樱桃砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用与流程

1.本发明涉及5种樱桃砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.樱桃(cerasus spp.)是蔷薇科(rosaceae)李亚科(prunoideae)李属(prunus)植物。利用矮化砧木实行密植栽培，是实现果树早实、丰产、优质、高效的重要措施。20世纪末，中国甜樱桃生产主要用考特、大青叶、东北山樱等乔化砧木，树体高大、结果晚、产量低，制约了中国甜樱桃矮化密植栽培的发展。目前樱桃旧园改造和新园建设普遍采用樱桃矮化密植砧木嫁接的品种，提高了樱桃的抗病性、产量及环境适应性。
3.樱桃矮化密植抗病砧木种类不多，目前大量应用的主要有吉塞拉系列、兰丁系列及京春系列砧木。本发明提供能够明确区分三个系列及同系列不同品种的樱桃砧木鉴定方法，为确保科研部门、苗木繁育和果园种植企业准确识别、控制樱桃砧木品种奠定技术基础，也为企业进行樱桃砧木规模化种苗繁育提供技术支持。


技术实现要素：

4.针对现有技术中5种樱桃砧木苗期不易鉴定的缺陷，本发明提供一种5种樱桃砧木的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法筛选到7134个品种特异的snp标记，基于这些标记开发出两种种简便、快速、可靠鉴定5种樱桃砧木的方法，为从源头上准确控制樱桃品种奠定技术基础。
5.为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案予以实现：
6.首先，本发明提供一种利用简化基因组测序技术super-gbs筛选5种樱桃砧木的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
7.(1)利用品种已知且准确的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10 和兰丁2号
‑‑
f10为样品，提取基因组dna；
8.(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
9.(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；
10.(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
11.(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到7134个snp位点，具体见表1；
12.(6)利用7134个snp位点或者其中的部分snp位点构建进化树和聚类分析。
13.根据表1的标记位点，能够筛选出几千组准确鉴定5种樱桃砧木品种的snp位点标记群，其中本发明列举三组能够准确鉴定5种樱桃砧木品种的snp位点标记群信息及标记扩增引物信息如下：
14.表2能够准确鉴定5种樱桃砧木的一组snp位点信息
[0015][0016]
表3所述表2中snp位点鉴定引物信息
[0017][0018]
表4能够准确鉴定5种樱桃砧木的一组snp位点信息
[0019][0020]
表5所述表4中snp位点鉴定引物信息
[0021]
[0022][0023]
表6能够准确鉴定5种樱桃砧木的一组snp位点信息
[0024][0025]
表7所述表6中snp位点鉴定引物信息
[0026][0027]
本发明的有益效果：对5种樱桃砧木的组培苗、嫁接苗、成品苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少繁育过程中误差造成的经济损失。
附图说明
[0028]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0029]
图1为利用筛选到的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10 5种樱桃砧木7134个特异snp标记构建进化树，能够准确的区分5种樱桃砧木。
[0030]
图2为利用super-gbs方法进行樱桃砧木样品的测序与snp筛选，最终筛选到的snp位点与已经确定有效的7134个snp位点90％以上重合，利用这些重合的位点对5种樱桃砧木进行分类，能够准确的区分5种樱桃砧木。
[0031]
说明，本发明的图1和图2中，样品编号对应的品种如下表所示：
[0032]
序号品种样品编号1京春3号
‑‑
h11b-65，b-34，b-19，b-26
2兰丁3号
‑‑
h22b-17，b-32，b-50，b-693吉塞拉5#b-1，b-3，b-4，b-6，b-7，b-9，b-114京春1号
‑‑
h10b-48，b-52，b-16，b-23，b-30，b-31，b-39，b-435兰丁2号
‑‑
f10b-58，b-47，b-67
具体实施方式
[0033]
实施例1
[0034]
本实施例提供一种利用简化基因组测序技术super-gbs筛选京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
ꢀ‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10共5种樱桃砧木特异性snp分子标记的方法，包括如下步骤：
[0035]
(1)利用品种已知的3株京春3号
‑‑
h11，3株兰丁3号
‑‑
h22、5株吉塞拉5#、6株京春1号
‑‑
h10和2株兰丁2号
‑‑
f10樱桃砧木样品，提取基因组dna；
[0036]
(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
[0037]
(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；
[0038]
(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
[0039]
(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他5个樱桃砧木品种中至少一个品种位点不同，最终筛选到 7134个snp位点；
[0040]
(6)利用7134个snp位点构建进化树和聚类分析。
[0041]
具体的操作步骤如下：
[0042]
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
[0043]
1.酶切：
[0044]
对本公司购买的标准机构提供的品种准确的3株京春3号
‑‑
h11，3株兰丁3号
‑‑
h22、5 株吉塞拉5#、6株京春1号
‑‑
h10和2株兰丁2号
‑‑
f10樱桃砧木进行super-gbs建库，具体过程如下(以下为每个样品酶切试剂使用量)：
[0045]
depc水：21.4μl；10
×
cutsmart buffer：3μl；psti-hf(4units)：0.2μl；mspi(8units)： 0.4μl；
[0046]
dna(50ng/μl)：5μl；所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
[0047]
2.连接：
[0048]
在40μl体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
[0049]
depc水：13μl；10
×
t4 ligase buffer：4μl；psti adaptor(0.1μm)：1μl；commonadaptor(10μm)：1.5μl；t4 dna ligase(400u/μl)：0.5μl；酶切产物：20μl。
[0050]
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
[0051]
3.纯化：
[0052]
取连接产物35μl加入0.7倍体积的sera-mag beads(ge healthcare life sciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μl 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mm tris.hcl(ph 8.0)从磁珠中回收dna。
[0053]
4.扩增：
[0054]
depc水：16μl；taq5
×
master mix：5μl；primer 1(10μm)：0.5μl；primer 2(10μm)： 0.5μl；
[0055]
