一种聚乳酸复合微球及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种聚乳酸复合微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.聚乳酸(pla)具有良好的生物相容性和降解性，已广泛应用于生物医学领域，如用于制作骨科固定材料等。但pla力学强度不足，且缺乏成骨活性，尚不能完全满足骨科内植物对材料性能的要求。纳米羟基磷灰石(n
‑
ha)具有高模量和良好的生物活性、骨诱导。在pla基体中添加n
‑
ha，原理上能有效地实现聚乳酸的增强及改性，但由于n
‑
ha颗粒与pla基质亲疏水性差别较大，界面相容性差，导致n
‑
ha在pla中分散不均匀，难以起到纳米增强的效果。因此，提高n
‑
ha在基体中的分散性，是pla增强及改性的关键。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种聚乳酸复合微球的制备方法，可改善纳米羟基磷灰石在聚乳酸中的分散性和稳定性，提高力学性能。
4.同时，本发明还提供所述制备方法制得的聚乳酸复合微球及其应用。
5.具体地，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明的第一方面是提供一种聚乳酸复合微球的制备方法，包括如下步骤：
7.1)对纳米羟基磷灰石进行硅烷化，得到硅烷化的纳米羟基磷灰石；
8.2)将所述硅烷化的纳米羟基磷灰石与d
‑
丙交酯进行开环聚合反应，得到改性纳米羟基磷灰石；
9.3)将所述改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸混合，制得聚乳酸复合微球。
10.根据本发明第一方面的聚乳酸复合微球的制备方法，至少具有如下有益效果：
11.本发明将硅烷偶联剂接枝到羟基磷灰石表面，改善其在d
‑
丙交酯及聚(l
‑
乳酸)中的分散性，d
‑
丙交酯开环聚合形成聚(d
‑
乳酸)，并接枝到羟基磷灰石表面。根据相似相容性原理，聚(d
‑
乳酸)与聚(l
‑
乳酸)具有更好的相容性，且接枝率的提高进一步改善了纳米羟基磷灰石在聚乳酸中的分散性，从而增强了纳米羟基磷灰石与聚乳酸之间的界面相互作用，提高了复合材料的力学强度。同时，本发明采用聚(d
‑
乳酸)，而不使用现有技术常用的无法发生立体复合作用的聚(l
‑
乳酸)修饰纳米羟基磷灰石表面，可在提高分散性和稳定性的同时，通过与聚乳酸发生立体复合作用，从而增强材料的力学性能。
12.在本发明的一些实施方式中，所述硅烷化的方法为，使纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂进行反应。
13.在本发明的一些实施方式中，所述硅烷偶联剂的结构式为m(nh2r1)
‑
sihx
‑
n(or2)，m和n独立地选自1～3的整数，x＝0～2，且m+n+x＝4；r1选自c
1～10
的直链或带支链的烷烃基、任意取代的c
1～10
直链或带支链的烷烃基、
‑
r3nhr4‑
，所述r3、r4独立地选自c
1～10
的直链或带
支链的烷烃基、任意取代的c
1～10
直链或带支链的烷烃基；所述r2选自c
1～10
的直链或带支链的烷烃基、任意取代的c
1～10
直链或带支链的烷烃基；优选地，所述r1选自c
1～5
的直链或带支链的烷烃基、
‑
r3nhr4‑
，所述r3、r4独立地选自c
1～5
的直链或带支链的烷烃基；优选地，所述r2选自c
1～5
的直链或带支链的烷烃基；优选地，所述硅烷偶联剂包括kh550(γ
‑
氨丙基三乙氧基硅烷)、n
‑
(2
‑
氨乙基)
‑3‑
氨丙基三甲氧基硅烷、n
‑
β
‑
(氨乙基)
‑
γ
‑
氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的至少一种。
