一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法及应用

一种豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株的构建方法及应用。


背景技术：

2.在自然界氮素循环系统中，根瘤菌
‑
豆科植物共生固氮体系是化合态氮的主要来源之一。在共生过程中，土壤中的根瘤菌首先通过豆科植物根毛侵入，形成侵染线，进入根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤。根瘤菌则进入根瘤细胞，并继续繁殖，分化为类菌体。在根瘤中，类菌体含有的固氮酶可以将大气中的氮气还原成氨为植物提供氮源，植物则通过光合作用为根瘤菌提供碳源和固氮所必需的厌氧环境。生物固氮占全球年固氮总量的85％，而豆科植物
‑
根瘤菌共生体系是生物固氮的主要方式。由于在氮素化肥生产中伴随着日益严重的能源耗费和环境污染问题，人们认识到，接种性能优良的根瘤菌来提高共生固氮效率，从而提高生物固氮在现代农业生产的比重，进而控制氮素化肥用量，对农业生态环境保护和可持续发展都有重要作用。
3.豌豆是我国重要的食用豆类作物之一，因其营养丰富、用途广、生长周期短、易成熟而备受青睐。豌豆根瘤菌可以侵染豌豆植株的根部形成共生固氮根瘤。由于共生固氮提供了豌豆所需氮肥，因此要获得豌豆的丰产和较高的经济效益，必须充分发挥豌豆根瘤菌的共生固氮作用。豌豆对环境的适应能力强，有较强的耐酸、耐盐等能力，但是与豌豆进行共生的根瘤菌对酸性、高盐等环境的耐受能力较差，而且与土著菌相比，接种豌豆根瘤菌的植株竞争能力较差。这就要求获得环境适应性强、抗逆性强，共生结瘤能力强的豌豆根瘤菌株用于接种，以提高豌豆
‑
豌豆根瘤菌固氮的有效性，从而达到减少施加氮肥，并使豌豆增产的目的。豌豆根瘤菌外排系统emrab是一类存在于细胞膜上的蛋白质。豌豆根瘤菌可以通过外排系统emrab泵的特殊转运蛋白将药物、氧化物等从其胞内泵出到外部环境，从而导致豌豆根瘤菌的多药耐药性(mdr)。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了一种提高豌豆根瘤菌环境适应能力和结瘤效率的方法，以及一种豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株和构建方法。
5.本发明的技术方案为一种豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株，通过将质粒pjqemrrωspe导入豌豆根瘤菌rl3841菌株中得到。
6.豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株的构建方法，包括以下步骤：
7.步骤1.根据种豌豆根瘤菌rl3841菌株的emrr基因序列设计引物，扩增得到目的片段；
8.步骤2.将质粒pmd
‑
19t与目的片段连接后转化导入感受态细胞dh5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切后，测序验证得到阳性克隆质粒pmdemrr；
9.步骤3.将质粒pph45ωspe用sma i单酶切后获得的ωspe片段与经过fsp i单酶切
后的pmdemrr进行连接，转化导入感受态细胞dh5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，验证筛选得到阳性克隆质粒pmdemrrωspe；
10.步骤4.将pmdemrrωspe质粒用xba i和xho i进行双酶切后获得的emrrωspe片段与经过xba i和xho i双酶切后pjq200sk质粒酶连并转化感受态细胞dh5α抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，测序验证获得阳性克隆质粒pjqemrrωspe；
11.步骤5.通过三亲本接合，将供体菌pjqemrrωspe导入豌豆根瘤菌rl3841菌株中，经过抗性初筛、蔗糖致死复筛及庆大霉素抗性排除假阳性，挑取单菌落重组子，进行菌落pcr验证，构建豌豆根瘤菌rl3841菌株突变株即豌豆根瘤菌rlemrr。
12.而且，步骤1中引物为：
[0013]5’
