聚丙烯酰胺凝胶在150v电压下电泳约40min，检测样品的完整性，检测合格的样品进入文库制备环节。

主要包括取足量基因组dna样品使用page胶进行目标片段选择并纯化；纯化后的dna根据试剂盒说明来进行末端修复加“a”及接头反应，并使用agencourtampurexp磁珠进行纯化；纯化后的产物通过page胶切胶回收目的片段，纯化后的文库溶于elutionbuffer中，贴上文库标签，至此文库构建完成。然后，进行文库质量检测，通常采用两种方法：一种是使agilent2100bioanalyzer检测文库的片段范围；另一种是使用abisteponeplusreal-timepcrsystem(taqmanprobe)对文库进行浓度的定量。

上机测序：先在毛细管中注入丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外线的电离作用下发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶，将dna片段混合物加入到有聚丙烯酰胺凝胶的一端，在毛细管的两端加上电压进行电泳，在毛细管的正极的末端用激光照射，经过光学传感器记录荧光信号。最后通过特定程序和标准选出特异性的寡核苷酸适配体：

适配体的序列为seqidno.1-10：

seqidno.1：cgtacggtcgacgctagccccggaggaagctcggtcaggggctatactgacaggctacagtaggtgtaccagctggcccacgtggagctcggatcc；

seqidno.2：cgtacggtcgacgctagcccactaggaggtcagcgaaaacagctaccgctgctcgccaaaggccagatccctatgtgccacgtggagctcggatcc；

seqidno.3：cgtacggtcgacgctagccggacacccaagtcagacgtgcccattatcgcgcgatacgtattatttcttgctcggggccacgtggagctcggatcc；

seqidno.4：cgtacggtcgacgctagcccagtcgttgcaggactactggcactacgaaaatttgccgttttaacgtctgtcgttgtggccacgtggagctcggatcc；

seqidno.5：cgtacggtcgacgctagccggcgaggatcagcccaaccattgctcgacttcacgttcactgggccgctcgcctgttgccacgtggagctcggatcc；

seqidno.6：cgtacggtcgacgctagcgcccacagcactgttgtctacagactacgctgcacgcaaacggggccgccttcgctccggcacgtggagctcggatcc；

seqidno.7：cgtacggtcgacgctagcccagtcgttgcaggactactggcactacgaaaatttgccgttttaacgtctgtcgttgtggccacgtggagctcggatcc；

seqidno.8：cgtacggtcgacgctagcccaacggttcgcatgtcactctccgtactggaagagaccgacaaaagggtcaatgctggccacgtggagctcggatcc；

seqidno.9：cgtacggtcgacgctagcccatcagtactttgacatggcggccaagtaccccgatcctcgcgataggaacctgcttgccacgtggagctcggatcc；

seqidno.10：cgtacggtcgacgctagcccactgtcaagtcctcgggccaacgcgcaaccaaacgcaggtagtattcccctccccccacgtggagctcggatcc；

序列为seqidno.1-10的适配体的二级结构分别如图1-10所示；

适配体也可以是与序列seqidno.1-10之一功能等同的变体。

斑点印迹法检测适配体与人心肌肌钙蛋白i结合的特异性：

将人心肌肌钙蛋白i标准品固定到nc膜上，加入1ml生物素修饰的适配体，在室温摇床下孵育1h，加入对应的二抗及显色剂在凝胶成像仪中观察。其中，人心肌肌钙蛋白i标准品的量为0.3μg/μl，适配体的加入量为50nm。序列为seqidno.1-10的适配体的斑点印迹图如图11所示。

实施例2：

单适配体elona检测

1)心肌肌钙蛋白i的分离纯化：

封闭步骤：将标准品5ng/μl心肌肌钙蛋白i置于酶标板中进行孵育，4℃过夜，除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭1h；

结合步骤：在经封闭处理的样品中加入经生物素修饰的1-200nm适配体seqidno.1-10各100μl，酶标板覆膜，37℃温育1h后除去液体，得到适配体和蛋白的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次。

2)检测步骤：

在每孔加streptavidin/hrp100μl(1:5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液100μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约15min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)。

图12为96bp文库量效曲线，在其他检测条件不变的情况下，将适配体换成dna文库进行量效曲线测定，根据该曲线计算kd值，通过dna文库的量效曲线计算的kd值其p＞0.05，说明该kd值没有统计学意义，曲线拟合没有成功，而kd值代表了该dna的亲和力，曲线拟合失败说明dna文库与心肌肌钙蛋白i结合的亲和力极低。seqidno.1-10适配体量效曲线分别如图13-22所示，10个适配体均具有较好的亲和力，解离平衡常数(kd值)范围在0.2558-9.2814nmol/l之间，说明所得到的适配体对心肌肌钙蛋白i的亲和力有明显提高，其中seqidno.10和seqidno.8的亲和力最高，kd值为0.2558nmol/l和0.6813nmol/l。

实施例3：

双适配体夹心elona检测

1)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：在预包被链霉亲和素的酶标板中加入经100nm生物素修饰的适配体seqidno.3100μl，37℃温育1h后除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭适配体1h；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中分别加入梯度浓度的心肌肌钙蛋白i标准品和人血清样品(以人血清蛋白为阴性对照)100μl在37℃条件下孵育2h，再加入50nm经地高辛修饰的适配体seqidno.6100μl，酶标板覆膜，37℃温育1h，得到适配体和蛋白的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次；

