一种用于荧光免疫层析快速检测试纸条的荧光聚合物微/纳球及其制备方法

本发明涉及荧光快速检测领领域，具体地说，是涉及一种具有高效发光、尺寸均一可控、易于特异性蛋白连接等特征的用于荧光免疫层析快速检测试纸条的荧光聚合物微/纳球及其制备方法。

背景技术：

快速检测(poct)技术在环境检测、医疗诊断、卫生保健、食品安全等领域具有广泛的应用。其中基于侧向流动层析(lfa)技术的poct技术，由于其成本低廉、简单便携、生产成本低、检测速度快等特点，成为poct技术的重要发展方向。在lfa技术中，最为关键的组成部分为显色指示剂。显色指示剂的质量决定着lfa技术的灵敏性与可靠性。当前用于lfa的显色指示剂多为胶体金粒子。基于胶体金粒子的lfa技术中，具有特异性的识别能力的单克隆抗体多利用通过静电吸附实现与抗体蛋白的结合，这种结合稳定性不佳，易受到检测环境的影响。此外，基于胶体金的lfa技术其显色原理依赖于胶体金粒子的聚集，导致其检测灵敏度低，无法满足较低检测物浓度的检测要求。

相比于胶体金粒子，基于荧光微/纳球的lfa技术在检测灵敏性有很大提升，并且随着荧光微/纳球的荧光强度的增加，检测灵敏性将进一步地提升。普遍使用的荧光微/纳球为上转换粒子、量子点以及染料掺杂的聚合物微/纳球等。然而，当前已有的荧光微/纳球存在制备方法繁琐、稀土金属使用、表面惰性、荧光染料聚集导致猝灭等问题，造成其制备成本较高、蛋白连接操作复杂等困难，使得其难以得到大规模应用。

技术实现要素：

为克服目前应用于荧光lfa技术中所使用的指示剂微/纳球所存在制备困难、生产成本高、表面修饰困难等问题，满足未来在快速检测技术的特殊需求，本发明提出一种高效发光、色彩可调、尺寸均一可控、表面洁净易修饰的荧光聚合物微/纳球及其制备方法，实现荧光lfa的低成本化与提升荧光lfa的操作便捷性。

本发明目的之一为提供一种用于荧光免疫层析快速检测试纸条的荧光聚合物微/纳球，含有以下式(i)所示结构单元：

其中，r为具有聚集诱导发光性质的基团，p为可聚合单元，所述可聚合单元来源于含双键的聚合单体；x、y为10～10000的整数，z为0～10000的整数。

优选地，r选自包含有下述任一结构的基团：

以上所列举的具有aie性质的r基团仅为部分典型代表，专利实施中并不局限于上述所列举分子结构。

p为可聚合单元，所述可聚合单元来源于含双键的聚合单体。

优选地，所述含双键的聚合单体选自丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、1-乙烯萘、乙烯基蒽等常见可用于自由基聚合的单体中的至少一种。

以上式(i)中，x、y均为10～10000的整数，z为0～10000的整数。

本发明所述荧光聚合物微/纳球的尺寸为20～1000nm。

本发明所述荧光聚合物微/纳球的多分散系数小于0.1。

本发明所述荧光聚合物微/纳球的荧光发射波长范围为200～2500nm。

本发明目的之二为提供一种用于荧光免疫层析快速检测试纸条的荧光聚合物微/纳球的制备方法，包括以下步骤：

将aie可聚合单元、马来酸酐、交联剂、引发剂、以及任选地含双键的聚合单体加入溶剂中，在无氧条件下进行聚合反应得到所述荧光聚合物微/纳球，其中，聚合反应优选为热引发聚合反应或光辐照引发聚合反应。

所述制备方法中，所述含双键的聚合单体可以任选地加入，所述含双键的聚合单体为马来酸酐摩尔用量的0～100％，优选为0～50％；具体地，可以为1％、10％、20％、30％、40％、50％等。

