表达嵌合抗原受体的γδT细胞的制作方法

表达嵌合抗原受体的
γδ
t细胞
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种表达嵌合抗原受体的γδt细胞。


背景技术：

2.γδt细胞是一群独特且保守的淋巴细胞，它们潜在的抗肿瘤活性，在最近引起了人们开发针对多种癌症的γδt细胞免疫疗法的巨大兴趣。
3.许多研究表明，用编码gd2或cd19特异性cars的逆转录病毒载体转导的外周血来源的vγ9vδ2t细胞高表达car，易于扩增，并显示出抗原特异性ifn
‑
γ的分泌和对肿瘤细胞靶标的细胞毒性。这些体外试验表明，表达car的γδt细胞可作为有效的特异性抗肿瘤效应细胞。最近，deniger等人进行的一项研究显示，在体外氨基双膦酸盐扩增的vγ9vδ2car
‑
t细胞可以分泌促炎细胞因子，在体外杀死cd19
+
肿瘤细胞系，并且也可以在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长。除car介导的刺激外，γδtcr对肿瘤抗原的直接识别及其随后的信号级联反应可能对car
‑
γδt细胞具有叠加的刺激作用。
4.第二代car的胞内结构域包括共刺激结构域和第一刺激信号结构域。多项研究表明，不同共刺激域和cd3ζ的这些组合使第二代car优于第一代car。然而，car的第一刺激信号结构域cd3ζ和共刺激域的最佳组合仍有待确定。最常用的共刺激结构域来自cd28和4
‑
1bb，并已在几项研究中进行了比较，但是直到今天，结果仍存在争议。
5.此外，还有一个问题尚未解决，针对γδt细胞的car设计是否可能需要根据γδtcr分子结构和共刺激信号进行优化。研究表明，γδt细胞表达一系列共刺激分子，例如cd28，cd27和4
‑
1bb(cd137)。ribot等人的研究表明cd28在γδt细胞上组成性表达，并通过产生il
‑
2促进存活和增殖。在另一项研究中，debarros及其同事研究了cd27共刺激对人γδt细胞活化的影响。他们发现，使用可溶性重组cd70(cd27配体)可增强vγ9vδ2t细胞在体外的扩增能力。此外，cd27信号不仅促进细胞周期蛋白d2和抗凋亡基因调节剂bcl2a1的上调，而且还诱导产生高水平的ifn
‑
γ。因此，应探索tcrγδ和cd27信号之间的协同作用，以用于vγ9vδ2t细胞的临床扩增。激活后的γδt细胞也表达cd137(4
‑
1bb)。有趣的是，maniar等研究证明激活的vγ9vδ2t细胞表达高水平的cd137l，可以充当t细胞和nk细胞上cd137的配体，并且还可能通过逆转信号转导在vγ9vδ2t细胞激活中起作用。类似的可能性也可能适用于cd70，其在磷酸抗原刺激后在vγ9vδ2t细胞中的表达高度上调，但这需要进一步研究。宋等报道表达具有cd27信号域的cars的αβt细胞表现出增殖能力的增强，bcl
‑
xl的上调和对细胞凋亡的抵抗。他们的结果还表明，这些细胞对肿瘤的消退作用与cd28或cd137共刺激的car相似，并且体内持久性优于cd28和4
‑
1bb。
6.由此可见，目前针对γδt细胞的car结构的共刺激信号的选择还不明朗，难以实现所期望的抗肿瘤效果。
7.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的第一目的在于提供一种表达嵌合抗原受体的γδt细胞，所述嵌合抗原受体包含a)抗原识别域，b)铰链区，c)跨膜域和d)胞内信号传导区；
9.所述胞内信号传导区包括cd3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括dap10。
10.本发明的第二目的在于提供一种药用组合物，其包含如上所述的γδt细胞。
11.本发明的第三目的在于提供一种如上所述的γδt细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
12.本发明通过对比几种常用的共刺激域组合，发现dap10共刺激域更加适合γδt细胞的car基因修饰，具有dap10共刺激域的car
‑
γδt细胞拥有更强的增殖能力和更长的存续持久性、肿瘤杀伤能力以及抗凋亡能力。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为本发明一个实施例中car
‑
γδt制备流程图；
15.图2为本发明一个实施例中各组细胞在day14和day16的car表达情况；
16.图3为本发明一个实施例中各组细胞在有/无抗原刺激时的细胞数量；a，抗原刺激时，在day10，day17和day25各组细胞的细胞数量；b，无抗原刺激时，在day10，day17和day25各组细胞的细胞数量；
17.图4为本发明一个实施例中各组细胞在体外对cd19阳性和cd19阴性细胞的杀伤情况；a，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)，各组细胞对raji
‑
luc细胞的杀伤效果；b，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)，各组细胞对k562
‑
luc细胞的杀伤情况；
18.图5为本发明一个实施例中评估嵌合共刺激受体(ccrs)结构杀伤raji情况(效靶比1:1)。
具体实施方式
19.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