14.在本发明的一些实施方式中，所述纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂的反应温度为20～150℃，优选30～100℃；优选地，反应的时间为2～12h，优选5～10h。
15.在本发明的一些实施方式中，所述纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂的反应在ph为8～12的条件下进行，优选ph为9～10。
16.在本发明的一些实施方式中，所述纳米羟基磷灰石和硅烷偶联剂的质量比为1～10：1，优选3～6：1。
17.在本发明的一些实施方式中，所述开环聚合反应的温度为100～200℃，优选120～150℃；优选地，开环聚合反应的时间为12～72h，优选36～60h。
18.在本发明的一些实施方式中，所述开环聚合反应在催化剂存在下进行，所述催化剂包括有机锡催化剂(如辛酸亚锡)、金属类催化剂(如锂基配合物、镁/锌配合物等)、非金属类催化剂[如，酶(脂肪酶)、氨基酸(碱性氨基酸：l
‑
赖氨酸、l
‑
精氨酸)]中的任意一种或多种。所述催化剂的质量占反应体系的0.01％～10％。
[0019]
在本发明的一些实施方式中，所述开环聚合反应在不含水的条件下进行。在实际操作中，可将硅烷化的纳米羟基磷灰石与d
‑
丙交酯混合后，通过减压抽真空去除体系中残留的溶剂和/或水，然后在密闭环境中进行开环聚合反应。
[0020]
在本发明的一些实施方式中，所述硅烷化的纳米羟基磷灰石与d
‑
丙交酯的质量比为1：1～8，优选1：2～5。
[0021]
在本发明的一些实施方式中，所述改性纳米羟基磷灰石的粒径为100～300nm，优选200～250nm。
[0022]
在本发明的一些实施方式中，所述改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸的质量比为1：0.1～10，优选1：0.5～5，更优选约1：1。
[0023]
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，将所述改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸混合后，通过乳液法或溶剂挥发法制得所述聚乳酸复合微球。
[0024]
在本发明的一些实施方式中，所述乳液法具体为，将改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸混合得到的复合溶液与乳化剂混合，搅拌、静置、干燥后制得所述聚乳酸复合微球。
[0025]
在本发明的一些实施方式中，所述复合溶液中，改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸的质量浓度独立地为0.5％～5％，优选1～3％。所述乳化剂可预先配成乳化剂溶液，然后加入所述复合溶液中。所述乳化剂溶液的质量浓度为0.5％～5％，优选1～3％。所述复合溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1：1～10，优选1：3～7。
[0026]
在本发明的一些实施方式中，所述乳化剂为非离子型乳化剂，所述非离子型乳化剂可采用本领域通用的物质，例如聚乙烯醇、聚氧丙烯醚、环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物、多元醇脂肪酸酯等。利用乳化剂对所述复合溶液进行乳化，在乳化过程中，ha/pla(改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸)分散相以微滴(微米级)的形式分散在连续相中，乳化剂降低了
ha/pla微滴的界面张力，形成牢固的乳化膜，阻止ha/pla微滴彼此聚集，而保持均匀的乳状液。待复合溶液的溶剂挥发干燥完毕，便可形成聚乳酸复合微球。在本发明的一些实施方式中，所述复合溶液为有机溶液，采用有机溶剂配制而得，所述有机溶剂包括二氯甲烷、丙酮、己烷、苯、乙酸乙酯中的任意一种或多种。优选地，所述乳化剂溶液为乳化剂的水溶液。
