HPV16整合靶点联合铁死亡调控基因在宫颈癌早期筛查、治疗试剂盒中的应用及试剂盒

hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在宫颈癌早期筛查、治疗试剂盒中的应用及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物医药的技术领域，尤其涉及hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在宫颈癌早期筛查、治疗试剂盒中的应用及试剂盒。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(hpv)是最常见的性传播病毒，与生殖道及口咽部的癌前病变及恶性肿瘤密切相关，其中宫颈癌发生率最高，构成85％hpv相关肿瘤，在女性生殖系统肿瘤中高居首位。据报道，在接近90％的宫颈上皮内瘤变(cin)和99％以上的宫颈癌组织中发现有高危型hpv(hr
‑
hpv)感染，其中约50％以上与hpv16型相关。hpv16在感染过程中利用多种策略和手段逃避免疫系统识别和攻击，其中由于病毒与宿主染色体整合造成的hpv16潜伏隐匿是cin进展的前提事件。鉴于此，如果能对hpv16潜伏感染的高风险患者进行有效的癌前筛查，我们就可以早期评判hpv16感染患者的预后，针对性地对存在潜伏持续感染状态的高危人群进行干预，阻断或逆转cin进展。
3.由于hpv感染几乎是所有子宫颈癌发展的先决条件之一，hpv检测可以大大提高筛查的敏感性，包括我国在内的很多国家已经在早期筛查中实施了hpv检测，目前宫颈癌早期筛查方法主要是细胞学检查和临床hpv检测，其中，细胞学检查主要方法是巴氏涂片法和液基薄层细胞学检测(tct)。
4.巴氏涂片法是将患者宫颈外口鳞柱上皮交界处的细胞用刮板刮取下来涂在载玻片上，接着用95％的酒精加以固定，然后进行巴氏染色。巴氏涂片的优点是操作简单、经济节俭，是检查宫颈癌的首选方法，基层医院一直沿用至今。但是，该方法受制于医护人员的技术水平、医学技术制约等因素影响，致使巴氏细胞学方法假阴性率和假阳性率普遍偏高。
5.tct法采用完备的细胞保存技术，使受检的细胞层薄且均匀地涂布在玻璃片上，最后由病理医师对细胞进行分析评价做出诊断。与常规的制片方法比较，tct技术克服了传统巴氏涂片缺点图片不够均匀、过厚、粘液和血液过多、大部分细胞随取样器丢失以及涂片过程中所引起的细胞过度干燥等问题，但作为普查初筛方法，细胞学检测整个流程从取样、抹片制备、观察以及结果判读多个环节受到人为影响的可能性较大，易受主观因素影响，可能低估了宫颈上皮内病变，也可能对反应性改变做出过度诊断。
6.临床上hpv感染分型检测常用方法是荧光定量pcr，hpv筛查具有很高的敏感性，但缺乏特异性，因为其检测的仅仅是hpv病毒的存在与否，单纯的hpv感染不足以引起宫颈癌的发生，只有hpv dna与宫颈上皮细胞内染色体发生整合才可能引起宿主细胞基因突变导致宫颈癌变，而约80％的女性一生中某个时间段感染过hpv，而90％的hpv感染是一过性感染，可通过人体自身免疫力清除。hpv检测的阴性结果非常有意义，代表在短期内罹患癌的可能性很低，但hpv阳性结果意义并不非常明确，可能会导致那些能被自体免疫清除掉hpv感染女性的过度治疗，浪费大量的医疗资源。
7.hpv感染的宫颈上皮细胞恶性转化是持续感染细胞与微环境之间一系列复杂、多
步骤、多因素相互作用的序贯连续过程，单纯的hpv感染检测不足以判断宫颈癌的发生发展。由于目前的hpv检测技术均由于特异性或灵敏性不足而存在自身的局限性，尚不能明确区分hpv感染持续恶性转化和hpv一过性感染，造成大量的医疗资源浪费和过度治疗，研究hpv16感染恶化的机理并寻求新的诊断效能更高的分子生物学筛查标记物迫在眉睫。


技术实现要素：

