一种快速提纯细胞色素b6f的方法

本发明涉及一种细胞色素提取方法，具体涉及一种高纯度快速提取蓝细菌cytb6f的方法。

背景技术：

细胞色素是一类以铁卟啉环作为辅基的蛋白质，广泛存在于真核生物的线粒体、植物的叶绿体、以及光合微生物和细菌中，在细胞呼吸、能量转移过程中起着极为重要的作用，是一种高效的生物电子传递体。多种细胞色素可作为药物起到增加细胞氧化，提高氧气利用的作用。目前商用的细胞色素主要包括细胞色素c、细胞色素p450，均提取来源于动物，例如牛、马、鸽子心脏。但植物来源的细胞色素制备难度大，未见商用产品。

细胞色素b6f复合体(cytochromeb6f,cytb6f)是光合电子传递链的主要复合体之一，介导电子从光系统ii向光系统i的传递，并有利于类囊体膜两侧跨膜质子梯度的形成。细胞色素b6f在植物状态转换和呼吸作用等重要过程中有关键的调节作用，并且还参与着植物的呼吸作用。获得高纯度的细胞色素b6f是体外研究植物细胞光合作用、呼吸作用的必要条件。光合作用为几乎所有生物提供物质来源与能量来源，近年来，有关植物光合作用的研究十分热门，它推动着农业经济、人类社会的发展。因此，开发一种商用高纯度细胞色素b6f具有极大的商业价值和科研价值，有利于解决我国粮食问题。

目前植物中细胞色素b6f的提取多集中在菠菜、衣藻中，所需生物量大，提取方法繁琐复杂，费时费力。

技术实现要素：

针对目前植物细胞色素b6f提取困难、产量低、耗时长的问题，本发明的目的是提供一种快速高纯度蓝细菌b6f提取的方法，以降低生产成本，节约生产时间。

与菠菜和衣藻相比，蓝细菌提取细胞色素b6f有以下优势：第一、蓝细菌生长速度快，生长周期短，培养方式简单，适合大规模培养；第二、蓝细菌作为叶绿体的前体，细胞破碎后包含大量类囊体膜，省去了在菠菜和衣藻中提取首先需要制备类囊体膜这一步骤。因此，利用蓝细菌大量提取细胞色素b6f有着广阔的开发利用前景，适用于研究应用。

为实现上述目的，本发明利用蓝细菌(如淡水蓝藻鱼腥藻anabaenasp.pcc7120)作为原料，通过改善硫酸铵沉淀次数，改变去垢剂种类，改变蛋白纯化柱类型，通过简便快捷的方法获得高纯度细胞色素b6f。

具体的，本发明快速提纯细胞色素b6f的方法包括如下步骤：

(1)收集破碎菌体：以蓝细菌为原料，收集蓝细菌菌体，在4℃条件下破碎，离心后保留上清液；

(2)类囊体膜制备：将上清液高速离心获得类囊体膜，并用高盐溶液洗涤，去除杂蛋白；

(3)抽提细胞色素b6f：在类囊体膜中加入去垢剂十一烷基麦芽糖苷(udm)或十二烷基-β-d-麦芽糖苷(n-dodecyl-β-d-maltopyranoside，ddm)，并采用三步硫酸铵沉淀法获得细胞色素b6f粗品；

(4)纯化细胞色素b6f：细胞色素b6f粗品经蔗糖密度梯度离心和阴离子交换柱获得细胞色素b6f成品。

上述步骤(1)中，所述蓝细菌优选为鱼腥藻属anabaena、念珠藻属nostoc等，例如鱼腥藻anabaenasp.pcc7120、多变鱼腥藻anabaenavariabilisatcc29413。

作为一种优选方案，步骤(1)通过将蓝细菌菌液离心富集菌体，然后用缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂，在避光条件下于4℃破碎菌体；破碎后的菌液离心除去未破碎的细胞及细胞碎片，保留上清液。其中所加蛋白酶抑制剂优选为终浓度均为0.1mm的pmsf(苯甲基磺酰氟)、苄脒和6-氨基己酸。

上述步骤(2)中，将上清液高速离心得类囊体膜粗沉淀，类囊体膜粗沉淀用高盐缓冲液重悬，搅拌，再次高速离心，获得洗去杂蛋白的类囊体膜沉淀。

作为一种优选方案，步骤(2)中每次高速离心的转速为80000-100000g，时间为40～60min。类囊体膜粗沉淀用含2mnabr的高盐缓冲液重悬，调整叶绿素浓度为1～1.5mg/ml，搅拌一段时间后按1:1体积比加入ddh2o，高速离心，获得洗去杂蛋白的类囊体膜沉淀。