所述aie可聚合单元为马来酸酐摩尔用量的0.1～100％，优选为0.1～50％；具体地，可以为1％、10％、20％、30％、40％、50％等。

所述交联剂用量为马来酸酐摩尔用量的1～50％，优选为1～20％。

所述引发剂用量为马来酸酐摩尔用量的0.01～20％，优选为0.01～10％。

所述含双键的聚合单体选自丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、1-乙烯萘、乙烯基蒽等常见可用于自由基聚合的单体中的至少一种。

所述交联剂是指含有两个双键基团的可聚合单体分子，优选自二乙烯基苯、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的至少一种。

所述aie可聚合单元为乙烯基团修饰的具有aie功能的分子，优选自下式所示化合物中的至少一种：

其中，tpe-v的英文名称为(2-(4-vinylphenyl)ethene-1,1,2-triyl)tribenzene；

其中，tpe-cac的英文名称为(e)-4-(2-(4-(2,2-dicyano-1-phenylvinyl)phenyl)-1,2-diphenylvinyl)phenylacrylate；

其中，tpe-ctac的英文名称为

(e)-4-(2-(4-(2,2-dicyano-1-(thiophen-2-yl)vinyl)phenyl)-1,2-diphenylvinyl)phenylacrylate；

其中，tpp-vb的英文名称为

2,3,5-triphenyl-6-(4-((4-vinylbenzyl)oxy)phenyl)pyrazine；

其中，tpetpa-vb的英文名称为

n-phenyl-4-(1,2,2-triphenylvinyl)-n-(4-((4-vinylbenzyl)oxy)phenyl)aniline。

本发明聚合反应可以采用热引发聚合反应或光辐照引发聚合反应，其中，

热引发聚合反应中，聚合温度优选为20～100℃，聚合反应时间优选为10min～5h；所述聚合温度进一步优选范围为25～85℃。

光辐照引发聚合反应中，光源波长范围为254～500nm，光照强度为20～100mw/cm²，聚合反应时间优选为10min～5h。

所述引发剂优选自偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈以及过氧化二苯甲酰等热分解性引发剂，或者二苯甲酮类、硫杂蒽酮类、苯偶酰类、曙红y、樟脑醌等紫外或可见光引发剂中的至少一种。

聚合反应进行反应的溶剂包括但不限于正己烷、正庚烷、硅油、液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸辛酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯中的一种或多种。

本发明荧光聚合物微/纳球通过共聚合交联剂实现交联结构微/纳球的制备。

以上聚合反应完成后，可以将得到的聚合物微/纳球进行通常的清洗过程。

用于荧光聚合物微/纳球洗涤的溶剂可以包括但不限于乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、四氢呋喃、丙酮、乙醇、异丙醇、乙醚、乙腈、石油醚等一种或多种混合溶剂。

本发明目的之三为提供由所述制备方法得到的荧光聚合物微/纳球。

本发明目的之四为提供所述的荧光聚合物微/纳球或者所述制备方法得到的荧光聚合物微/纳球在荧光层析检测中作为信标载体的应用。

应用时，将所述荧光聚合物微/纳球与抗体蛋白、封闭试剂混合制备信标载体，其中，所述封闭剂优选为牛血清蛋白或人血清蛋白。

所述荧光聚合物微/纳球可以应用于荧光免疫层析试纸条中。

其中，荧光聚合物微/纳球与抗体蛋白的偶联及与封闭剂进行封闭的过程具体可包括以下步骤：

将荧光聚合物微/纳球分散至磷酸盐缓冲溶液中，调节ph范围为4.0～10.0，优选ph范围为6.0～9.0；

将一定质量的抗体蛋白加入至上述荧光聚合物微/纳球的磷酸盐缓冲溶液中，同时加入一定量的牛血清蛋白或人血清蛋白作为荧光聚合物微/纳球活性位点的封闭蛋白。随后，将该反应溶液放置在室温条件下进行震荡，震荡时间为0.5～10min，随后静置8h。

其中，所述荧光聚合物微/纳球的分散液的浓度为0.1～5mg/ml。

抗体蛋白与聚合物微/纳球的质量比优选为0.01～2，更优选为0.1～2。

封闭剂与聚合物微/纳球的质量比优选为1～10，更优选为2～10。

以上用于荧光聚合物微/纳球分散和蛋白质偶联反应的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.1～1000mmol/l。