纯化后的连接产物：3μl。
[0056]
所有成分混匀后置于pcr仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
[0057]
5.混库：
[0058]
使用qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入 0.7倍体积的sera-mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illumina nova pe150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表8。
[0059]
表8 super-gbs测序文库构建接头及引物序列
[0060]
名称序列(5
’‑3’
)common adaptor topgatcggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatctcommon adaptor botcgagatcggaagagcggggactttaagcpsti adaptor topcacgacgctcttccgatctaacxxxxxxtgcapsti adaptor botyyyyyyagatcggaagagcgtcgtgprimer1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctprimer2caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaa
[0061]
6.分析
[0062]
对5种樱桃砧木品种，共19个样品进行super-gbs测序，一共得到61m高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为77.85％～84.67％，所有样品的平均测序深度为 37.47
×
。利用gatk(v3.8-1)软件得到snp位点，然后筛选5个品种间至少有一个品种与其它品种不同的snp位点，最终获得7134个snp位点，采用treebest软件分析，利用r包 ggtree绘图，这些位点可用于5种樱桃砧木品种的准确鉴定，鉴定结果见图1。
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例提供按照本发明的方法对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的5种樱桃砧木各1株进行品种鉴定，同时加入已知品种的5种樱桃砧木(实施例1中样品)的测序数据作为对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0065]
(1)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10樱桃砧木各1株，提取基因组dna；
[0066]
(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
[0067]
(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；
[0068]
(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。保留与表1中的7134个位点重合的snp位点，最终获得6848个snp位点；
[0069]
(5)利用最终获得的6848个snp位点构建进化树，确定采集的品种圃中樱桃样品的品种。
[0070]
具体的操作步骤如下：
[0071]
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
[0072]
1.酶切：
[0073]
从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉 5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各1株进行super-gbs建库，具体过程如下(以下为每个样品使用量)：
[0074]
depc水：21.4μl；10
×
cutsmart buffer：3μl；psti-hf(4units)：0.2μl；mspi(8units)： 0.4μl；
[0075]
dna(50ng/μl)：5μl。
[0076]
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
[0077]
2.连接：
[0078]
在40μl体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
[0079]
depc水：13μl；10
×
t4 ligase buffer：4μl；psti adaptor(0.1μm)：1μl；common adaptor(10μm)：1.5μl；t4 dna ligase(400u/μl)：0.5μl；
[0080]
酶切产物：20μl。
[0081]
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
[0082]
3.纯化：
[0083]
取连接产物35μl加入0.7倍体积的sera-mag beads(ge healthcare life sciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μl 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mm tris.hcl(ph 8.0)从磁珠中回收dna。
[0084]
4.扩增：
[0085]
depc水：16μl；taq5
×
master mix：5μl；primer 1(10μm)：0.5μl；primer 2(10μm)： 0.5μl；
[0086]
纯化后的连接产物：3μl。
[0087]
所有成分混匀后置于pcr仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
[0088]
5.混库：
[0089]
使用qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入 0.7倍体积的sera-mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illumina nova pe150。建库过程所用的接头和引物序列详见实施例1中的表8。
[0090]
6.根据测序结果并参照表1中snp位点信息挑选与其重合的snp位点，最终获得6848 个snp位点。
[0091]
7.分析
[0092]
对5个样品进行super-gbs测序，一共得到13.7m高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为77.75-83.62，所有样品的平均测序深度为38.1。利用gatk(v3.8-1) 软件得到大量snp位点，与表1中的7134个snp位点进行比对，最终获得7134个snp位点中的6848个snp位点，采用treebest软件分析，利用r包ggtree绘图，这些位点可用于5 种樱桃砧木品种的准确鉴定，鉴定结果见图2。
[0093]
实施例3
[0094]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份樱桃砧木的基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行5种樱桃砧木品种鉴定，同时加入已知品种的5种樱桃砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0095]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各取2株，提取基因组dna；
[0096]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各2株，提取基因组dna；
[0097]
(3)从7134个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定5种樱桃砧木品种的snp位点群见表2；
[0098]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表3；
[0099]
(5)利用表3中5种樱桃砧木的通用引物进行pcr扩增；