[0027]
在本发明的一些实施方式中，所述搅拌的速度为400～800rpm；所述搅拌时间为5～24h，优选10～15h。所述静置的时间为3～15h，优选5～10h。
[0028]
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂挥发法具体为，配制含有改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸的复合溶液，将溶剂挥发完全后得到所述聚乳酸复合微球。所述复合溶液与乳液法中的复合溶液相同。
[0029]
在本发明的一些实施方式中，所述乳液法和溶剂挥发法均可以在10～50℃的温度下进行，优选20～30℃。
[0030]
本发明的第二方面是提供由上述制备方法得到的聚乳酸复合微球。
[0031]
本发明的第三方面是提供上述聚乳酸复合微球在制备骨科固定材料中的应用。
[0032]
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0033]
1、本发明采用表面改性技术对纳米羟基磷灰石进行表面改性，显著提高了纳米羟基磷灰石在聚乳酸基质中的分散性和稳定性，避免纳米羟基磷灰石在聚乳酸基体中的团聚，由此制备形成的聚乳酸复合材料具有优异的力学性能。
[0034]
2、本发明的高强度复合材料可通过乳液法制备医用级聚乳酸复合微球，且复合微球的粒径可以调控。
[0035]
3、本发明通过操作简单的溶剂挥发法制备高强度聚乳酸复合材料，该复合材料具有优异的力学性能。
[0036]
4、本发明制备的高强度聚乳酸复合材料具有良好的促成骨能力。
附图说明
[0037]
图1为实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla及其制备原料的傅里叶红外光谱(a)和xrd图谱(b)；
[0038]
图2为n
‑
ha(a)和实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla(b)的粒径统计结果；
[0039]
图3为n
‑
ha和实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla的分散性表征结果；
[0040]
图4为n
‑
ha和实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla、对比例1的ha
‑
g
‑
pdla的热重分析结果；
[0041]
图5为实施例2的聚乳酸复合薄膜和对比例3的聚乳酸薄膜的力学性能测试结果；
[0042]
图6为n
‑
ha和实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla的溶血实验结果(a)和细胞毒性实验结果(b)；
[0043]
图7为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜(pla)上的增殖情况；
[0044]
图8为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜(pla)上的铺展情况；
[0045]
图9为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜(pla)上的茜素红染色结果，其中a为茜素红染色数码图；b为茜素红染色光镜图；
[0046]
图10为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜
(pla)上的茜素红定量图；
[0047]
图11为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜(pla)上的碱性磷酸酶活性表达图；
[0048]
图12为rmscs在实施例2的聚乳酸复合薄膜(pla/ha)和对比例3的聚乳酸薄膜(pla)上的骨钙蛋白表达图(图12的pla/ha和pla的图例相同)。
