技术特征：
1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293td37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为l8lubiqutin、i215l、i73rhbsag和e146l，其中l8lubiqutin是在l8l上添加分子佐剂ubiqutin获得，i73rhbsag是在173r上添加分子佐剂hbsag获得，l8lubiqutin和i215l表达在e1区，i73rhbsag和e146l表达在e4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l；其中，所述重组腺病毒载体pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l需通过由pcdna3.1+(hyg)-orf6-ires-dbp构建的293td37细胞实现重组腺病毒包装，293td37细胞的细胞株保藏编号为：cctcc no:c201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；其中，l8l、ubiqutin、i215l、i73r、hbsag、e146l、pad5lcl3分别具有如序列表中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示的核苷酸序列。2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：1）利用crispr/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的e1基因，引入swaⅰ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用crispr/cas9敲除e3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失e1和e3基因的腺病毒载体质粒pad5；2）再利用crispr/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pad5的e4基因，使用pcr扩增并引入i-scei酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失e1、e3和e4基因的腺病毒载体质粒pad5
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e4；3）利用crispr/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pad5
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e4的e2a基因，并将e4区的orf6/7表达框放在敲除了e2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失e1、e3、e4和e2a基因的腺病毒载体质粒pad5lcl3；4）构建腺病毒e1区域穿梭质粒ps5e1，通过dna连接酶分别与l8lubiqutin、ires、i215l基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体e1区域穿梭质粒ps5e1-l8lubiqutin-ires-i215l；5）构建腺病毒e4区域穿梭质粒ps5e4-egfp，i73rhbsag、2a、e146l基因通过融合pcr技术得到i73rhbsag-2a-e146l基因片段，通过对穿梭质粒ps5e4-egfp酶切，敲除egfp，并通过dna连接酶与i73rhbsag-2a-e146l连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体e4区域穿梭质粒ps5e4-i73rhbsag-2a-e146l；6）将穿梭质粒ps5e1-l8lubiqutin-ires-i215l与腺病毒载体质粒pad5lcl3同源重组，得到腺病毒载体质粒pad5lcl3-l8lubiqutin-ires-i215l；7）将穿梭质粒ps5e4-i73rhbsag-2a-e146l与腺病毒载体质粒pad5lcl3-l8lubiqutin-ires-i215l同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l，pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l具有如序列表中seq id no.8所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的腺病毒环状载体质粒来源于在a549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用hirtvirual dna extract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环
状的腺病毒环状载体质粒。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的orf6/7表达框基因具有如序列表中seq id no.9所示的核苷酸序列；步骤4）所述的ires具有如序列表中seq id no.10所示的核苷酸序列；步骤5）所述的2a具有如序列表中seq id no.11所示的核苷酸序列。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的穿梭质粒ps5e1骨架采用puc origin、amp基本元素，ad5左臂itr部分序列，右臂pix、piva2部分序列，以及cmv-mcs sv40 early polya；步骤5）所述的e4区域穿梭质粒ps5e4-egfp的骨架采用puc origin、amp基本元素，ad5e4区域左臂itr序列，右臂部分fiber基因序列，以及ef1α-egfp-hbv polya基因；其中puc origin、amp基本元素具有如序列表可见中seq id no.12所示的核苷酸序列，ef1α-egfp-hbv polya基因具有如序列表可见中seq id no.13所示的核苷酸序列。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6）穿梭质粒ps5e1-l8lubiqutin-ires-i215l与腺病毒载体质粒pad5lcl3同源重组，是通过paci和swai对穿梭质粒ps5e1-l8lubiqutin-ires-i215l和腺病毒载体质粒pad5lcl3进行酶切，酶切产物去磷酸化，omega ultra-sep gel extraction kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行xhoi酶切验证。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7）穿梭质粒ps5e4-i73rhbsag-2a-e146l与腺病毒载体质粒pad5lcl3-l8lubiqutin-ires-i215l同源重组，是通过paci和i-scei对穿梭质粒ps5e4-i73rhbsag-2a-e146l和腺病毒载体质粒pad5lcl3-l8lubiqutin-ires-i215l进行酶切，酶切产物去磷酸化，omega ultra-sep gel extraction kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行xhoi酶切验证。8.一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l用paci酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcdna3.1+(hyg)-orf6-ires-dbp构建的293td37细胞，收集细胞悬液。9.根据权利要求7所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，由以下步骤制得：1）将pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l共表达重组腺病毒载体用paci酶切，线性化后的质粒用于转染；使用pei转染试剂转染293td37细胞；2）转染后的293td37细胞于37℃，5%co2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为tp0代腺病毒；3）tp0代腺病毒感染293td37细胞于37℃，5%co2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即tp1代腺病毒；4）重复3），收集细胞悬液即tp2代腺病毒；5）持续接毒直至tp4代腺病毒。10. 293td37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为l8lubiqutin、i215l、i73rhbsag和e146l，其中l8lubiqutin和i215l表达在e1区，i73rhbsag和e146l表达在e4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pad5lcl3-l8lubiqutin-i215l-i73rhbsag-e146l；其中，所述293td37细胞是由pcdna3.1+(hyg)-orf6-ires-dbp构建的，细胞株保藏编号为：cctcc no:c201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
技术总结
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为L8Lubiqutin、I215L、I73Rhbsag和E146L。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达L8Lubiqutin和I215L、I73Rhbsag和E146L基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。
技术研发人员：李娜 陈平 张婷婷 钟鑫涛 张风苹 张利娟 祝志刚 王暄 李娅芳 李楠
受保护的技术使用者：嘉兴安宇生物科技有限公司
技术研发日：2021.07.06
技术公布日：2022/1/6