20.除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
21.本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
22.本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
23.本发明涉及一种表达嵌合抗原受体的γδt细胞，所述嵌合抗原受体包含a)抗原识别域，b)铰链区，c)跨膜域和d)胞内信号传导区；
24.所述胞内信号传导区包括cd3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括dap10。
25.如本文所用，“嵌合抗原受体(car)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(car)”有时称为“嵌合受体”、“t
‑
body”或“嵌合免疫受体(cir)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
26.如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。
27.如本文所用，“抗原识别域”是指能够特异性识别并结合抗原的域，包括但不限于：单链可变片段，羊驼抗体，配体等组成的的单一或串联结构，分别识别单一或两个抗原靶标。“单链可变片段(sc
‑
fv)”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。sc
‑
fv的实例包括经重组dna技术形成的抗体多肽并且其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。制备sc
‑
fv的多种方法是已知的，包括描述于以下文献的方法：美国专利号4694778；science，第242卷，第423
‑
442页(1988)；nature，第334卷,第54454页(1989)；和science，第242卷，第1038
‑
1041页(1988)。
28.在一些实施方式中，所述dap10氨基酸序列如seq id no:1所示。
29.在一些实施方式中，其共刺激域还包括cd28、4
‑
1bb、ox40、icos、cd27、cd40
‑
myd88、dap12、2b4中的一种，或其任何组合中的任一种。
30.在一些实施方式中，其共刺激域还包括cd28或4
‑
1bb。
31.在一些实施方式中，所述cd28氨基酸序列如seq id no:2所示。
32.在一些实施方式中，所述4
‑
1bb氨基酸序列如seq id no:3所示。
33.在一些实施方式中，抗原识别域区特异性识别肿瘤抗原。“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，新近认识到其表达与细胞癌化相关。检测，例如，肿瘤抗原的免疫学检测可用于区分癌化细胞及其母细胞。本发明中的肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(仅在肿瘤细胞中存在、而在其它正常细胞中不存在的抗原)和肿瘤相关抗原(也存在于其它器官和组织或异质和同种异体的正常细胞中的抗原，或在发育和分化过程中表达的抗原)。在一些实施方式中，所述肿瘤为血液瘤或者实体瘤，在一些实施方式中，实体瘤包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤可被靶向，例如胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多
发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。
34.在一些实施方式中，所述抗原识别域为特异性识别并结合如下抗原分子中的至少一种：
35.α
‑
甲胎蛋白、α
‑
辅肌动蛋白
‑
4、a3、对a33抗体具有特异性的抗原、art
‑
4、b7、ba 733、baff
‑
r、bage、bcma、bre3抗原、ca125、camel、cap
‑
1、碳酸酐酶ix、casp
‑
8/m、ccl19、ccl21、cd1、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd29、cd30、cd32b、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd46、cd52、cd54、cd55、cd56、cd59、cd64、cd66a/b/c/e、cd67、cd70、cd70l、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd83、cd95、cd117(c
‑
kit)、cd123、cd126、cd132、cd133、cd138、cd147、cd154、cd319(cs1,slamf7)、cd371(cll
‑
1)、cdc27、cdk
‑
4/m、cdkn2a、ctla4、cxcr4、cxcr7、cxcl12、hif
‑
1α、结肠特异性抗原p(csap)、cea(ceacam
‑
5)、ceacam
‑
6、c
‑
met、dam、egfr、egfrviii、egp
‑
1、egp
‑
2、elf2
‑
m、ep
‑
cam、纤维母细胞生长因子(fgf)、flt
‑
1、flt
‑
3、叶酸受体、g250抗原、gage、gp100、gro