上述步骤(3)中，类囊体膜沉淀用含蛋白酶抑制剂的缓冲液重悬至叶绿素浓度为1.5～2mg/ml，在搅拌下缓慢加入udm或ddm至终浓度8～10mm，搅拌一段时间后再缓慢加入硫酸铵进行沉淀。

作为一种优选方案，步骤(3)中所述三步硫酸铵沉淀法包括：先缓慢加入硫酸铵至终浓度30％～35％(g/ml，即100ml溶液中含35g硫酸铵，下同)，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，取上清；然后缓慢加入硫酸铵至终浓度40％～45％，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，取上清；再次缓慢加入硫酸铵至终浓度55％～60％，搅拌后以转速180000-210000g离心10～30min，沉淀为细胞色素b6f粗品。

上述步骤(4)中，将细胞色素b6f粗品透析去除硫酸铵盐后再进行蔗糖密度梯度离心，这样可以提高产率。

作为一种优选方案，在步骤(4)将细胞色素b6f粗品用缓冲液重悬后，用100kda透析袋透析过夜，中途换液一次或多次，透析液为添加了0.1mmpmsf、0.2mmudm或ddm，及25mm蔗糖的缓冲液。所述缓冲液优选为tne缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5，50mmnacl，1mmedta)。透析后样品进行蔗糖密度梯度离心，在本发明的一个实施例中，用tne缓冲液加入蔗糖及终浓度1mmudm或ddm配置5％-30％(m/v，单位g/ml)的连续蔗糖梯度。透析后样品蔗糖密度梯度离心的转速为32000-36000rpm，离心时间为14～16hr。然后吸取蔗糖梯度中的橙色细胞色素b6f条带上阴离子交换柱进行离子交换层析，洗脱得到高纯度的细胞色素b6f。所述阴离子交换柱优选为q-sepharose柱。

本发明快速提纯细胞色素b6f的方法与现有技术相比，优点如下：

1、节省菌株培养时间：不需要先将带标签的蛋白表达进入菌株中再纯化，而是直接纯化，节省了转化的时间，获得更天然的细胞色素b6f。另外，蓝细菌生长速度快，培养简单，适合大规模进行蛋白提取。

2、提取速度快：与从菠菜等中提取细胞色素b6f相比，蓝细菌中直接破碎细胞就能获得大量类囊体膜，无需特殊方法，是获得稳定光合膜蛋白的理想来源。在提取过程中，本发明不再通过多次清洗类囊体膜去除杂蛋白，而只通过一次高盐清洗杂蛋白，缩短了提取时间。在抽提过程中，本发明将去垢剂抽提与第一步硫酸铵沉淀同步进行，在不影响抽提效果的情况下缩短了提取时间。在纯化过程中，本发明采用阴离子交换柱，与植物中提取常用的羟基磷灰石-纤维素柱相比有商用成品(如q-sepharose柱)，保证了提取纯度。羟基磷灰石层析柱没有预装柱，需要人员自己装填。其填柱方法繁琐且柱床易坍塌，只能承受低流速，耗时长，对人员要求高。

3、节省去垢剂：现有技术中通常采用多种去垢剂共同抽提细胞色素b6f，不仅对蛋白活性损伤大且造成经济浪费。本发明采用温和的非离子型去垢剂，能更加温和且最大程度的保证蛋白活性。并且使用非离子型去垢剂不干扰后续离子交换柱层析的纯化过程。

4、产量纯度高：通过本发明的方法5g干重藻体能获得5mgb6f蛋白。本发明中改进硫酸铵沉淀步骤，将常采用的一步硫酸铵沉淀改为三步。一步硫酸铵沉淀杂蛋白的力度小，加大后续步骤中的分离难度，影响最终产品得率。将沉淀杂蛋白的次数增加，能够最大限度的去除杂蛋白。本发明在纯化过程中利用蔗糖密度梯度离心和阴离子交换层析，即能达到分子筛的纯化效果。

与现有技术相比，本发明蓝细菌中细胞色素b6f的制备方法提取率高，节省了提取步骤，缩短了提取时间，且获得的细胞色素b6f纯度高、均一性好。

附图说明

图1是实施例1中粗制细胞色素b6f经过蔗糖密度梯度离心后的条带图。

图2是实施例2鉴定纯化后的细胞色素b6f的sds-page蛋白电泳图。

图3是实施例2鉴定纯化后的细胞色素b6f样品透射电镜图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐述本发明的方法，但不以任何方式限制本发明的保护范围。