8.本发明提供了hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在宫颈癌早期筛查、治疗试剂盒中的应用及试剂盒，联合hpv16整合靶点基因检测和铁死亡调控基因的检测，对hpv感染持续恶性转化的宫颈癌样品具有特异性，有助于明确区分hpv感染持续恶性转化和hpv一过性感染，为宫颈癌早期筛查或治疗试剂盒的研究提供新的指导思路，以获得诊断效能更高且简便易行的筛查试剂盒，减少医疗资源的浪费和过度治疗情况。
9.为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在宫颈癌早期筛查试剂盒中的应用。
10.本发明在研究宫颈癌持续恶性病变机理的过程中，发现其致病机理为hpv16整合致使病毒癌基因e6/e7持续表达，以促进感染细胞的恶性表型进展，同时发现hpv16的高频整合靶点基因可以通过调控细胞铁死亡指标基因的蛋白表达水平以抑制铁死亡，从而促进了癌细胞的持续病变，因此联合hpv16整合靶点基因的检测和铁死亡调控基因的检测，可以明确区分hpv感染持续恶性转化的宫颈上皮内瘤变和hpv一过性感染的宫颈上皮内瘤变样品之间的区别，为宫颈癌早期筛查、评估和治疗的研究提供指导思路，获得筛查或评估试剂盒诊断效能高且简便易行，更具有灵敏性和特异性；更加有效、精准地从hpv16阳性人群中筛查和临床诊断出宫颈癌高风险患者，从而对高风险病患进行个体化管理和治疗，在宫颈癌早期筛查和临床诊断中有着显著优势，可以减少医疗资源的浪费和过度治疗情况。
11.作为优选方案，所述宫颈癌早期筛查试剂盒中以hpv16整合靶点基因的病毒整合率、表达的蛋白及铁死亡调控基因编码的蛋白作为筛查标记物。
12.作为优选方案，所述hpv16整合靶点基因包括c
‑
myc，所述铁死亡调控基因为slc7a11。
13.作为优选方案，所述hpv16整合靶点基因在癌内或癌旁的蛋白表达程度与铁死亡调控基因的蛋白表达程度呈正相关，且与宫颈上皮内瘤变的发生呈正相关。
14.作为优选方案，包括检测c
‑
myc基因表达水平的试剂、检测hpv16整合靶点基因病毒整合率的试剂及检测slc7a11基因表达水平的试剂。
15.作为优选方案，采用pcr方法、western印迹、免疫组织化学技术中的一种或多种对宫颈癌组织样品进行所述c
‑
myc和slc7a11基因的表达水平检测，所述检测c
‑
myc和slc7a11基因表达水平的试剂包括pcr检测试剂、western印迹检测试剂、免疫组织化学技术检测试剂中的一种或多种。
16.为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了c
‑
myc抑制剂和/或铁死亡诱导剂在宫颈癌早期治疗试剂盒中的应用。
17.本发明在研究宫颈癌早期治疗药物的过程中，发现宫颈上皮内瘤变(cin)的持续病变与hpv16高频整合靶点基因c
‑
myc之间的关联性，通过采用c
‑
myc抑制剂敲低c
‑
myc的蛋白表达水平，可以抑制病毒癌基因e6/e7的持续表达，从而达到抑制癌细胞进展的效果；同
时，敲低c
‑
myc的蛋白表达水平可以调控降低铁死亡指标slc7a11基因的蛋白表达水平，以促进铁死亡的进程，从而减少癌细胞，同理采用铁死亡诱导剂同样可以诱导细胞发生铁死亡，从而抑制癌细胞的增殖，两者联合使用对癌细胞的抑制效果更为明显，能够为宫颈癌临床治疗药物或试剂盒的研究提供新的指导思路。
18.作为优选方案，所述c
‑
myc抑制剂为izcz
‑
3，所述铁死亡诱导剂为erastin。
19.为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种宫颈癌早期筛查试剂盒，包括检测c
‑
myc基因表达水平的试剂和/或检测hpv16整合靶点基因病毒整合率的试剂及检测slc7a11基因表达水平的试剂。
20.为了解决上述技术问题，本发明目的之四提供了一种宫颈癌早期治疗试剂盒，包括c