具体实施方式
[0049]
以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。
[0050]
实施例1
[0051]
本实施例通过硅烷偶联剂对纳米羟基磷灰石进行表面改性，再利用聚(d
‑
丙交酯)对其进行表面修饰制备改性纳米羟基磷灰石，最后通过乳液法与聚乳酸复合，制得聚乳酸复合微球。具体包括如下步骤：
[0052]
(1)通过硅烷偶联剂对纳米羟基磷灰石硅烷化
[0053]
将5g纳米羟基磷灰石(n
‑
ha)低温超声分散于30ml乙醇和水(9：1)的混合液中，加入含1g硅烷偶联剂(kh550)的30ml乙醇和水混合的水解液，用碱性溶液调节ph为9～10，70℃下反应8h，离心并用热水洗涤3遍，产物于130℃下真空干燥8h，记为ha@kh550。
[0054]
(2)利用聚(d
‑
丙交酯)(pdla)对硅烷化后的纳米羟基磷灰石进行表面改性
[0055]
将充分干燥的ha@kh550粉末与重结晶的d
‑
丙交酯按质量比2：8混合，并置于充分干燥的安瓿瓶中，注入提纯后的辛酸亚锡
‑
甲苯溶液(0.1wt.％)，通n2洗涤3次，每次10min，减压至20pa，减压抽去甲苯溶剂和残留的水分，高温封管。安瓿瓶置于140℃恒温油浴中，不断旋转(缓慢)，反应时间48h。自然冷却至室温，用二氯甲烷洗涤5次，于60℃真空干燥箱干燥48h，得到表面接枝有聚(d
‑
丙交酯)链段的改性纳米羟基磷灰石，标记为ha@kh550
‑
g
‑
pdla。
[0056]
(3)将医用级聚乳酸(pla)配成一定浓度的二氯甲烷溶液，搅拌过夜溶解完全，得到聚乳酸溶液。将改性纳米羟基磷灰石配成相对应浓度的二氯甲烷溶液，10℃超声搅拌分散完全，得到改性纳米羟基磷灰石溶液。将聚乳酸溶液和改性纳米羟基磷灰石溶液混合(两者体积比为99：1)，超声搅拌，得到医用级聚乳酸复合溶液。
[0057]
(4)将复合溶液逐滴加入至特定浓度的聚乙烯醇水溶液中，搅拌12h，静置8h，抽滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到医用级聚乳酸复合微球。
[0058]
在步骤(3)和步骤(4)中，将聚乳酸溶液的质量浓度(pla浓度)、聚乙烯醇水溶液的质量浓度(pva浓度)，以及聚乳酸溶液与聚乙烯醇水溶液的体积比(油水相体积比)、复合溶液与聚乙烯醇溶液混合后的搅拌速度(转速)分别设置3个水平，如表1所示。然后根据四个因素各自的3个水平进行正交试验，如下表2所示。对不同条件下得到的聚乳酸复合微球进行观察检测，得到的粒径大小也列于表2中。
[0059]
表1.聚乳酸复合微球制备的水平和因素
[0060][0061]
表2.正交试验设计和聚乳酸复合微球的粒径
[0062][0063][0064]
根据表2的正交试验结果可知，通过调整制备参数，可有效调控聚乳酸复合微球的粒径。同时，根据正交实试验结果，求出pla浓度、pva浓度、油水相体积比和转速四个因素的极差，如表3所示。极差值的大小可以判断各种因素对实验数据结果的影响。判断准则：极差越大表示相对应的因素对实验结果的影响越大；这样可以确定主次因素的顺序。各因素的最优水平可以根据各因素各水平对应的指标结果的平均值来确定。确定的原则是：所需指标越小，取最小平均值对应的水平；所需指标越大，取最大平均值对应的水平；所需指标适中(定值)，然后取中间平均值对应的水平。值得注意的是，在正交试验设计规定的试验中，水平的最佳组合并不一定出现。因此，有必要根据试验指标的数值要求，确定各因素的最优水平组合，进而筛选出最佳试验方案条件和较好的试验方案条件。
[0065]
表3.聚乳酸复合微球粒径的极差分析
[0066][0067]
从表3粒径的极差分析结果可以看出，pla浓度、pva浓度、油水相体积比和转速四个因素的极差值分别为35.00、16.66、11.66和31.66，极差分析结果说明对聚乳酸复合微球粒径的影响因素从大到小分别为：pla浓度>转速>pva浓度>油水相体积比。