2)检测步骤：

每孔加抗地高辛抗体/hrp100μl(1:5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液100μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)，得到的标准曲线如图23所示。

实施例4：

实施例4与实施例3不同之处在于：

封闭步骤中，加入经50nm生物素修饰的适配体；

结合步骤中，加入心肌肌钙蛋白i标准品和人血清样品的量为50μl；

其余步骤和参数均与实施例3相同，得到的标准曲线如图24所示。

实施例5：

实施例5与实施例3不同之处在于：

结合步骤中，加入100nm经地高辛修饰的适配体；

其余步骤和参数均与实施例3相同，得到的标准曲线如图25所示。

实施例3-5的结果显示，适配体与人血清蛋白无特异性结合，该方法检测ctni的线性范围为0.2-100ng/ml。

实施例6：

适配体-抗体夹心elona检测

1)心肌肌钙蛋白i的分离纯化包括：

封闭步骤：在预包被链霉亲和素的酶标板中加入100nm经生物素修饰的适配体seqidno.3100μl，37℃温育1h后除去液体，以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)封闭适配体1h；

结合步骤：在经封闭处理的适配体中加入梯度浓度的心肌肌钙蛋白i标准品和人血清蛋白(以人血清蛋白为阴性对照)100μl在37℃条件下进行孵育2h，再加入心肌肌钙蛋白抗体(1:1000稀释)100μl在37℃下温育1h，弃去液体，得到适配体、蛋白和抗体的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次。

2)检测步骤：

每孔加二抗/hrp100μl(1:10000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液100μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)，得到的标准曲线如图26所示。

实施例7：

实施例7与实施例6不同之处在于：

封闭步骤中，加入50nm经生物素修饰的适配体；

结合步骤中，加入心肌肌钙蛋白i标准品和人血清蛋白50μl；

其余步骤和参数均与实施例6相同，得到的标准曲线如图27所示。

实施例8：

实施例8与实施例6不同之处在于：

封闭步骤中，加入50nm经生物素修饰的适配体；

结合步骤中，加入心肌肌钙蛋白抗体50μl；

其余步骤和参数均与实施例6相同，得到的标准曲线如图28所示。

实施例9：

抗体-适配体夹心elona检测法

封闭步骤：预包被心肌肌钙蛋白抗体的酶标板以封闭液(2-5wt％脱脂奶粉、250-1000nm20bpdna、0.5-5wt％吐温20)进行封闭1h；

结合步骤：在经封闭处理的心肌肌钙蛋白抗体中加入梯度浓度的心肌肌钙蛋白i标准品和人血清样品(以人血清蛋白为阴性对照)100μl在37℃条件下孵育2h，再加入50nm经地高辛修饰的适配体seqidno.6100μl酶标板覆膜，37℃进行温育1h，得到以抗体、蛋白和适配体的结合物；

洗涤步骤：每孔用350μl洗涤液(0.01-0.5wt％pbst)洗涤，浸泡1-2min结合物，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板5次。

2)检测步骤：

每孔加抗地高辛抗体/hrp100μl(1:5000，临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加tmb底物溶液100μl，酶标板覆膜，37℃避光显色约30min；每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(od)，得到的标准曲线如图29所示。

实施例10：

实施例10与实施例9不同之处在于：

结合步骤中，加入心肌肌钙蛋白i标准品和人血清蛋白50μl；

其余步骤和参数均与实施例10相同，得到的标准曲线如图30所示。

实施例11：

实施例11与实施例9不同之处在于：

结合步骤中，加入100nm经地高辛修饰的适配体；

其余步骤和参数均与实施例9相同，得到的标准曲线如图31所示。

对双适配体夹心elona检测(实施例3-5)、适配体-抗体夹心elona检测(实施例6-8)、抗体-适配体夹心elona检测法(实施例9-11)的线性范围结果比较，发现双适配体夹心法的最低检测限值最小，且线性斜率k最大，证明该方法相较适配体-抗体夹心法和抗体-适配体夹心法而言可以检测更低浓度的ctni含量，同时对ctni浓度变化的敏感性更强。

本发明中的三种方法的检测线性范围均大于临床现使用的试剂盒，在保证阳性样本检出率的同时，扩大可检测浓度范围，在临床上可为重症患者提供后续治疗的依据。

由于双适配体夹心法中完全采用适配体与靶蛋白结合的方式，无抗原抗体结合，有效避免了因抗原-抗体反应而产生的hook效应，在临床应用上也不会产生免疫原性导致出现结果偏差；同时，适配体在制备过程中也比抗体更加稳定，不会产生产品的批间差异而影响检测结果。适配体-抗体夹心法和抗体-适配体夹心法均实现了在同一检测系统中的协同作用，虽然在检测效果上稍劣于双适配体夹心法，却在发挥了适配体和抗体的各自优势的基础上不发生任何拮抗效应，同样具有一定临床意义。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

sequencelisting

<110>严鹏科

<120>一种心肌肌钙蛋白的寡核苷酸适配体及其应用

<130>2021

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<213>人工合成（artificialsequence）

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