一种酶法催化制备天麻素三酯的方法

1.本发明属于生物催化和药物化学领域，具体涉及一种酶法催化制备天麻素三酯的方法。


背景技术：

2.天麻素，属于小分子酚苷类化合物，是中药天麻中的一种有效天然活性成分，在临床上主要用于镇静，镇痛，眩晕及心血管疾病等。研究表明，天麻素通过抗氧化应激、抑制神经炎症、减轻神经细胞凋亡、调节神经递质等机制作用于脑部，是潜在的中枢神经疾病治疗药物。但由于天麻素的结构限制导致其脂溶性较差，难以透过血脑屏障，进而降低了其生物利用度，极大地影响到它们的开发和应用。
3.目前，关于增强天麻素血脑屏障透过率的研究进展主要有以下两个方面：1.采用注射或鼻腔给药等方式绕过血脑屏障；2.采用一些物理或化学手段对天麻素进行结构修饰。但是注射给药具有易感染的风险，鼻腔给药易引起鼻黏膜的病理变化，且给药剂量较小。在结构修饰方面，化学法修饰天麻素主要是通过强酸或强碱进行催化，酸、碱催化剂的大量使用导致严重的环境污染问题,而且存在化学合成的区域选择性差，副产物多，产率较低等缺点。物理法将天麻素制成纳米脂质体或磷脂复合物进行剂型改造，虽然一定程度上能提高其生物利用度，但价格昂贵，生产成本高。相较于化学法和物理法，生物催化具有专一性强,反应条件温和，反应速率快，成本低的特点。
4.目前天麻素的药代动力学表明，天麻素口服给药具有进入脑部含量少、入脑后消除较快的特点，在临床上天麻素的用药剂量大，往往带给患者不好的体验。能够透过血脑屏障的药物对于其自身的分子量，脂溶性，表面电荷等有严格的限制，有文献表明，logp值<2.5,分子量<450的化合物更易透过血脑屏障。将天麻素进行酯化，尤其是短中链的酯化，一方面可以提高其脂溶性，增加其血脑屏障透过率，又不至于分子量过大；另一方面也可作为一种前药延长其在脑部的作用时间，因此对天麻素进行酯化具有重要的意义。
5.目前有关天麻素的酶法催化仅限于yang等使用psim脂肪酶，在有机相中通过酯化反应合成了天麻素十一碳单酯和双酯。但是一方面天麻素的长链酯由于分子量和logp值均较高，已超出了入脑药物的推荐范围。另一方面，有机溶剂的存在也不利于环境保护。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种酶法催化制备天麻素三酯的方法。本发明提供的制备方法是一种绿色、简单且高效的酶法催化制备天麻素三酯的方法。
7.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
8.本发明提供的酶法催化制备天麻素三酯的方法，包括如下步骤：
9.(1)将天麻素、酰基供体、催化剂混合均匀，震荡反应，得到反应液；
10.(2)将步骤(1)所述反应液分离纯化，得到所述天麻素三酯。
11.进一步地，步骤(1)所述催化剂为脂肪酶。
12.优选地，所述脂肪酶为南极假丝酵母(candida antarctica)、嗜热丝孢菌(thermophilic bacillus)、米曲霉(aspergillus oryzae)或洋葱假单孢菌(pseudomonas cepacia)表达的脂肪酶。
13.进一步地，步骤(1)所述脂肪酶与天麻素的质量比为1：1
‑
8：1。
14.进一步地，步骤(1)所述酰基供体为脂肪酸、脂肪酸烯醇酯中的一种以上。
15.优选地，所述脂肪酸的碳原子个数为1
‑
8个，所述脂肪酸烯醇酯的碳原子个数为1
‑
8个。
16.进一步优选地，步骤(1)所述酰基供体为脂肪酸。
17.当所述酰基供体采用不同链长的脂肪酸或者脂肪酸烯醇酯时，步骤(2)对应得到的天麻素三酯链长也不同。
18.进一步地，步骤(1)所述天麻素与酰基供体的摩尔比为1:5
‑
1:40。
19.进一步地，步骤(1)中，所述天麻素、酰基供体、催化剂在溶剂中混合均匀后再进行震荡反应；所述溶剂为四氢呋喃、叔戊醇、吡啶、丙酮、乙腈中的一种以上。
20.进一步地，步骤(1)所述震荡反应的温度为30
‑
70℃，震荡反应的时间为6
‑
48小时。
21.进一步地，步骤(1)所述震荡反应的60
‑
180rpm。
22.进一步地，步骤(2)所述分离纯化包括：将步骤(1)所述反应液离心，取上清液，然后通过层析分离，得到所述天麻素三酯；所述层析分离采用的层析液包括氯仿及乙酸。
23.优选地，所述氯仿与乙酸的体积比为10：0.1。
24.优选地，所述层析分离采用的层析液为氯仿、丙酮与乙酸的混合液；
25.进一步优选地，所述氯仿、丙酮与乙酸的体积比为9
‑
12：1
‑
3：0.1。
26.优选地，当步骤(1)是在溶剂体系中进行震荡反应的，则步骤(2)所述分离纯化包括：将步骤(1)所述反应液离心，取上清液，接着减压蒸馏除去溶剂，然后通过层析分离，得到所述天麻素三酯。
27.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
28.(1)本发明提供的制备方法是一种酶法制备天麻素三酯的方法，通过利用底物的特性，使得合成工艺简单，反应效率很高，天麻素三酯含量最高可达97.63％。
29.(2)本发明提供的制备方法，与现有的化学法相比，本发明具有反应条件更加温和，选择性更好，催化效率更高，催化剂容易移除，副产物更少，产品质量更好的优点。
30.(3)本发明在反应结束后可以通过简单的过滤回收酶，既实现酶的重复利用，又易于产物的分离纯化。
附图说明
31.图1为实施例1和实施例2中天麻素三酯合成过程的高效液相色谱图。
32.图2为实施例3和实施例4中天麻素三酯合成过程的高效液相色谱图。
33.图3为实施例5和实施例6中天麻素三酯合成过程的高效液相色谱图。
34.图4为实施例7和实施例8中天麻素三酯合成过程的高效液相色谱图。
35.图5为实施例1和实施例2制备的天麻素三乙酯的核磁共振碳谱图。
36.图6为实施例3和实施例4制备的天麻素三丁酯的核磁共振碳谱图。
37.图7为实施例5和实施例6制备的天麻素三己酯的核磁共振碳谱图。
38.图8为实施例7和实施例8制备的天麻素三辛酯的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
39.以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
40.实施例1