[0068]
实施例2
[0069]
本实施例通过溶剂挥发法将改性纳米羟基磷灰石与聚乳酸复合，制得聚乳酸复合微球形成的薄膜(聚乳酸复合薄膜)，具体包括如下步骤：
[0070]
(1)将医用级聚乳酸配成3wt.％的二氯甲烷溶液，搅拌过夜溶解完全，得到聚乳酸溶液。将改性纳米羟基磷灰石(改性纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例1)配成3wt.％的二氯甲烷溶液，低温超声搅拌分散完全，得到改性纳米羟基磷灰石溶液。将两种溶液混合(改性纳米羟基磷灰石溶液与聚乳酸溶液和的体积比为1：19)，超声搅拌，得到医用级聚乳酸复合溶液。
[0071]
(2)将复合溶液加入至玻璃培养皿，包扎一层塑料膜，加盖后放入通风橱使溶剂缓慢挥发48小时，然后放入真空干燥箱内于50℃下真空干燥一周，以完全除去溶剂，得到改性纳米羟基磷灰石质量添加量为5％的医用级聚乳酸复合薄膜，标记为pla/ha。
[0072]
对比例1
[0073]
本对比例与实施例2的不同之处在于，在制备改性纳米羟基磷灰石过程中没有添加硅烷偶联剂，而是直接将d
‑
丙交酯与纳米羟基磷灰石进行反应，具体包括如下步骤：
[0074]
(1)利用聚(d
‑
丙交酯)(pdla)对纳米羟基磷灰石进行表面改性
[0075]
将n
‑
ha粉末与重结晶的d
‑
丙交酯按质量比2：8混合，并置于充分干燥的安瓿瓶中，注入提纯后的辛酸亚锡
‑
甲苯溶液(0.1wt.％)，通n2洗涤3次，每次10min，减压至20pa，减压抽去甲苯溶剂和残留的水分，高温封管。安瓿瓶置于140℃恒温油浴中，不断旋转(缓慢)，反应时间48h。自然冷却至室温，用二氯甲烷洗涤5次，于60℃真空干燥箱干燥48h，得到表面接枝有聚(d
‑
丙交酯)链段的改性纳米羟基磷灰石，标记为ha
‑
g
‑
pdla。
[0076]
(2)将医用级聚乳酸配成3wt.％的二氯甲烷溶液，搅拌过夜溶解完全，得到聚乳酸溶液。将改性纳米羟基磷灰石配成3wt.％的二氯甲烷溶液，低温超声搅拌分散完全，得到改性纳米羟基磷灰石溶液。将两种溶液混合(改性纳米羟基磷灰石溶液与聚乳酸溶液和的体积比为1：19)，超声搅拌，得到医用级聚乳酸复合溶液。
[0077]
(3)将复合溶液加入至玻璃培养皿，包扎一层塑料膜，加盖后放入通风橱使溶剂缓慢挥发48小时，然后放入真空干燥箱内于50℃下真空干燥一周，以完全除去溶剂，得到医用
级聚乳酸复合薄膜。
[0078]
对比例2
[0079]
本对比例与实施例2的不同之处在于，没有对纳米羟基磷灰石进行改性，而直接将纳米羟基磷灰石与聚乳酸进行混合反应，具体包括如下步骤：
[0080]
(1)将医用级聚乳酸配成3wt.％的二氯甲烷溶液，搅拌过夜溶解完全，得到聚乳酸溶液。将纳米羟基磷灰石配成3wt.％的二氯甲烷溶液，低温超声搅拌分散完全，得到纳米羟基磷灰石溶液。将两种溶液混合(纳米羟基磷灰石溶液与聚乳酸溶液和的体积比为1：19)，超声搅拌，得到医用级聚乳酸复合溶液。
[0081]
(2)将复合溶液加入至玻璃培养皿，包扎一层塑料膜，加盖后放入通风橱使溶剂缓慢挥发48小时，然后放入真空干燥箱内于50℃下真空干燥一周，以完全除去溶剂，得到医用级聚乳酸复合薄膜。
[0082]
对比例3
[0083]
本对比例通过溶剂挥发法制备医用级聚乳酸材料，其制备步骤包括：
[0084]
将医用级聚乳酸配成3％的二氯甲烷溶液，搅拌过夜溶解完全，得到聚乳酸溶液，然后加入至玻璃培养皿，包扎一层塑料膜，加盖后放入通风橱使溶剂缓慢挥发48小时，然后放入真空干燥箱内于50℃下真空干燥一周，以完全除去溶剂，得到医用级聚乳酸薄膜，标记为pla。
[0085]
结构表征和性能测试
[0086]
(1)实施例1的改性纳米羟基磷灰石ha@kh550
‑
g
‑
pdla的傅里叶红外光谱如图1a所示，同时与其制备原料n
‑
ha、kh550、ha@kh550、pdla等进行对比。图中635cm