‑
myc抑制剂和铁死亡诱导剂。
21.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
22.1、本发明发现hpv16的高频整合靶点基因可以通过调控细胞铁死亡指标基因的蛋白表达水平以抑制铁死亡，因此联合hpv16整合靶点基因的检测和铁死亡调控基因的检测，为宫颈癌早期筛查、评估和治疗的研究提供指导思路，更加有效、精准地从hpv16阳性人群中筛查和临床诊断出宫颈癌高风险患者，更具有灵敏性和特异性，可以减少医疗资源的浪费和过度治疗情况。
23.2、通过采用c
‑
myc抑制剂敲低c
‑
myc的蛋白表达水平，可以抑制病毒癌基因e6/e7的持续表达，同时，敲低c
‑
myc的蛋白表达水平可以调控降低铁死亡指标slc7a11基因的蛋白表达水平，以促进铁死亡的进程，也可以采用铁死亡诱导剂诱导细胞发生铁死亡，从而抑制癌细胞的增殖和恶化，两者联合使用对癌细胞的抑制效果更为明显，能够为宫颈癌临床治疗药物或试剂盒的研究提供新的指导思路。
附图说明
24.图1：为本发明中hpv16整合靶点基因c
‑
myc调控slc7a11表达以抑制铁死亡的机理示意图；
25.图2：为本发明中实施例一的临床宫颈组织样品的免疫组织化学技术的检测结果；
26.图3(a
‑
b)：为本发明中实施例二的细胞样品的平板克隆细胞形成实验的检测结果；
27.图3(c)：为本发明中实施例二的细胞样品经平板克隆后的免疫荧光定量pcr检测slc7a11蛋白表达水平的结果；
28.图4(d)：为本发明中实施例三的小鼠活体成像系统检测结果；
29.图4(e)：为本发明中实施例三的小鼠肿瘤变化统计数据图表。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.hpv感染后其dna与宫颈上皮细胞内染色体发生整合，致使病毒癌基因e6/e7持续
表达，促进感染细胞的恶性表型进展；并且高频、特异性地整合到人类基因组的转录活跃区域和脆性位点，引起部分癌基因或抑癌基因的表达及功能异常。研究证实hpv16整合到人类宿主dna后引起整合位点基因组改变，丰富了对高危hpv16致癌特性的理论认识。在本发明研究中，通过高通量病毒整合检测技术筛选出c
‑
myc是hpv16整合感染的关键靶点，c
‑
myc基因的表达水平与宫颈癌的发生呈正相关，深入挖掘其作用机制可以作为早期预测及阻断cin进展的手段。
32.铁死亡(ferroptosis)是2012年dixon等人发现的一种新的细胞死亡方式，它的理化特征是铁离子代谢异常和脂质过氧化物累积，由于铁死亡的激活可以导致肿瘤细胞的死亡，其关键蛋白可以作为肿瘤治疗新的研究靶点，因此铁死亡成为了近年的研究热点。目前对铁死亡调控的相关机制研究也在不断的完善中，主要包括三个方面：1.谷胱甘肽转运合成系统异常；2.脂质过氧化物累积；3.铁离子代谢异常。其中，细胞中的谷胱甘肽对脂质性活性氧簇(ros)的清除起着重要作用，其合成由胱氨酸
‑
谷氨酸转运系统(systemxc
‑
)负责。溶质载体蛋白成员7(slc7a11)是胱氨酸
‑
谷氨酸转运系统(systemxc
‑
)中的主要成员，通过介导胱氨酸摄取和谷氨酸释放促进谷胱甘肽的合成，保护细胞免受氧化应激，维持细胞的氧化还原平衡，其稳定过表达可以阻止脂质过氧化诱导的铁死亡发生，促进多种肿瘤的发生发展。近年来，铁死亡在病毒感染相关恶性肿瘤发生发展过程中的作用逐渐受到重视。然而，hpv16整合是否通过调控铁死亡slc7a11信号进而促进宫颈癌变进展尚未见研究报道。
33.本技术首次提出关于hpv16高频整合位点基因c
‑
myc调控slc7a11的表达以抑制宫颈癌细胞铁死亡的调控机制，由于hpv dna与宫颈上皮细胞内染色体发生整合是宫颈癌变的前提事件，因此hpv整合分型及组织形态学观察是评估宫颈病变预后的有价值的两个参考，如图1所示，通过高通量病毒整合检测技术、免疫组织化学、平板克隆实验、小动物活体成像等技术从细胞、动物及临床标本三个水平进行证实；结合小鼠模型及临床标本明确c
