一种与仔猪细菌性腹泻抗性相关的lncRNA标志物及其应用

一种与仔猪细菌性腹泻抗性相关的lncrna标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncrna标志物 lncrna
‑
fut3
‑
as1，及其作为靶点在提高猪对大肠杆菌抗性中的应用。


背景技术：

2.f18大肠杆菌是导致当今养猪业断奶仔猪细菌性腹泻的重要致病病原菌之一，它与其所释放的脂多糖直接与小肠上皮细胞上的受体结合，致使小肠上皮细胞发生病变，从而导致仔猪出现水肿和腹泻等症状。因此，断奶仔猪能否抵抗大肠杆菌f18侵染，首要在于小肠黏膜上皮细胞的大肠杆菌f18受体是否表达。国外研究发现1型h抗原，参与组成abh血型抗原，是f18大肠杆菌黏附受体的最小抗原决定簇，主要由α
‑
(1,2)岩藻糖转移酶(fut2酶) 催化，而fut2酶的功能活性由fut1和fut2基因共同调控；国外学者发现fut1基因可以影响f18大肠杆菌受体蛋白的表达，且fut1基因m307位点的遗传突变可作为国外猪大肠杆菌f18腹泻的抗病育种标记，但不适合中国地方猪品种。因此，迫切需要深入探讨断奶仔猪在抵抗大肠杆菌f18侵染时的分子机理，以期挖掘和鉴定与仔猪抵抗大肠杆菌f18侵染存在关联的关键候选基因。
3.随着高通量测序技术的快速发展，长链非编码rna研究逐渐兴起，成为当前生命科学研究的热点之一。长链非编码rna(long non
‑
coding rna，lncrna)是由rna聚合酶ⅱ转录的非编码rna，不仅具有时间特异性，还具有细胞、组织特异性，这些决定了其在生命活动不可替代的重要性。lncrna可以通过cis顺式作用或者trans反式作用方式参与调控靶基因的表达，从而影响许多生物学过程，包括x染色体失活、表观遗传调控、细胞周期调控、细胞增殖分化调控、mrna降解和蛋白翻译调控等。国内外大量研究显示lncrna与人类的心血管疾病、肿瘤疾病、抗病毒性感染等疾病的发生与进展具有紧密的关联和调控功能。目前，关于lncrna的研究不仅仅局限在人上，在畜禽上也开始开展，但相对于人的lncrna研究，畜禽重要经济性状相关的lncrna功能机制研究还处在初步阶段，其调控作用及机制研究还不够深入。近年来，随着高通量测序技术以及lncrna研究技术的快速发展，畜禽(如猪、牛、羊和鸡)lncrna研究方面取得了较好的进展，主要集中在脂肪生成代谢、组织器官发育、胚胎发育等机体生理生命活动，此外一些研究发现lncrna在动物机体感染细菌、病毒等病原体后的免疫应答过程中也发挥了重要的作用。目前关于lncrna对断奶仔猪腹泻调控作用的相关研究报道较少。