‑1和3565cm
‑1是
‑
oh的吸收振动峰，562cm
‑1和605cm
‑1是磷酸根的变形振动峰，962cm
‑1和1033cm
‑1是磷酸根的伸缩振动峰，与n
‑
ha的ir标准图谱一致，证明n
‑
ha的成功制备。对比n
‑
ha与ha@kh550的图谱，可以发现改性后的ha在1150cm
‑1出现了kh550的si
‑
o
‑
si特征峰，表明硅烷化的成功。ha@kh550
‑
g
‑
pdla在1750cm
‑1处出现了一个新的峰值，对应于pdla的羰基(c＝o)，表明d
‑
丙交酯的成功接枝。
[0087]
(2)pdla、n
‑
ha和ha@kh550
‑
g
‑
pdla的xrd图谱如图1b所示。ha@kh550
‑
g
‑
pdla的曲线中在16.8
°
和19.5
°
处的结晶衍射峰分别对应着pdla的(110)和(203)晶面，且n
‑
ha的强特征峰(211)，(112)，(002)均有出现。
[0088]
(3)n
‑
ha和ha@kh550
‑
g
‑
pdla的粒径统计结果如图2所示。从图2可以看出，未改性的n
‑
ha粒径分布很宽，粒径非常大，平均粒径约为400nm。这表明未经改性的n
‑
ha很容易在氯仿中聚集。改性得到的ha@kh550
‑
g
‑
pdla的平均粒径约为240nm，粒径更小，粒径分布更窄。这表明表面接枝的pdla可以阻止ha在氯仿中的聚集，提高其分散性。
[0089]
(4)n
‑
ha和ha@kh550
‑
g
‑
pdla的分散性表征结果如图3所示：ha@kh550
‑
g
‑
pdla在氯仿中形成稳定的悬浮液，在静止12h后仍然保持良好的稳定性，然而由未改性的n
‑
ha制成的氯仿悬浮液，静置几分钟后羟基磷灰石在自身重力的作用下慢慢沉降直至完全沉淀。ha@kh550
‑
g
‑
pdla良好的稳定性可能是因为表面修饰降低了n
‑
ha的表面自由能，阻止其团聚。同时良好的稳定性是增强基体pla的关键因素之一。
[0090]
(5)n
‑
ha和实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla、对比例1的ha
‑
g
‑
pdla的热重分析结果如图4所示。热重分析结果显示，实施例1的ha@kh550
‑
g
‑
pdla中pdla在ha中的接枝率高达
21.1％，而对比例1的ha
‑
g
‑
pdla中pdla的在ha中接枝率仅为6.5％，说明通过加入硅烷偶联剂可以显著提高pdla的接枝率。
[0091]
(6)力学性能
[0092]
对聚乳酸复合薄膜进行力学性能分析，测试方法如下：将实施例2的聚乳酸复合薄膜裁成自定义长条形试样(宽10mm，总长度70mm，厚度<1mm)，参考astm d882
‑
02和gbt1040.3
‑
2006测试标准，将聚乳酸复合薄膜夹具间初始距离和标距均为40mm，以4mm/min的拉伸速率进行测试，每个样品准备5个平行样。
[0093]
同时，采用相同的方法对对比例1、对比例2的聚乳酸复合薄膜和对比例3的聚乳酸薄膜进行力学性能分析，测试结果如表4和图5所示。
[0094]
测试结果显示，对比例3的纯聚乳酸薄膜的拉伸强度为67mpa、断裂伸长率为6.5％、杨氏模量为2.65gpa。当实施例2添加了5％的改性ha后拉伸强度达到91mpa、断裂伸长率为11.6％、杨氏模量为4.17gpa。当没有对ha进行改性，或者在改性过程中没有添加硅烷偶联剂，聚乳酸复合薄膜的力学性能均发生下降。
[0095]
表4.力学性能测试结果
[0096][0097]
(7)溶血性和细胞毒性
[0098]
溶血性检测方法如下：sd大鼠(220g左右)腹腔取2ml新鲜血液置于含有抗凝剂edta的试管中。用pbs稀释，1000r/min离心10min，倒掉上液重新加入pbs，重复洗涤数次直至上清液无明显红色或者呈现微黄色，去除上清液，用12ml的pbs稀释红细胞并吹打成红细胞悬浮液，用酶标仪测量540nm处的吸光值，在0.9～1.2即可，否则用pbs继续稀释。材料(n