本实施例所用到的菌株为蓝细菌anabaenasp.pcc7120，购自美国atcc(美国标准菌种收藏所；americantypeculturecollection)菌种库，编号27893。所用培养基为bg11液体培养基：1.5g硝酸钠、0.04g磷酸氢二钾、0.075g硫酸镁·7h2o、0.036g氯化钙·7h2o、0.02g碳酸钠、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁、1毫升微量元素溶液a5，加蒸馏水至1升。其中微量元素溶液a5包含：2.86g硼酸、1.81g氯化锰·4h2o、0.222g硫酸锌、0.39g钼酸钠、0.079g硫酸铜·5h2o、49.4g硝酸钴·6h2o，加蒸馏水至1升。

本发明所涉及的缓冲液(buffer)配方如下：

缓冲液a：50mmtris-hcl，ph8.0，10mmnacl，0.4m蔗糖；

缓冲液b：10mmtricine-naohph8.0，2mnabr，0.4m蔗糖；

缓冲液c：30mmtris-hcl，ph7.5，50mmnacl，1mmedta，0.3m蔗糖；

tne缓冲液：50mmtris-hcl，ph7.5，50mmnacl，1mmedta；

离子交换柱洗脱缓冲液：50mmtris-hcl，ph7.5，0/500mmnacl。

实施例1：

菌株的培养：将蓝细菌anabaenasp.pcc7120以5％接种量接种于培养液中，在温度为25℃，光强为30μe/m²/s，co2通气量为1％条件下通气培养，约7天后收集菌液。

收集破碎菌体：用高速离心机4℃离心，转速为8000rpm，离心5min富集菌体。按1g菌体:8ml缓冲液a重悬，重悬液中加入蛋白酶抑制剂(终浓度均为0.1mm的pmsf(苯甲基磺酰氟)、苄脒和6-氨基己酸)。避光于4℃下在高压均质机中1000bar压力下破碎5次。破碎后的菌液用高速离心机4℃离心，转速为6150rpm，离心10min，除去未破碎的细胞及细胞碎片(后续实验都保持4℃、避光)；

类囊体膜制备：上清用超速离心机sw70ti转子离心，转速为90000g离心45min，沉淀为粗提的类囊体膜。类囊体膜沉淀用缓冲液b重悬，调整叶绿素浓度为1mg/ml，加入转子放置于磁力搅拌器上搅拌30min。30min后按1:1体积比加入ddh2o后，用超速离心机sw70ti转子离心，转速为90000g离心45min，获得洗去杂蛋白的类囊体膜沉淀。

抽提细胞色素b6f：类囊体膜沉淀用加入蛋白酶抑制剂的缓冲液c后重悬至叶绿素浓度2mg/ml，加入转子放置于磁力搅拌器上，缓慢加入终浓度10mm的udm。搅拌10min后，再缓慢加入终浓度35％的硫酸铵，搅拌10min后，用超速离心机sw70ti转子离心，转速为200000g离心10min。离心后取上清，进行第二步硫酸铵沉淀。缓慢加入终浓度45％的硫酸铵，搅拌10min后，用超速离心机sw70ti转子离心，转速为200000g离心10min。离心后取上清，进行第三步硫酸铵沉淀。缓慢加入终浓度55％的硫酸铵，搅拌10min后，用超速离心机sw70ti转子离心，转速为200000g离心30min，沉淀为粗提细胞色素b6f。

纯化细胞色素b6f：粗制细胞色素b6f沉淀用tne缓冲液重悬约1ml，用100kda透析袋透析过夜，中途换液一次，透析液为tne缓冲液中加入0.1mmpmsf，0.01％udm(0.2mm)及25mm蔗糖。透析后样品经蔗糖密度梯度离心，用tne缓冲液加入蔗糖及终浓度1mmudm配置5％(m/v)-30％(m/v)的连续蔗糖梯度。加入样品后用超速离心机sw41ti转子离心，转速为35000rpm离心16hr(见图1)。将q-sepharose柱平衡后，吸取蔗糖梯度中的橙色细胞色素b6f条带上样，用离子交换柱0-500mm盐浓度洗脱缓冲液以1ml/min的速率洗脱，收集洗脱样，获得高纯度的细胞色素b6f。

现有技术中选用不同植物物种(菠菜和鞭枝藻)提取细胞色素b6f的方法与本实施例提取细胞色素b6f的过程对比见表1，可以看出，本发明方法能够有效降低生产成本，节约生产时间。

表1.不同细胞色素b6f制备方法对比

实施例2：纯化的细胞色素b6f纯度鉴定

纯化后的细胞色素b6f经15％sds-page电泳检验，有明显的细胞色素b6f四个大亚基条带，条带大小分别为cytf32kda、cytb625kda、rieskeisp19kda和subunitⅳ17kda(见图2)。

通过透射电镜观察纯化后的蛋白，可见大小均一的细胞色素b6f蛋白颗粒，粒径在10nm左右，符合细胞色素b6f复合体220kda的总大小(见图3)。