‑
myc与slc7a11在hpv16整合宫颈病变组织中的相关性，表明c
‑
myc基因在癌内或癌旁的蛋白表达水平与slc7a11基因的蛋白表达水平均呈正相关，为宫颈癌的早期筛查、治疗及评估提供了新的有效靶点。
34.实施例一
35.研究临床样品hpv16整合状态与c
‑
myc和slc7a11表达情况之间的相关性
36.1、实验对象：选取广州医科大学附属第一医院保存的20例临床人正常宫颈组织(nomal)、30例临床人低级别宫颈上皮内瘤变组织(cinⅰ)、30例临床人高级别宫颈上皮内瘤变组织(cin
ⅱ‑ⅲ
)、30例临床人宫颈鳞状细胞瘤组织(cscc)。
37.2、实验主要试剂：
38.1)te9提取液：500mmol/l tris、20mmol/l edta、10mmol/l nacl、1％sds、500μg/ml蛋白酶k；ph为8.0。
39.2)一抗工作液：c
‑
myc，型号ab32072,品牌abcam，1:100；slc7a11，型号ab37185，品牌abcam，1:200；购自广州新晋生物技术有限公司。
40.3)二抗工作液：免疫组化专用二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
41.4)dab显色试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
42.3、实验步骤：
43.3.1、分别对不同例临床样品进行细胞基因组dna的提取，具体操作步骤如下：
44.a)切除样品中多余石蜡，暴露组织；
45.b)将组织切碎(最大径<0.5mm)，称重；
46.c)溶于te9提取液(组织质量/te9体积<50mg/5ml，组织质量/te9体积＝50
‑
500mg/10ml)，高速混悬2min－3min后，于48℃放置24h；
47.d)再次混悬组织，加入蛋白酶k至终浓度为1mg/ml，加入2％体积的sds，孵育40h；
48.e)用等体积的酚
‑
氯仿溶液抽提3次；
49.f)加入2.5倍体积的乙醇沉淀dna，随后在
‑
70℃放置2
‑
4h；
50.g)离心后沉淀物用70％乙醇洗一次；
51.h)干燥后用te(ph7.2)溶解，即得细胞基因dna。
52.3.2、将不同例临床样品提取后的细胞基因dna进行高通量病毒整合检测(hivid)组织中hpv16感染及病毒整合状态，检测结果如表1所示，具体包括以下操作步骤：
53.a)针对病毒序列设计特异性探针，探针根据20种hpv亚型基因组的序列进行设计，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、6、11、42、43、44型；
54.b)将临床样品的细胞基因dna采用covaris e
‑
210(covaris,inc.,ma)打断至150
‑
200bp的dna片段长度；
55.c)对打断后的dna片段进行纯化、剪切和加a尾及识别接头连接；
56.d)杂交过程根据mygenosticsgencaptm的指示操作，基因组文库与hpv的探针在65℃杂交24小时，随后除去未捕获的片段；
57.e)剩下的片段将18个循环的聚合酶链反应扩增成用于测序的基因组文库，采用illuminahiseq 2000(illumina公司，san diego，ca)测序平台，检测全基因组水平的病毒整合点和热点。
58.3.3、将不同例临床样品进行连续切片的免疫组织化学技术检测组织中c
‑
myc基因和slc7a11基因的蛋白表达水平，检测结果如表1和图2所示，具体操作步骤如下：