aaaaagcttctattacggccatgattact3’[0014]
以及5’aaatctagattgcataggaaaggttgagc3’。
[0015]
而且，步骤5中进行菌落pcr验证所用引物为：
[0016]
ωspe特异引物5’cggtttacaagcataaagc3’[0017]
以及豌豆根瘤菌rl3841基因组引物5’cctagatgccggcaagacgc3’。
[0018]
以及上述构建方法在提高豌豆根瘤菌环境适应能力和/或结瘤效率中的应用。
[0019]
而且，所述提高环境适应能力为对十二烷基硫酸钠、过氧化氢、过氧化氢异丙苯和结晶紫的抗性。
[0020]
而且，所述提高结瘤效率为提高共生结瘤和竞争结瘤能力。
[0021]
与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种构建豌豆根瘤菌emrab外排系统突变菌株的方法，并提供了一株具有较强环境适应能力和结瘤效率的豌豆根瘤菌rhizobium leguminosarum rlemrr突变菌株。该菌株具有很强的根际和植株根部共生生存能力，能接种豌豆植株形成更多具有固氮能力的根瘤。而且其产生的菌株适用范围广，具有抗氧化物和药物，耐高温、耐酸和高盐的特性，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0022]
图1为豌豆根瘤菌emrab外排系统操纵子。rl90058，prl90058基因；rl90059，prl90059基因；rl90060，prl90060基因；
[0023]
图2为emrr基因突变体rlemrr的构建过程。其中a)emrr基因的pcr扩增片段；b)含有pmdemrr质粒的酶切检测，1为pmd
‑
19t空载体，4位重组质粒pmdemrr；c)重组质粒pmdemrrωspe的酶切检测，1为pmdemrrωspe。d)重组质粒pjqemrrωspe的酶切检测，1为pjqemrrωspe。e)突变株rlemrr的菌落pcr检测，1为rl3841对照，2为rlemrr。m1为1kb dna ladder marker，m2为dl2000 marker；
[0024]
图3为100mmol/l的cuooh对野生型rl3841和突变株rlemrr的抑菌效果。a)rl3841；b)rlemrr；
[0025]
图4为ph 5.5条件下野生型rl3841和突变株rlemrr的生长情况。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。
[0027]
实施例1豌豆根瘤菌rl3841菌株emrab外排系统
[0028]
在ncbi上通过生物信息学分析发现豌豆根瘤菌rl3841中有三个与多药耐药(mdr)外排泵相关的操纵子：emra(prl90059)，emrb(prl90060)和emrr(prl90058)，它们的基因结构如图1。emra基因编码蛋白属于hlyd家族分泌蛋白，类似于多药耐药外排泵mfs转运体周质亚基emra和内膜蛋白yibh；emrb基因编码蛋白是一种药物/h
+
逆向转运体，介导一种或多种药物和有毒化合物的外排，并对这些化合物产生耐药性；这两个基因组成了mfs外排系统emrab操纵子的核心结构。在这两个基因的上游还存在着一个tetr家族转录调控因子emrr，该基因长度为648bp，编码含有215个氨基酸的蛋白质，豌豆根瘤菌emrr基因序列如seq id no.1所示。emrr基因对emrab操纵子起负调控作用，该基因缺失将提高豌豆根瘤菌抗生素抗性、应激反应、抗逆性以及多药耐药等方面的性能。
[0029]
实施例2豌豆根瘤emrr基因突变株豌豆根瘤菌rlemrr的构建
[0030]
利用引物5’aaaaagcttctattacggccatgattact3’[0031]
以及5’aaatctagattgcataggaaaggttgagc3’，以3841总dna为模板，扩增得到的目的片段大小约为1.6kb(图2a)。将质粒pmd
‑