‑
β、gprc5d、hla
‑
dr、hm1.24、人绒毛膜促性腺激素(hcg)和它的亚单位、her2/neu、hmgb
‑
1、缺氧诱导性因子(hif
‑
1)、hsp70
‑
2m、hst
‑
2、ia、igf
‑
1r、ifn
‑
γ、ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
λ、il
‑
4r、il
‑
6r、il
‑
13r、il
‑
15r、il
‑
17r、il
‑
18r、il
‑
2、il
‑
6、il
‑
8、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
17、il
‑
18、il
‑
23、il
‑
25、胰岛素样生长因子1(igf
‑
1)、igκ、il1rap、lewis y、lmp1、kc4抗原、ks
‑
1抗原、ks1
‑
4、le
‑
y、ldr/fut、巨噬细胞迁移抑制因子(mif)、mage、mage
‑
3、mart1、mart
‑
2、ny
‑
eso
‑
1、trag
‑
3、mcrp、mcp
‑
1、mmg49、mip
‑
1a、mip
‑
1b、mif、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc13、muc16、mum
‑
1/2、mum
‑
3、nca66、nca95、nca90、nkg2d、胰腺癌粘蛋白、pd1受体(pd
‑
l1)、胎盘生长因子、p53、plagl2、前列腺酸性磷酸酶、psa、prame、psma、plgf、ilgf、ilgf
‑
1r、il
‑
6、il
‑
25、rs5、rantes、ror1、t101、sage、s100、存活素、存活素
‑
2b、tac、tag
‑
72、腱生蛋白、trail受体、tnf
‑
α、tn抗原、汤姆逊
‑
弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、vegfr、ed
‑
b纤连蛋白、wt
‑
1、17
‑
1a抗原、补体因子c3、c3a、c3b、c5a、c5、血管生成标志物、bc1
‑
2、bc1
‑
6、kras、致癌基因标志物和致癌基因产物。
36.在一些实施方式中，所述抗原识别域为特异性识别并结合血液系统相关肿瘤的抗原，例如下表所示：
37.[0038][0039]
在一些实施方式中，所述抗原识别域为fmc63的单链抗体。在一些实施方式中，所述单链抗体氨基酸序列为seq id no：6所示。
[0040]
在一些实施方式中，所述铰链区为cd8α的hinge区，在一些实施方式中，其氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0041]
在一些实施方式中，所述跨膜域为cd8α跨膜区，在一些实施方式中，其氨基酸序列为seq id no：5所示。
[0042]
应当理解，本发明所涉及的“区”或者“域”，可以选自与它们各自所对应的示例序列，例如seq id no：1～5中的任一项的氨基酸序列，或与之具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，且保留相应所需功能的实质上相似的序列。
[0043]
实质上相似的序列亦保留多肽的所需活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸ala、val、leu和ile中的彼此置换、羟基残基ser和thr的互换、酸性残基asp和glu的交换、酰胺残基asn和gln之间的置换、碱性残基lys和arg的交换以及芳香残基phe、tyr间的置换。进一步的，实质上相似的序列还包括与所需功能差异不大的经过修饰的序列，这些修饰例如磷酸化、糖基化、泛素化等。
[0044]
根据本发明的再一方面，还涉及药用组合物，其包含如上所述的γδt细胞。
[0045]
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(pbs)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，remington's pharmaceutical sciences,第18版，a.gennaro编,
mack publishingco.,easton,pa,1990；和remington,the science and practice of pharmacy,第21版,mack publishing,2005)。
[0046]
根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的γδt细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
[0047]
肿瘤可以为如上所定义的肿瘤。
[0048]
根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的γδt细胞，从而治疗该癌症。
[0049]
肿瘤可以为如上所定义的肿瘤。
[0050]
应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、n
‑
803(也被称为alt
‑
803，altor生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，nhs