41.4ml体系下，将天麻素溶解于四氢呋喃，所述天麻素与四氢呋喃的摩尔体积比为20mmol/l)，加入醋酸乙烯酯(天麻素与醋酸乙烯酯的摩尔比为1：30)混合均匀，再加入来源于南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶，所述脂肪酶在体系中的浓度为5mg/ml，在50℃、振荡速度180r/min的条件下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，取上清液，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三乙酯，合成过程的高效液相色谱图如图1所示。所用层析液为氯仿：丙酮：乙酸体积比为9：3：0.1。该实施条件下，根据底物的反应前后天麻素浓度的差值与反应前天麻素浓度的比值来计算转化率；根据反应后产物的浓度与反应前天麻素浓度的比值来计算产率。最终得到底物转化率为100％，天麻素三乙酯产率为94.1％。天麻素三乙酯的核磁共振碳谱图如图5所示。
42.实施例2
43.4ml体系下，采用无溶剂体系，加入天麻素和醋酸乙烯酯(天麻素22.9mg)，所述天麻素和醋酸乙烯酯的摩尔比为1：30，混合均匀，再加入来源于南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶，所述脂肪酶在体系中的浓度为5mg/ml，在50℃、振荡速度60r/min的条件下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三乙酯，合成过程的高效液相色谱图如图1所示。所用层析液为氯仿：丙酮：乙酸体积比为9：3：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三酯产率为97.63％。天麻素三乙酯的核磁共振碳谱图如图5所示。
44.实施例3
45.4ml体系下，将天麻素溶解于四氢呋喃，所述天麻素与四氢呋喃的摩尔体积比为为20mmol/l)，加入丁酸乙烯酯(天麻素与丁酸乙烯酯的摩尔比为1：40)混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在50℃、振荡速度180r/min的条件下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三丁酯，合成过程的高效液相色谱图如图2所示。所用层析液为氯仿：丙酮：乙酸体积比为12：1：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三酯产率为90.83％。天麻素三丁酯的核磁共振碳谱图如图6所示。
46.实施例4
47.4ml体系下，采用无溶剂体系，加入天麻素和丁酸乙烯酯(天麻素22.9mg)所述天麻素和丁酸乙烯酯的摩尔比为1：40，混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在50℃、振荡速度180r/min的条件下反应30小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，
再经薄层层析分离得到天麻素三丁酯，合成过程的高效液相色谱图如图2所示。所用层析液为氯仿：丙酮：乙酸体积比为12：1：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三酯产率为93.25％。天麻素三丁酯的核磁共振碳谱图如图6所示。
48.实施例5
49.4ml体系下，将天麻素溶解于四氢呋喃，所述天麻素(天麻素22.9mg)与四氢呋喃的摩尔体积比为20mmol/l，加入己酸乙烯酯(天麻素与己酸乙烯酯的摩尔比为1：40)混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在30℃、振荡速度120r/min的条件下反应48小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三己酯，合成过程的高效液相色谱图如图3所示。所用层析液为氯仿：乙酸体积比为10：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三酯产率为90.88％。天麻素三己酯的核磁共振碳谱图如图7所示。
50.实施例6
51.4ml体系下，采用无溶剂体系，加入天麻素和己酸乙烯酯(天麻素22.9mg)，所述天麻素和己酸乙烯酯的摩尔比为1：40，混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在50℃、振荡速度160r/min的条件下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除去固定化脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三己酯，合成过程的高效液相色谱图如图3所示。所用层析液为氯仿：乙酸体积比为10：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三己酯产率为68.11％。天麻素三己酯的核磁共振碳谱图如图7所示。
52.实施例7
53.4ml体系下，采用无溶剂体系，加入天麻素和辛酸乙烯酯(天麻素22.9mg)，所述天麻素和辛酸乙烯酯的摩尔比为1：5，混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在50℃、振荡速度180r/min的条件下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三辛酯，合成过程的高效液相色谱图如图4所示。所用层析液为氯仿：乙酸体积比为10：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％,天麻素三酯产率为72.4％。天麻素三辛酯的核磁共振碳谱图如图8所示。
54.实施例8
55.4ml体系下，将天麻素溶解于四氢呋喃，所述天麻素与四氢呋喃的摩尔体积比为20mmol/l，加入辛酸乙烯酯(天麻素与辛酸乙烯酯的摩尔比为1：40)混合均匀，再加入来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的脂肪酶(脂肪酶30mg)，所述脂肪酶在体系中的浓度为7.5mg/ml，在50℃、振荡速度120r/min的条件下反应48小时。反应结束后，反应混合物经离心除去脂肪酶，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到天麻素三辛酯，合成过程的高效液相色谱图如图4所示。所用层析液为氯仿：乙酸体积比为10：0.1。该实施条件下，底物转化率为100％，天麻素三酯产率为25.26％。天麻素三辛酯的核磁共振碳谱图如图8所示。
56.以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。