19t与目的片段连接后转化导入感受态细胞dh5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切后，获得4.7kb左右条带(图2b)，测序验证得到阳性克隆质粒pmdemrr。将质粒pph45ωspe用sma i单酶切后获得的ωspe片段与经过fsp i单酶切后的pmdemrr进行连接，转化导入感受态细胞dh5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切验证获得6.5kb左右片段(图2c)，从而成功筛选出阳性克隆质粒pmdemrrωspe。将pmdemrrωspe质粒用xba i和xho i进行双酶切后获得的emrrωspe片段与经过xba i和xho i双酶切后pjq200sk质粒酶连并转化感受态细胞dh5α抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切验证(图2d)，经测序验证后，获得阳性克隆质粒pjqemrrωspe。通过三亲本接合，将供体菌pjqemrrωspe导入rl3841中，经过抗性初筛、蔗糖致死复筛及庆大霉素gm抗性排除假阳性，挑取单菌落重组子。以ωspe特异引物5’cggtttacaagcataaagc3’以及rl3841基因组引物5’cctagatgccggcaagacgc3’进行菌落pcr验证，得到1.3kb左右条带(图2e)，从而成功构建emrr基因突变株rlemrr。
[0032]
实施例3豌豆根瘤菌突变株rlemrr对药物和氧化物的抗性
[0033]
为了研究基因缺失突变体对阴离子洗涤剂(十二烷基硫酸钠sds)、氧化应激剂(h2o2、过氧化氢异丙苯cuooh)、用于筛选细胞壁扰动的亲脂性细胞生长抑制剂(结晶紫cv)的敏感性。将野生型及突变体涂布于不加抗生素的ty平板，待平板晾干后，将浸有相应化合物的滤纸片放置平板中央，记录抑菌圈直径大小并拍照(图3)。结果如表1所示，与野生型3841相比，rlemrr突变体对所有受试化合物的敏感性低于野生型rl3841，其对氧化物h2o2、cuooh，阴离子洗涤剂sds，药物结晶紫的抗性都显著提高，表明emrr阻遏物缺失使emrab的表达量增加，从而增加了rlemrr缺失突变体对阴离子洗涤剂、药物和氧化物的抗性。emrab的功能涉及抗生素耐药性和对有毒化学物质的耐受性，并参与调节网络，涉及代谢稳态、渗透胁迫、群体感应、抗生素生物合成以及致病性。emrr基因对各种环境压力起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而提高了豌豆根瘤菌对药物和氧化物的抗性。
[0034]
表1野生型rl3841与突变体rlemrr对氧化物和药物的抗性
[0035][0036]
注:
a,b
表中同一列不同字母表示差异显著(p<0.05)。
[0037]
实施例4豌豆根瘤菌突变株rlemrr的谷胱甘肽含量
[0038]
谷胱甘肽(gsh)是广泛存在于细胞中的一种活性巯基短肽，对于维持细胞正常的氧化还原环境具有重要作用。将已活化的rl3841与rlemra、rlemrr突变体接种到50ml ams液体培养基中，30℃200rpm摇床生长至对数期，参照碧云天gsh和gssg检测试剂盒中说明书，处理待测样品并制备标准品。按照说明书内的体系表在96孔板中依次加入样品或标准品，然后加入150μl总谷胱甘肽检测工作液充分混匀，室温孵育5min。加入50μl 0.5mg/ml nadph溶液，吹打混匀。反应30min后用酶标仪测定a
405
。根据不同浓度标准品测得的不同吸光度作出标准曲线。样品对照标准曲线即可计算出总谷胱甘肽(标准曲线计算得到的gssg浓度
×
2)或gssg(氧化型谷胱甘肽)的含量。根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和gssg的含量就可以计算出gsh(还原型谷胱甘肽)的含量。计算公式为：gsh＝total glutathione
‑
gssg
×
2。结果表明，豌豆根瘤菌野生型菌株的gsh含量为11.66
±
1.16，rlemrr突变体中的gsh含量为31.42
±
2.39，含量显著增加了2.7倍。表明缺乏emrr阻遏子的调控使根瘤菌谷胱甘肽合成能力增强，从而提高了菌株对h2o2、sds等氧化物的抗性。
[0039]
实施例5豌豆根瘤菌突变体rlemrr的耐酸能力
[0040]
为了确定突变体的耐酸性，将细胞暴露于酸性环境中并监测其生长。将野生型rl3841与rlemrr突变体分别接种到ph 5.5的ams培养基中，使菌液初始od
600
在0.01，每组样品3个重复，间隔取样测od
600