本发明中，对荧光免疫层析快速检测试纸条没有特别的限定，所述纸条可以包括塑料底板、样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜以及吸水垫。其中，偶联有抗体蛋白的荧光聚合物微/纳球喷涂至结合垫，检测线与质控线分别喷涂相应的免疫识别抗体。检测时，将待测样品滴至试纸条样品垫上，借助于吸水垫的吸水作用使得待测样品沿硝酸纤维素膜渗透，经过结合垫时与荧光微/纳球产生免疫识别，并在检测线和质控线呈现出荧光发射。

本发明涉及一种具有高效发光、尺寸均一可控、易于特异性蛋白连接等特征的荧光聚合物微/纳球及其制备方法和在荧光层析检测中的应用。

本发明的技术方案中首先通过化学修饰将可聚合的双键基团修饰至具有聚集诱导发光性质(aie)的荧光分子结构中，得到具有aie性质的荧光可聚合单元。随后将aie可聚合单元、马来酸酐、任选地含双键的聚合单体、交联剂、热引发剂或光引发剂溶解所需溶剂中，通氮气除氧气20min后。在加热或光照的条件下开始聚合反应，反应进行一段时间后停止聚合反应并利用有机溶剂将所得荧光聚合物微/纳球离心洗涤数次后，分散至合适的磷酸盐缓冲溶液中，得到荧光聚合物微/纳球并应用于随后的lfa试纸条制备。

通过以上聚合方法和操作步骤可获得可应用于lfa测试的理想荧光聚合物微/纳球，其中所得到的荧光聚合物微/纳球具有以下特征：

(1)通过调控聚合反应条件，如：反应时间、单体浓度、引发剂用量、反应温度等，可以实现对所得到的荧光聚合物微/纳球尺寸控制，所得微/纳球尺寸可控范围为20～1000nm，多分散系数小于0.1。

(2)通过更换聚合反应的aie可聚合单体，可获得不同发光性能的荧光聚合微/纳球，荧光发射波长范围为200～2500nm，并且aie可聚合单体的摩尔加入量最高可达马来酸酐摩尔总量的100％，有助于提升荧光发光效率。荧光共聚单体含量的提高将有助于提升快速检测实验的灵敏性。

(3)聚合过程无需添加稳定剂，所得荧光聚合物微/纳球表面洁净。

(4)荧光聚合物微/纳球结构中含有酸酐基团，可实现与蛋白质或其他含有氨基的化合物进行快速反应，实现蛋白质的快速高效偶联，偶联反应在常温下可于10min内完成。

(5)该荧光聚合物微/纳球表面的酸酐基团可实现任何含氨基基团的大分子的快速偶联。

(6)选用光敏性质的aie可聚合可实现微/纳球抗菌功能，有利于增强检测试纸条的储存稳定性。

附图说明

图1为采用本发明所述制备方法得到的不同尺寸的荧光聚合物微/纳球电镜照片以及微/纳球尺寸分布。

图2为荧光lfa试纸条结构示意图。

其中，1-样品垫；2-结合垫；3-检测线；4-质控线；5-吸水垫；6-硝酸纤维素膜；7-荧光聚合物微/纳球；8-塑料底板。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

本发明具体实施方式中所用原料为市售所得。

实施例1

取醋酸乙烯酯0.08g，马来酸酐0.1g，二乙烯基苯0.005g，tpe-v0.01g，偶氮二异丁腈0.001g，溶解于10ml的丁酸乙酯与正己烷混合溶剂(体积比例为1:1)中。采用鼓泡法，对反应体系进行除氧。随后将其放置于60℃水浴中进行反应，反应进行10min后，利用乙酸乙酯、石油醚、乙醇、丙酮依次洗涤三次后，分散至1mmph7.4的pbs溶液中，得到尺寸为20nm的荧光聚合物纳米球。

牛奶中三氯氰胺检测

取0.1mg/ml的20nm荧光聚合纳米球分散液100μl，向其中加入10μg三聚氰胺单克隆抗体和100μg牛血清蛋白，混合10min后，随后静置8h。将制备好的纳米球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。试纸条中检测区涂布三聚氰胺半抗原载体蛋白偶联物，质控区涂布羊抗鼠抗体。将待测牛奶溶液用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

