一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法与流程

文档序号:25588444发布日期:2021-06-22 17:04阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,包括:(1)敲除益生发酵菌嗜酸乳杆菌的半乳糖苷酶基因,构建以半乳糖苷酶为筛选标记的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌突变株;(2)将乳酸菌质粒的复制子、启动子、半乳糖苷酶基因以及合成的多克隆位点克隆至基因载体,构建半乳糖苷酶互补型载体;(3)根据genbank人ace2mrna序列设计引物,添加酶切位点,经pcr扩增获得ace2基因,进而经酶切和连接将ace2基因克隆至半乳糖苷酶互补型载体,获得同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的重组载体;(4)将所述重组载体转化突变株,获得双表达ace2和半乳糖苷酶的无抗生素抗性基因的重组嗜酸乳杆菌;(5)将重组嗜酸乳杆菌包被成抵抗胃液的微胶囊;(6)以重组嗜酸乳杆菌或重组嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的嗜酸乳杆菌发酵菌,配制抗冠状病毒感染的发酵乳制品;(7)食用发酵乳制品后,其中的重组嗜酸乳杆菌定植于肠道繁殖,并持续表达ace2蛋白,随后ace2蛋白刺激宿主产生抗-ace2,其中ace2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区s1-rbd的作用,抗-ace2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ace2的作用,表达在益生菌表面的ace2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒,从而阻断冠状病毒通过s1-rbd与ace2受体的结合而感染宿主。

2.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述益生发酵菌包括乳球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌ty21a血清型变异株。

3.根据权利要求1、2所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述益生发酵菌或载体菌是指嗜酸乳杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述载体包括细胞载体、纳米载体、人工载体、pnz8148、pleiss、pmg36e、pbbr1mcs-5、pbbr1mcs-6、prv610、plem415、phy300plk、nz9000、mg1363、pbargpe1、pnz8149、pan7-1、pbht1、pve5523、ppg611.1、ppg612.1、pma5、phcmc05、pgfp22、pgfp315、php13、php13-43、phy-43、pwb980、paox1、mg1363、pnz8148、nz9000、pnz9530、pmg36e、pklac1、gg799、pyd1、eby100、pyes2、pyes2-flag、pyes2nta、ntb、ntc、pyes3ct、pyip5、pyrp7、padh2、prsh41、pdc315、pdf15、pug6、pesc-his、bfd14、bfd15、pdnr1、p334、pdr195、prs316,prs316ha、yeplac112、ycplac33、yeplac195、yeplac181、yip211、pyx212、pyx212-vhb、ppg1或ppg2。

5.根据权利要求1、4所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述载体是指pmd-19-t、puc-19、pbr322或pplac。

6.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述乳制品包括酸奶、胶囊、片剂、粉剂、口服液、保健品。

7.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述重组嗜酸乳杆菌表达ace2蛋白包括以s1-rbd基因和/或il-10基因替换ace2基因,然后与胞外锚定质粒或分泌型质粒构建重组质粒,进而转化嗜酸乳杆菌益生菌,使重组s1-rbd和/或il-10基因的益生菌持续表达s1-rbd和/或il-10,起抗冠状病毒感染作用。

8.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,包括将ace2基因、s1-rbd基因、il-10基因、益生菌、分泌型载体或质粒、胞外区基因和胞壁基因进行优选组合,构建高效表达相应分泌型蛋白、益生菌表面蛋白和/或益生菌内蛋白的载体和重组菌,然后制备预防冠状病毒感染的益生酸奶。

9.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,所述包被成微胶囊是指将ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌和w/v为3.0%cacl2、0.4%海藻酸钠、12.5%微孔淀粉、0.1%tween-80配制的混合液制成微胶囊。

10.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,其特征在于,按以下步骤制备:

(1)构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌:将嗜酸乳杆菌中lacf基因的pcr扩增产物连接到克隆载体pmd-19t,构建重组子pmd-19t-lacf,然后将该重组子中包含lacf两端同源重组序列和pmd-19t序列的pcr扩增产物连接至质粒载体puc-19,构建的lacf1-pmd-19t-lacf2-puc-19与lacf移码突变体即δlacf的pcr扩增产物进行酶切、连接,使δlacf序列替换pmd-19t,实现lacf无义序列的替换,然后将经过t-a克隆的δlacf亚克隆到敲除载体pbr322,构建pbr322-δlacf,经鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌,筛选出不分解乳糖的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌,并行southern鉴定。

(2)构建半乳糖苷酶互补型质粒pplac-lacf:以乳酸菌质粒pnz9530为模板,扩增其复制子repa-repc和nisin的启动子pnis,并合成mcs多克隆位点,将repa-repc、pnis和mcs连接至骨架质粒pplac,同时将lacf基因克隆至该质粒,构建以非抗生素抗性基因lacf为选择标记的食品级半乳糖苷酶互补型质粒lacf-pplac,并转化上述构建的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌,筛选能使lacf-突变株恢复乳糖利用能力的半乳糖苷酶互补型质粒。

(3)构建ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒:设计ace2引物,加酶切序列,扩增含有酶切位点的ace2基因,将ace2基因克隆至半乳糖苷酶互补型质粒lacf+质粒,构建同时表达ace2和lacf基因的ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒ace2-lacf-pplac。

(4)构建ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌:将ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒ace2-lacf-pplac转染半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌,构建同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的重组嗜酸乳杆菌,命名为ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌或新冠病毒ace2疫苗。

(5)以海藻酸钠包被ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌,制备成能抵抗胃液作用的微胶囊,同理制备能表达s1-rbd和/或il-10的微胶囊,进而制备抗冠状病毒感染的奶制品。


技术总结
一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法,将ACE2、S1‑RBD和/或IL‑10基因连接胞壁锚定基因或分泌型基因,然后克隆至以半乳糖苷酶为筛选标志的质粒、胞外锚定质粒或分泌型质粒,构建重组质粒,转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌,获得能在胞内、胞壁或胞外定位表达ACE2、RBD和/或IL‑10融合蛋白的以半乳糖苷酶筛选的重组益生菌,以海藻酸钠包被成抵抗胃液的微胶囊,配制成发酵酸奶,口服后重组菌定植于肠道持续表达外源基因,其中表达的ACE2蛋白能封闭病毒RBD并有利于氨基酸吸收和心血管,IL‑10起抗炎作用;产生的抗‑ACE2能封闭ACE2受体,抗‑RBD能封闭病毒RBD,阻断病毒通过RBD与ACE2受体结合感染;重组菌有维持肠道微生态、提高免疫力、产生多种维生素等益生作用。

技术研发人员:翁炳焕
受保护的技术使用者:翁炳焕
技术研发日:2021.04.09
技术公布日:2021.06.22
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