值，绘制生长曲线结果如图4所示。在25h左右，野生型和突变体的生长进入对数期。在40h左右，野生型和突变体的生长进入稳定期。在59小时，rlemrr突变体od
600
值为0.768
±
0.0015，而野生菌株rl3841的od
600
值为0.695
±
0.018，rlemrr突变体的生物量高于野生菌株rl3841，显著增加了11％，表明在ph 5.5条件下，rlemrr突变体表现出较高的耐酸性。emrr基因对酸性环境起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而提高了豌豆根瘤菌耐酸能力。
[0041]
实施例6豌豆根瘤菌突变体rlemrr的耐热能力
[0042]
为了研究基因缺失突变体的耐热性，将相同菌量的豌豆根瘤菌rl3841和突变株rlemrr在40℃水浴锅中保温15min。稀释涂布于不加抗生素的ty平板，观察菌株菌落数，统计菌株存活数量，每个样品3个重复。结果表明在40℃处理条件下豌豆根瘤菌突变体rlemrr的存活率比野生型显著提高了2.86倍。在rlemrr突变体中，emrr阻遏解除，从而使emrab基因的表达增加，进而使该突变株的耐热性显著高于野生型和其它突变株。emrr基因对高温压力起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而提高了豌豆根瘤菌耐高温能力。
[0043]
实施例7豌豆根瘤菌突变体rlemrr的耐盐能力
[0044]
为了研究基因缺失突变体对于渗透压下的生长能力，将豌豆根瘤菌rl3841和突变株rlemrr在ams培养液中培养13h，然后添加0.3m nacl，继续培养到21h、45h取样测od
600
值，并记录数据，每个样品3个重复。结果表明，培养21小时后豌豆根瘤菌突变体rlemrr的od
600
值为0.537
±
0.015，而野生菌株rl3841的od
600
值为0.506
±
0.002，生长量显著提高了6％，表明豌豆根瘤菌突变体有更强的耐盐性。emrr基因对高盐环境起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而提高了豌豆根瘤菌耐高盐能力。
[0045]
实施例8豌豆根瘤菌突变体rlemrr的结瘤能力
[0046]
以蛭石播种甜豌豆种子，蛭石经过高压蒸汽灭菌锅121℃，1h灭菌。甜豌豆种子经过95％乙醇消毒、2％次氯酸钠水溶液消毒、无菌水清洗3次后播种于含有营养液并已灭菌的蛭石中。每钵播种2颗豌豆种子，并每颗接种1ml相应的菌液，每种菌液3钵重复。播种完毕后用保鲜膜封口，置于光照培养箱培养。22℃、湿度70％，光照培养16h；20℃、湿度70％，黑暗培养8h。培养7天后，用无菌牙签挑破保鲜膜使幼苗继续生长，定期浇灌营养液。接种豌豆根瘤菌rl3841和突变株rlemrr的豌豆在光照培养箱中培养4周后观察根瘤并统计结瘤数。突变株形成红色固氮根瘤，但与接种野生型rl3841植株相比，豌豆根瘤菌突变体rlemrr的每个植株根瘤数79，而接种野生型rl3841的每个植株根瘤数71，豌豆根瘤菌突变体rlemrr形成的根瘤数比野生型rl3841增加了11％以上。由此可知，emrr基因对根瘤菌结瘤起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而促进根瘤菌在豌豆植株的结瘤能力。
[0047]
实施例9豌豆根瘤菌突变体rlemrr的竞争结瘤能力
[0048]
以蛭石播种甜豌豆种子，配置豌豆根瘤菌rl3841与突变体rlemrr cfu比例为107：107的混合菌液接种豌豆种子，培养4周后每钵取60个根瘤，分别接种于str和str+neo的ty平板，由于突变株能在ty+str+neo和ty+str两种抗性平板上存活，而野生型rl3841只能在ty+str的培养基上存活，因此可以统计出野生型菌株和突变株的数量，从而计算豌豆根瘤菌突变体rlemrr的占瘤率。结果表明，豌豆根瘤菌rlemrr突变株的占瘤率为78％，而豌豆根瘤菌野生型rl3841的占瘤率仅为22％，rlemrr突变株形成根瘤数是野生型菌株rl3841形成根瘤数3.54倍。由此可知，豌豆根瘤菌emrr基因对结瘤起负调控作用，emrr基因突变解除了抑制，增加了外排系统emrab的表达，从而促进根瘤菌的竞争结瘤能力，进而提高菌株的植株结瘤数量。