59.a)常规脱蜡脱水：将临床样品的石蜡切片放置于65℃烤箱内2小时以溶解石蜡，然后依次放入二甲苯溶液(i、ii、iii)中各15分钟，再依次放入梯度浓度酒精中(100％、95％、95％、90％、80％、70％)各5分钟，然后用pbs洗涤，5分钟/次
×
3次；
60.b)抗原修复：将a)处理后切片放入实验用高压锅内，加入抗原修复液(1
×
ph 6.0枸橼酸钠缓冲液)至液体没过切片，高火至高压锅打气，再调至低火继续修复5分钟，随后室温下自然冷却，pbs洗涤，5分钟/次
×
3次；
61.c)h2o2封闭内源性过氧化物酶：把b)处理后切片浸泡到3％h2o2工作液中，37℃孵育15分钟，pbs洗涤，5分钟/次
×
3次；
62.d)一抗孵育：将c)处理后切片组织放置在玻片上，用免疫组化笔圈出玻片上的组织标本区域，把配制好的一抗工作液滴加到每张玻片的组织区域上以覆盖组织块，4℃孵育过夜，次日复温后，pbs洗涤，5分钟/次
×
3次。
63.e)二抗孵育：每张切片滴加相应的二抗工作液，37℃孵育1小时，然后弃二抗，pbs洗涤，5分钟/次
×
3次；
64.f)dab显色：根据dab显色试剂盒，把20
×
dab配置成1
×
dab，将1
×
dab滴加到每张切片的组织区域上，在显微镜下观察每张切片的显色情况，着色后放入1
×
pbs中终止染色，避免染色过度；
65.g)细胞核染色：苏木素染色10分钟，着色后于自来水中冲洗10分钟，盐酸酒精分化2
‑
3秒，再次于自来水中冲洗15分钟；
66.h)脱水、透明及封片：将切片依次置于梯度浓度酒精中(70％、80％、90％、95％、95％、100％)各5分钟进行脱水，然后依次放入二甲苯溶液(i、ii、iii)各10分钟，干燥后用中性树脂封片，显微镜下观察并拍照；
67.i)染色结果的评估：采用双盲法对免疫组化结果进行独立评估，正置显微镜下随机选取5个视野，根据显色反应的颜色深浅，对同一视野内所有细胞划分为阴性，弱，中，强4个染色强度等级，使用h score评分体系，h score＝(染色强度等级为弱的细胞百分比
×
1)+(染色强度等级为中的细胞百分比
×
2)+(染色强度等级为强的细胞百分比
×
3)，选择h score评分的中位值用于区分待检测蛋白的表达高低。
68.4、实验结果：
69.结合表1和图2的hpv16病毒整合状态和c
‑
myc、scl7a11基因的蛋白表达水平，可以得知c
‑
myc基因表达的蛋白主要定位于宫颈上皮细胞的细胞核，而slc7a11基因表达的蛋白主要定位于宫颈上皮细胞的细胞膜，图2(a)中的阳性表达均呈棕黄色。由表1和图2(d)可知，随着宫颈上皮内瘤变(cin)进展的加重，hpv16整合率和c
‑
myc与slc7a11基因的表达水平均呈逐渐上升趋势且呈正相关，联合hpv16整合情况及宫颈组织中c
‑
myc和slc7a11基因的蛋白表达水平可以实现对宫颈癌高危人群的早期精准筛查。
70.表1
‑
hpv16整合状态和c
‑
myc、scl7a11在不同宫颈病变组织的蛋白表达水平
[0071][0072][0073]
实施例二
[0074]
研究宫颈癌细胞样品中c
‑
myc调控slc7a11表达以抑制铁死亡的研究
[0075]
1、实验对象:选取广州医科大学附属第一医院保存的利用hpv16整合的人宫颈癌前病变细胞(cin)s12和人宫颈癌细胞siha。
[0076]
2、主要试剂：
[0077]
1)c
‑
myc过表达质粒：购于上海吉凯基因生物技术有限公司。
[0078]
2)c
‑
myc敲低片段：购于广州市锐博生物科技有限公司。
[0079]
3)lipo2000转染试剂：购于赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)。
[0080]
4)a液：敲低片段混合稀释液/孔：500ul dmem空白培养基+敲低片段(5ul)。
[0081]
5)b液：过表达质粒混合稀释液/孔：500ul dmem空白培养基+c
‑