‑
ha或ha@kh550
‑
g
‑
pdla)在pbs中分散为25，50，100，200μg/ml的悬液，取500μl的材料悬液与500μl的红细胞悬液混合于2ml的ep管中，37℃环境下孵育3h，之后1000r/min离心10min。取100μl上清液于96孔板中，酶标仪测量540nm处吸光值。分别以去离子水和pbs作为阳性对照和阴性对照，每组3个平行样。溶血率(％)＝(样品吸收
‑
阴性对照吸收)/(阳性对照吸收
‑
阴性对照吸收)
×
100％。超过gb＝5％视为溶血。
[0099]
细胞毒性检测方法如下：用完全培养基浸泡经紫外灭菌的无菌样品(n
‑
ha或ha@kh550
‑
g
‑
pdla，质量体积比1：5，)于细胞培养箱，孵育24h，获得浸提液。在96孔板底部接种5000个细胞(每孔加100μl浓度为5万/ml细胞悬液)，培养24h。种板过程中不时晃动离心管或不时吹打(每接种3～5个孔吹打3～5次)保证细胞均匀的接种在孔板内。接种时可以沿孔板内壁注入细胞悬液，同时接种后避免剧烈晃动，防止细胞在孔内分布不均。移除96孔板内的培养基并更换为100μl浸提液，空白对照组更换为100μl正常完全培养基。培养24h后移除浸提液，每孔加100μl无菌pbs清洗。随后避光条件下向每个孔加入100μl完全培养基和20μl 5mg/ml mtt(5mg mtt溶于1ml无菌pbs，无菌滤头过滤，备用)，孵育4h。避光移除含mtt的培
养液，加入150μl dmso，轻微摇晃混匀。酶标仪570nm测吸光度。
[0100]
溶血性结果如图6a所示：经过定量计算发现，在不同的浓度下，改性前后ha的溶血率均低于国标gb：5％。表明ha@kh550
‑
g
‑
pdla不会导致明显的溶血现象，具有良好的血液相容性。
[0101]
细胞毒性结果如图6b所示：细胞的存活率会因为材料浓度的增加而略有下降，但是在最高1.6mg/ml的浓度下存活率仍在国标gb：80％以上，证明ha@kh550
‑
g
‑
pdla具有良好的细胞相容性。
[0102]
(8)细胞增殖
[0103]
对聚乳酸复合薄膜进行细胞增殖检测，检测方法如下：采用cck
‑
8法(cell counting kit
‑
8)测试材料的细胞活性。将密度为2
×
104个细胞/ml的rmscs接种在材料表面，改性ha/pla复合材料为实验组，pla为对照组，不加材料的为空白组。培养1天、4天、7天后，使用pbs清洗支架三次，然后转移到一个全新的24孔板，以避免原24孔板内细胞的影响。按照每500μl dmem培养基中加入50μl cck
‑
8检测液的比例，向24孔板中加入检测液。在37.5℃，5％co2的环境下孵育2小时。孵育完成后，取上清液，转移到96孔板中，在酶标仪上450nm处读取吸光度(od)值。
[0104]
检测结果如图7所示，图中*p<0.05，**p<0.01。所有组的od值均随着时间的增加而变大。rmscs在pla/ha复合材料上培养仅1天od值明显比空白组和对照组大。在培养4天和7天后，pla/ha复合材料表现出优异的细胞增殖速率，od值且远高于空白对照和pla组，说明实验组的细胞增殖率高于其他两组。通过对比空白对照和pla组，发现pla组的细胞增殖率要低于空白对照组，可能光滑的pla表面不利于rmscs细胞的增殖。实验结果证明了pla/ha复合材料具有良好的细胞相容性。
[0105]
(9)细胞在聚乳酸复合薄膜上的铺展情况
[0106]
将密度为2
×
104个细胞/ml的rmscs接种在材料表面，在培养24h后进行染色。将待染色ha/pla薄膜样品用pbs清洗3次，每次10min。用多聚甲醛溶液固定于4℃冰箱过夜。将固定后的样品用pbs清洗2次，每次10min，随后用0.1％triton x
‑
100浸泡5min，提高细胞膜通透性。再次用pbs清洗2次，每次10min，随后于1％bsa溶液中封闭30min，减少抗原
‑