实施例2

取苯乙烯0.2g，马来酸酐0.4g，二乙烯基苯0.03g，tpe-cac0.01g，过氧化二苯甲酰0.001g，溶解于10ml的乙酸异戊酯溶剂中。采用鼓泡法，对反应体系进行除氧。随后将其放置于85℃水浴中进行反应，反应进行30min后，利用乙酸异戊酯、正庚烷、丙酮依次洗涤三次后，分散至10mmph7.4的pbs溶液中，得到尺寸为200nm的荧光聚合物微球。

人血清中新冠肺炎抗体检测

取0.1mg/ml的200nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μg新冠肺炎人血清n蛋白抗体及100μg人血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布人血清抗体igm和igg，质控区涂布羊抗人抗体。将待测血清用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

诺如病毒检测

取0.1mg/ml的200nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μg鼠抗诺如病毒单克隆抗体及50μg牛血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布鼠抗诺如病毒单克隆抗体，质控区涂布羊抗鼠igg多克隆抗体。将待测血清用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

实施例3

取马来酸酐0.4g，二乙烯基苯0.005g，tpe-cac0.76g，偶氮二异丁腈0.007g，溶解于20ml的乙酸异戊酯溶剂中。采用鼓泡法，对反应体系进行除氧。随后将其放置于65℃水浴中进行反应，反应进行30min后，利用乙酸异戊酯、正庚烷、丙酮依次洗涤三次后，分散至10mmph7.4的pbs溶液中，得到尺寸为200nm的荧光聚合物微球。

人血清中新冠肺炎抗体检测

取0.1mg/ml的200nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μg新冠肺炎人血清n蛋白抗体及100μg人血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布人血清抗体igm和igg，质控区涂布羊抗人抗体。将待测血清用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

诺如病毒检测

取0.1mg/ml的200nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μg鼠抗诺如病毒单克隆抗体及50μg牛血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布鼠抗诺如病毒单克隆抗体，质控区涂布羊抗鼠igg多克隆抗体。将待测血清用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

实施例4

取1-乙烯萘0.2g，马来酸酐0.4g，二乙烯基苯0.05g，tpe-ctac0.01g，过氧化二苯甲酰0.001g，溶解于10ml的丙酸乙酯混合溶剂中。采用鼓泡法，对反应体系进行除氧。随后将其放置于85℃水浴中进行反应，反应进行90min后，利用乙酸异戊酯、正庚烷、丙酮依次洗涤三次后，分散至10mmph7.4的pbs溶液中，得到尺寸为500nm的荧光聚合物微球。

人绒毛膜促性腺激素检测

取0.1mg/ml的500nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μg鼠源性抗人绒毛膜促性腺激素抗体及50μg人血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布羊抗人绒毛膜促性腺激素抗体，质控区涂布羊抗鼠多克隆抗体。将待测血清用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。

实施例5

取n-异丙基丙烯酰胺0.15g，马来酸酐0.4g，n,n'-亚甲基双丙烯酰胺0.01g，tpe-ctac0.01g，樟脑醌0.001g，溶解于10ml的乙酸辛酯和乙酸异戊酯混合溶剂(体积比例1:1)中。采用鼓泡法，对反应体系进行除氧。随后将其放置于led灯(30mw/cm²)进行反应，20min后，利用乙酸异戊酯、正庚烷、丙酮依次洗涤三次后，分散至10mmph7.4的pbs溶液中，得到尺寸为600nm的荧光聚合物微球。

水体中重金属离子检测

取0.1mg/ml的600nm荧光聚合微球分散液100μl中加入的10μgcr³⁺-edta单克隆抗体及100μg牛血清蛋白。混合10min后静置8h。将制备好的微球/抗体复合物分散液滴在免疫层析试纸条中结合垫上。在试纸条中检测区涂布cr3+-edta-bsa抗原，质控区涂布羊抗鼠igg二抗。将待测水溶液用pbs溶液稀释后，取200μl的待测液滴在试纸条样品垫之上，10min后得到相应的检测结果。