myc过表达质粒(100ng)。
[0082]
6)c液：lipo2000稀释液/孔：500ul dmem空白培养基+1ul lipo2000。
[0083]
3、实验步骤：
[0084]
3.1、对细胞样品进行c
‑
myc过表达干预实验(c
‑
myc)、c
‑
myc敲低实验(c
‑
myc kd)
和空白处理实验(nc)，具体操作步骤如下：
[0085]
a)取生长状态良好的细胞样品，在转染前24小时接种于六孔板中，细胞汇合度在转染时能达到50％
‑
60％为宜；
[0086]
b)配制a液、b液和c液，室温静置5分钟，随后将a液和c液轻柔混匀至孔板里，将b液和c液轻柔混匀至孔板里，室温静置孵育20分钟，在这期间，去除孔板里原有培养基，并加入1mldmem空白培养基/孔；
[0087]
c)孵育完成后，将孔板内的ab混合物小心且均匀加到包含细胞样品和培养基的敲低实验培养孔中，样品记录为c
‑
myc kd，将孔板内的bc混合物小心且均匀加到包含细胞样品和培养基的过表达实验培养孔中，样品记录为c
‑
myc；
[0088]
d)将样品放置孵箱培养，转染后6h更换新鲜的完全培养基，48h后进行转染效率检测。
[0089]
3.2、将不加干预的细胞样品记录为空白处理nc细胞样品，对空白处理的nc细胞样品和步骤1中进行敲低处理的c
‑
myc kd细胞样品和过表达处理的c
‑
myc细胞样品进行平板细胞克隆形成试验，并在平板培养基中加入铁死亡诱导剂，观察各组细胞样品的平板克隆形成情况，试验结构如图3(a
‑
b)所示，具体操作步骤如下：
[0090]
a)取对数生长期的各组细胞样品，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的dmem培养液中备用；
[0091]
b)细胞计数，每组细胞分别以每皿1000个的细胞密度分别接种含10ml 37℃预温培养液的6cm皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，在各组细胞样品的平板培养基中添加铁死亡诱导剂erastin，浓度为10μmol/l，置于37℃5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周；
[0092]
c)当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，用pbs浸洗2次，加4％多聚甲醛固定细胞5ml固定15分钟，然后去固定液，加苏木素染色20分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；
[0093]
d)将平皿倒置，用肉眼直接计数克隆，拍照并计算克隆形成率。
[0094]
3.3、采用荧光定量pcr检测平板克隆实验中敲低实验处理的c
‑
myc kd细胞样品、过表达实验处理的c
‑
myc细胞样品和空白实验处理的nc细胞样品的基因表达水平，未添加铁死亡诱导剂，检测结果如图3(c)所示，具体操作步骤如下：
[0095]
a)rna的提取：
[0096]
采用胰蛋白酶消化细胞样品，终止消化后加入到1.5ml去rna酶的ep管离心，1
×
pbs洗涤细胞2次，加入1ml的rna trizol，吹打混匀，室温下静置裂解5分钟；然后加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒后室温静置10分钟，4℃温度12000rpm/min离心15分钟；离心后取上层透明无色水相层，约500ul，移到新的1.5ml去rna酶ep管，加入等体积异丙醇，混匀后室温下静置10分钟，4℃12000rpm/min离心30分钟；弃上清，每管加入1ml预冷的75％乙醇溶液，4℃12000rpm/min离心15分钟；弃上清，倒扣于干净滤纸上，风干，加入50μl depc水，吹打混匀以让rna沉淀彻底溶解，保存于