‑
il12，il
‑
12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。
[0051]“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。
[0052]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0053]
实施例1 car设计
[0054]
本实施例采用抗cd19的抗体fmc63的单链抗体(scfv)作为抗原结合域，结合cd8α信号肽、cd8α铰链区和跨膜区、不同的共刺激域和cd3ζ信号传导结构域，构建靶向cd19的第二代和第三代car，常见的共刺激域包括4
‑
1bb、cd28、dap10等。
[0055]
be137(486aa)：4
‑
1bb共刺激域
[0056]
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[0057]
be28(485aa)：cd28共刺激域
[0058]
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[0059]
bed(468aa)：dap10共刺激域
[0060]
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lliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyclcarprrspaqedgkvyinmpgrgrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr//
[0061]
bed137(510aa)：4
‑
1bb和dap10共刺激域
[0062]
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[0063]
bed28(509aa)：cd28和dap10共刺激域
[0064]
//malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyclcarprrspaqedgkvyinmpgrgrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr//
[0065][0066]
本实施例采用抗cd19的抗体fmc63的单链抗体(scfv)作为抗原结合域，结合cd8α信号肽、cd8α铰链区和跨膜区、不同的共刺激域，构建靶向cd19的含有共刺激结构域的嵌合共刺激受体(ccrs)，常见的共刺激域包括4
‑
1bb、cd28、dap10等。因为ccrs缺乏cd3ζ信号传导结构域，因此ccrs本身只传递第二信号(共刺激信号)，而不提供第一信号(杀伤信号)。在γδt中，第一信号可通过γδt细胞本身的γδtcr来识别肿瘤细胞上的磷酸抗原来激活。因此，我们在本实施例中也设计了分别含有4
‑
1bb、cd28、dap10三种共刺激域的嵌合共刺激受体(ccrs)，以评估他们的杀瘤能力。
[0067]
含有共刺激结构域的嵌合共刺激受体(ccrs)
[0068]
ccr名称靶点共刺激域来源cd3ζ信号传导结构域氨基酸数量ccr137cd194
‑
1bb无374aaccr28cd19cd28无373aa
ccrdcd19dap10无356aa
[0069]
ccr137(374aa)：4
‑
1bb共刺激域
[0070]
//malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel//
[0071]
ccr28(373aa)：cd28共刺激域
[0072]
//malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs//
[0073]
ccrd(356aa)：dap10共刺激域
[0074]
//malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyclcarprrspaqedgkvyinmpgrg//
[0075]
实施例2制备car
‑
γδt细胞
[0076]
制备流程图如图1所示。利用外周血淋巴细胞分离液ficoll分离健康人外周血中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)，并置于含10％胎牛血清、1％双抗和1000iu/ml il
‑
2的gt
‑
t551 h3 culture medium(takara)完全培养基中，同时添加终浓度为5um的唑来膦酸(zol)，调整细胞密度为2
×
106个/ml。培养2天(day 2)后，用完全培养基调整细胞密度为1
‑2×
106个/ml。day 4或者day 5，离心收集细胞，进行病毒感染。
[0077]
day4，使用retronectin包被非组织培养处理的24孔板，将retronectin母液用pbs液稀释至40ug/ml，添加1ml至24孔板中；用封口膜封闭，4℃过夜孵育。day5，吸弃retronectin，用2％人血清白蛋白室温封闭30min，然后用pbs洗一遍；将逆转录病毒加至包被的孔中，培养板于32℃，1500g离心2h；然后吸弃病毒，用pbs洗一遍孔。将离心收集的γδt细胞，用新鲜的完全培养基重悬至1
×