[0100]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0101]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行樱桃砧木品种的分型判读。
[0102]
具体的操作步骤如下：
[0103]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0104]
1、pcr扩增
[0105]
根据表2中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表3。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0106]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0107]
2.测序
[0108]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0109]
3.序列比对
[0110]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明7134个 snp位点中筛选的一个snp位点标记群(见表2)进行5种樱桃砧木品种的分型。
[0111]
4.分析
[0112]
序列比对鉴定结果发现，5种樱桃砧木京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10共计10株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0113]
实施例4
[0114]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份樱桃砧木树苗基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行5种樱桃砧木品种鉴定，同时加入已知品种的5种樱桃砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0115]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各取2株，提取基因组dna；
[0116]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉
塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各2株，提取基因组dna；
[0117]
(3)从7134个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定5种樱桃砧木品种的snp位点群见表4；
[0118]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表5；
[0119]
(5)利用表5中5种樱桃砧木的通用引物进行pcr扩增；
[0120]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0121]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行樱桃砧木品种的分型判读。
[0122]
具体的操作步骤如下：
[0123]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0124]
1、pcr扩增
[0125]
根据表4中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表5。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0126]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0127]
2.测序
[0128]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0129]
3.序列比对
[0130]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明7134个 snp位点中筛选的一个snp位点标记群(见表4)进行5种樱桃砧木品种的分型。
[0131]
4.分析
[0132]
序列比对鉴定结果发现，5种樱桃砧木京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10共计10株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0133]
实施例5
[0134]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份樱桃砧木的基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行5种樱桃砧木品种鉴定，同时加入已知品种的5种樱桃砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0135]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各取2株，提取基因组dna；
[0136]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10各2株，提取基因组dna；
[0137]
(3)从7134个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定5种樱桃砧木品种的snp位点群见表6；
[0138]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表7；
[0139]
(5)利用表7中5种樱桃砧木的通用引物进行pcr扩增；
[0140]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0141]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行樱桃砧木品
种的分型判读。
[0142]
具体的操作步骤如下：
[0143]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0144]
1、pcr扩增
[0145]
根据表6中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表7。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0146]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0147]
2.测序
[0148]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0149]
3.序列比对
[0150]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明7134个 snp位点中筛选的一个snp位点标记群(见表6)进行5种樱桃砧木品种的分型。
[0151]
4.分析
[0152]
序列比对鉴定结果发现，5种樱桃砧木品种京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉 5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10共计10株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0153]
从7134个snp位点中挑取其他snp位点标记群，同样可以准确鉴定京春3号
‑‑
h11，兰丁3号
‑‑
h22、吉塞拉5#、京春1号
‑‑
h10和兰丁2号
‑‑
f10这5种樱桃砧木品种。
[0154]
本发明的表1如下：
[0155]
表1中，数字1-5分别代表：京春3号-h11，兰丁3号-h22、吉塞拉5#、京春1号-h10 和兰丁2号-f10
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
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