‑
80℃备用。
[0097]
b)逆转录：使用nanodrop 2000分光光度仪检a)处理获得的rna浓度，计算每个细胞样品rna的逆转录反应体系，用逆转录试剂合成cdna，逆转录反应体系如表2所示：
[0098]
表2
‑
细胞样品rna的逆转录反应体系
[0099][0100]
c)荧光定量pcr：设计好pcr反应体系和加样顺序，按照试剂盒内的使用说明进行操作，pcr反应体系如表3所示，使用sybr green i检测体系对b)获得的cdna中目的基因的相对含量进行检测，设计合成c－myc、slc7a11目的基因的寡核苷酸引物片段，如表4所示：
[0101]
表3
‑
细胞样品的pcr反应体系
[0102][0103]
表4
‑
c
‑
myc和slc7a11目的基因的寡核苷酸引物序列
[0104][0105]
4、实验结果：
[0106]
结合图3的检测结果可知，分别对宫颈癌细胞样品进行过表达和敲低c
‑
myc的实验后，如图3(c)所示，相比于空白处理的细胞样品和敲低c
‑
myc干预的细胞样品，过表达c
‑
myc干预实验细胞样品的scl7a11基因蛋白表达水平明显较高，且如图3(a
‑
b)所示，癌细胞的数量较高，铁死亡概率降低；如图3(c)所示，相比于空白处理的细胞样品和过表达c
‑
myc干预的细胞样品，敲低c
‑
myc干预的细胞样品中scl7a11基因蛋白表达水平明显较低，且如图3
(a
‑
b)所示，癌细胞的数量较低，铁死亡概率提高。表明敲低c
‑
myc基因的表达可以间接加速癌细胞的铁死亡进程，为slc7a11的蛋白表达水平受c
‑
myc基因的蛋白水平调控的机理研究提供有力的实验依据。
[0107]
实施例三
[0108]
研究联合阻断c
‑
myc和诱导铁死亡对hpv16感染宫颈癌小鼠的抑制作用
[0109]
1、实验对象：5
‑
6周龄的balb/c裸鼠20只，balb/c裸鼠购于广东省实验动物中心。
[0110]
2、实验主要试剂：
[0111]
1)利用慢病毒表达载体构建稳定表达mcherry的hpv16整合的宫颈癌细胞(siha
‑
mcherry)。
[0112]
2)c
‑
myc抑制剂：izcz
‑
3，购于mce(medchemexpress)公司。
[0113]
3)铁死亡诱导剂：erastin，购于mce(medchemexpress)公司。
[0114]
3、实验步骤：
[0115]
a)将1
×
106的siha
‑
mcherry细胞注射到小鼠皮下，构建稳定表达mcherry的宫颈癌细胞(siha
‑
mcherry)，1周成瘤后随机分为4组，分别为：
①
不加干预组(nc)，
②
c
‑
myc抑制剂组(izcz
‑
3)，
③
铁死亡诱导剂组(erastin)，
④
c
‑
myc抑制剂联合铁死亡诱导剂组(izcz
‑
3+erastin)；
[0116]
b)按照izcz
‑
3剂量：100ug/小鼠，erastin剂量：100ug/小鼠，对小鼠进行腹腔注射对应试剂。
[0117]
c)每隔4天检测肿瘤大小，利用小动物活体成像观察肿瘤大小，并计算瘤体大小：体积(mm3)＝宽度2×
长度。
[0118]
d)第20天停止观察，对小鼠实行安乐死。
[0119]
4、实验结果：
[0120]
结合图4(d
‑
e)结果所示，对小鼠进行活体成像系统检测发现，给予c
‑
myc抑制剂或者铁死亡诱导剂的小鼠肿瘤大小均小于普通组不做干预小鼠的肿瘤大小，说明c
‑
myc抑制剂或者铁死亡诱导剂均可以抑制宫颈肿瘤的生长，而二者联合给予的抑制效果更好更明显，可以为联合阻断c
‑
myc和诱导铁死亡的宫颈癌早期治疗药物的研究提供新的思路和指导。
[0121]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。