106cells/ml；前后左右晃匀细胞，将孔板于32℃1500g离心30min
‑
2h，然后在37℃培养箱中继续过夜培养。
[0078]
day 6，再次进行一遍上述操作：包被，负载，感染。
[0079]
day 7，收集每孔的细胞，离心，然后用pbs洗一遍，用完全培养基重悬，接种至新的孔板中，接种密度为1
‑
1.5
×
106个细胞/ml。
[0080]
day9进行αβt细胞的去除：工作缓冲液(pbs，ph7.2，0.5％bsa，2mm edta)。
[0081]
磁珠标记：
[0082]
1.计数细胞，用dpbs洗一遍，将细胞300g离心10min，完全吸弃上清；
[0083]
2.用40ul工作缓冲液重悬细胞；
[0084]
3.加入10ul anti
‑
tcrγ/δhapten
‑
antibody/107细胞；
[0085]
4.混匀后在4～8℃孵育10min；
[0086]
5.加入30ul工作缓冲液和20ul macs anti
‑
hapten microbeads
‑
fitc；
[0087]
6.混匀后在4～8℃孵育15min；
[0088]
7.加入1～2ml工作缓冲液洗细胞，300g离心10min，完全吸弃上清；
[0089]
8.用500ul工作缓冲液重悬细胞；
[0090]
ls柱准备
[0091]
将ls柱插入分离器中，并将分离器吸附至磁力架上，在柱子的下方放置收集管。
[0092]
使用3ml去除气泡的工作缓冲液冲洗柱子，缓冲液自然滴落，丢弃流出液，并更换收集管，这时柱子就可以使用了。
[0093]
磁选：
[0094]
1.为了去除细胞团块，可先将细胞进行30um细胞筛过滤。
[0095]
2.将细胞悬液加至冲洗后的ls柱内。
[0096]
3.收集未标记的细胞，并用3ml去除气泡的工作缓冲液清洗柱子三遍，收集所有的流穿液，便是未标记的组分。
[0097]
4.将柱子和磁分离器分开，并将柱子放置于15ml离心管中；
[0098]
5.加入5ml工作缓冲液至柱子内，立即用试剂盒内的栓塞将标记的细胞冲出，即为纯化的γδt细胞。
[0099]
去除αβt细胞的γδt细胞用完全培养基以1
‑
1.5
×
106个细胞/ml接种培养，每2
‑
3天进行补液，调整细胞密度为1
‑
1.5
×
106个细胞/ml，连续培养至day14
‑
day16。
[0100]
在day14和day16时，取部分细胞进行抗体染色，检测car的表达情况。离心收集细胞，用含1％bsa的pbs洗一遍，接着用fitc
‑
protein l配制染色液于室温下避光孵育40min，然后用含1％bsa的pbs洗两遍，最后用200ul含1％bsa的pbs重悬细胞进行流式检测，检测结果如图2所示。
[0101]
实施例3 car
‑
γδt的体外扩增和存续持久性
[0102]
制备car
‑
γδt过程中，在day10分别取部分细胞，离心收集细胞。计数，用完全培养基稀释至1
×
106个/ml，接种至24孔板中。car
‑
γδt在d17天用抗原刺激一次(反复冻融后的raji细胞)或者不刺激，连续培养至day25，记录细胞数量。
[0103]
从图3中可知，相比于cd28和4
‑
1bb共刺激域，在有抗原刺激时，具有dap10共刺激域的car
‑
γδt都具有更多的细胞数。
[0104]
实施例4car
‑
γδt的体外杀伤功能
[0105]
分别将未经转导的对照γδt细胞、be
‑
car
‑
γδt细胞、be28
‑
car
‑
γδt细胞bed
‑
car
‑
γδt细胞、bed28
‑
car
‑
γδt和bed137
‑
car
‑
γδt与肿瘤细胞(raji
‑
luc和k652
‑
luc)共培养，效靶比(e：t)分别为10：1、3：1和1：1，接种至黑色96孔板，共孵育4
‑
6h后，加入荧光素酶底物(promega，bright
‑
glo
tm
luciferase assay system)，于多功能酶标仪上检测荧光值，根据公式计算杀伤率：(1
‑
rlu
实验组
/rlu
target only组
)
×
100％。
[0106]
如图所示，共孵育4
‑
6h后，各car
‑
γδt均可特异性杀伤肿瘤细胞，在低效靶比(1：1和3：1)时，bed
‑
car
‑
γδt、bed137
‑
car
‑
γδt和bed28
‑
car
‑
γδt相对于be137
‑
car
‑
γδt和
be28
‑
car
‑
γδt具有更高的肿瘤杀伤能力，这提示相对于其他结构，含dap10的载体更适合car
‑
γδt的基因修饰。
[0107]
本实施例还构建了靶向cd19的含有共刺激结构域的嵌合共刺激受体(ccrs)，设计了分别含有4
‑
1bb、cd28、dap10三种共刺激域的嵌合共刺激受体(ccrs)，ccr137、ccr28和ccrd，以评估他们的杀瘤能力。结果如图5所示，不含cd3ζ信号传导结构域的三种嵌合共刺激受体(ccrs)结构，在效靶比1:1情况下，对raji靶细胞的杀伤能力普遍较弱。
[0108]
综上所述，含dap10的car
‑
γδt(bed、bed28和bed137)对肿瘤具有更强的杀伤能力，说明dap10作为共刺激域更适用于嵌合抗原受体修饰的γδt的信号传导，使其拥有更优的扩增能力和抗肿瘤效能。
[0109]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0110]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。