抗体非特异性结合。在避光环境下与phalloidin
‑
fitc工作液孵育60min，pbs清洗2次，每次10min。最后，将样品与dapi(1：200稀释于pbs)在室温避光下孵育10min，pbs缓冲液清洗3次，每次10min。染色样品于激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。
[0107]
检测结果如图8所示，图8中蓝色代表细胞核，红色代表肌动蛋白丝。结果显示，pla样品上肌动蛋白丝团聚且铺展较差，表明该表面不利于细胞粘附和铺展；但添加了改性ha的样品组，可以观察到细胞扁平且彼此相连，并伸展出大量的肌动蛋白微丝，呈现多层融合。表明pla/ha复合材料的表面更有利于细胞的粘附和铺展。
[0108]
(10)成骨分化能力
[0109]
检测医用级聚乳酸复合材料对rmscs成骨分化的影响，测试方法如下：
[0110]
(i)茜素红染色：在经7、14和21天成骨诱导培养后，用pbs清洗样品多次，多聚甲醛固定30min以上。再用去离子水清洗样品多次。每个孔加入500μl 2％茜素红染液，室温孵育30min。然后用去离子水清洗样品多次，洗去游离的染料。染色步骤中以pla为对照，进行相同的染色清洗处理。漂洗过程以pla组为参考，当pla组漂洗干净(清洗液无色透明)时，则认
为游离的未与钙结节结合的染料漂洗完全。将染色样品置于显微镜下观察拍照。
[0111]
(ii)茜素红染色定量：进行茜素红染色定量时，将样品置于24孔板中。每个样品孔加入500μl 100mm氯化十六烷基吡啶溶液(用去离子水超声溶解)，溶解钙结节。置于37℃环境孵育过夜。吸100μl至离心管，2000rpm离心5min，测试上清在570nm处的吸光度，定量表征样品钙沉积。
[0112]
(iii)alp活性检测：3、7和14天分别取样，加入0.2％triton x
‑
100，置于冰上裂解30min。样品离心(4℃，7000rpm/min，2min)，收集含alp的上清液。按试剂盒说明操作，取50μl样品(根据需要可用检测缓冲液稀释)与50μl的显色底物稀释液混合，37℃孵育30min，然后加入100μl终止液。取标样配制标准曲线，进行同样的孵育操作并加入反应终止液，测定405nm处的吸光度。按试剂盒定义，计算alp的活性。酶活力单位为u，一分钟内碱性磷酸酶催化合成1μmol对硝基苯酚表示为1u。
[0113]
(iv)ocn检测：待成骨诱导培养14天后，收集样品，pbs清洗、4％多聚甲醛固定。再依次经过0.1％triton x
‑
100透膜5min，1％bsa封闭30min。加入鼠源抗ocn一抗(osteocalcin monoclonal antibody)4℃孵育过夜。紧接着在避光环境下加入山羊抗小鼠igg h&l(alexa488)二抗，室温孵育2h。最后，将样品与dapi在室温下孵育20min。置于荧光显微镜观察并拍照。
[0114]
测量结果如下：
[0115]
(i)茜素红染色结果如图9所示：随着诱导时间的增加，pla/ha组出现了明显的颜色递升梯度，且颜色明显深于对照组。
[0116]
(ii)茜素红定量结果如图10所示：随着诱导时间的增加，pla/ha组rmscs的矿化能力在显著提升，且pla/ha组矿化能力明显优于pla组。
[0117]
(iii)alp活性结果如图11所示：alp活性(其活性越高表明成骨分化越明显)随着培养时间的延长呈递增趋势；且pla/ha复合材料表现出更高的alp活性。结果表明，该复合材料有明显的促成骨分化的能力。
[0118]
(iv)ocn检测结果如图12所示(图中ocn表现出绿色荧光，细胞核为蓝色荧光)：pla/ha复合材料的ocn荧光强度要强于pla组，说明复合材料的矿化能力强于pla组，进而可以说明复合材料通过n
‑
ha促进细胞粘附进而加速细胞成骨分化过程。
[0119]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。