技术实现要素：

4.为了探究lncrna在仔猪抵抗e.coli f18侵染时的功能及分子调控机制，对苏太猪和梅山猪f18大肠杆菌敏感型与抗性型个体的十二指肠组织进行了lncrna测序和转录组测序(测序数据已经提交ncbi数据库中的sequence read archive，bioproject id分别为prjna476718、 prjna476720、prjna476721和prjna476722)，并且利用venny软件分别对测序结果进行交集分析，同时根据靶基因预测结果综合分析筛选出1个关键lncrna
‑
fut3
‑
as1。为了探讨 lncrna
‑
fut3
‑
as1在抵抗大肠杆菌侵染过程中所发挥的作用及调控机制，通过实时荧光定量 (quantitative real
‑
time pcr，qpcr)和northern blot杂交方法检测lncrna
‑
fut3
‑
as1在苏太断奶仔猪肠道组织中的表达水平，并利用大肠杆菌侵染刺激和lps诱导处理猪小肠上皮细胞系(ipec
‑
j2)检测处理前后lncrna
‑
fut3
‑
as1的mrna表达水平。其次，设计并构建靶向猪lncrna
‑
fut3
‑
as1的沉默sirna，转染ipec
‑
j2细胞后利用real
‑
time pcr方法检测其沉默效率，用细菌计数、菌毛蛋白基因定量、革兰氏染色、扫描电镜以及间接免疫荧光等方法系统分析lncrna
‑
fut3
‑
as1沉默对小肠上皮细胞黏附f18大肠杆菌能力的影响。本研究系统验证了lncrna在猪小肠上皮细胞受到e.coli f18侵染时发挥的表达调控功能，为今后深入研究lncrna
‑
fut3
‑
as1的作用机制提供了一定的理论基础，同时也为畜禽lncrna的筛选和功能验证研究提供了系统的研究策略。
5.本发明的目的在于提供了lncrna
‑
fut3
‑
as1作为靶点在制备用于提高猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用。
6.本发明的另一目的在于lncrna
‑
fut3
‑
as1在作为提高猪细菌性腹泻抗性功能基因中的应用。
7.本发明的另一目的在于lncrna
‑
fut3
‑
as1在仔猪抗大肠杆菌腹泻病的分子选育中的应用。
8.本发明的另一目的在于沉默lncrna
‑
fut3
‑
as1的物质或者以lncrna
‑
fut3
‑
as1为靶点降低lncrna
‑
fut3
‑
as1表达的化学药物在制备用于提高猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用。
9.本发明的又一目的在于提供一组sirna技术靶向敲降猪lncrna
‑
fut3
‑
as1的序列和细胞系及其应用。
10.为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
11.lncrna
‑
fut3
‑
as1，其dna序列为：
12.ttcctgaacattccagaaccttctggagctgggggaaaggggatgctgtctggagaa ggccaagggagactgagttggaagtggagtttctctgaggctcagaggggaataggaa ctctccttggcccctagccacctgggtcaacatcaggagatgccagggcaagcaccatc cctgcaccccgatcatcttcccatttgctcctcatcgcacgtgtggtttgtatggtttgtt cctcacccactccaggctgggggcaggggtgccctccttttgagccacaagctgtcag ctgccccttggctcacagcccaaggccccaggggaaagcagtttccagcgggctggca gctccatcacccaccagcccaagctgagcaaggccctggggtctgacccaggcagaga ccccagcggcaggggaggtgcagatgccccacgtcgccccacacgctggttccagctc atcccaagcctgagggcggggtccccagggtcccccactctaggccttgggatcaaccc ctttctagggagtcaggaaatctcttggctccctctggtttggggcgggggattcctctg ccccagaaaggctgaaccccagaggctggtggtggattctggtgcacatccaggaggt ctcggttcagatcctgattccctccacccccgaccccccgctccacttcccagctgtgag aagcaggtgaaactgtcaataaaatctgaaataaaattgtagacagaataggtggtttg aggccataaaactaaatgatgggagggacagtggcaggaagcctcctgaaggtggtgg ctctctgagaaggaggattgtgaaggtgggggaggggatcactgcgtgaggtcagggt cagctctgccaggggtggtctcaggtggagcaggagctcgcttggccagtccaggggg gctttggatggataggaggtgacctgtatccctgttacacatatgggttcctttttttgtt tgttttggcggtgcttgtggcatagggaagttctggggcaagggagcaaaccggagcc acagccctgagagtgccggttccttaacccactgagccacagtgggaactccacacct gggtttcatttccagtccctgtgaagtgacaggatttgctggaggggtgtgggtgggca gagtgttggtgatcaag
aaccccaaatgccccctatgaactccactcatcagcttcccct tctctgcaattggggtcatagctcgggatcagggctcagcctggggtcattcgggggct ggcttgaggtcggggttccacctggctacagtttctgaccccggaaacaccattgctga ggtcagccgggtcatccagcctcccgttgccctgtggggccaagttcaggctcgtgaga ggctcaggcaggccaggttgcacgattggcgtctggaaagatccctctcagtgagccg cacctagctgcctctgccccagcccacatcctacccatgacctggtgacagatggctag aactcccagggaatggaggggtcgtggagtcctgaagcgccgcagatgtgtgtgtgga ccccctggggatgcacccccacccccgcccatcccccacacagtggcaagagggtctg ggccgggccaaagcaggtggagagggacagcatggggtgggggggctctggctgcgg gcccagcccatcaggatctgacagacagaggcctcctggaaccttcctgccccccttgg ttcccctgaagcatctcaaagggggattcttttttgtttggttggtttggtttggtttgg gttttttgtttttttgggttttttggctacgcccaaagcaggaggaagttcccaggcca gggatggagcccacgccacagcagtgataacaccagatccttaacccactgagccacc agggactcctcaaagtggttttttgggtttttttgtctttttgccttttctggggctgct cccacagtatatggaggttcccaggctaggggtctaatcagagttgtagctgccggccta tgtcagagccacagcaacacaggatccaagccacatctgtgacctgcaccacagctcat ggcaacgccggatccttaacccactgagcaaggtcagggatcgaacccacaacctcat ggttcctagtcggatttgttaaccacggagacacgacaggaactcctctcaaagtggta tttaacagagaatccttccacagctgaaccatcctgcttggcccctccccttgttgggga gctcattccctctagagacagtaaaggacactcccacaagggccagcacaggccctgta ttatatggggggcgcagggggactgaggctgccagaagggccatccctctcctcatatc cctctgtgagtaaaaggcaagactgatggcctggtggttaggacttggcgctttcacca ctgcaccctgggttcaatccctagtctgggaactgagatcccatatcaagcttctgtagg ctgcagccaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaagaaaaaaggcaggatcagagtcccaa cccgacacacttacagacagaggaggcacaaactttgatcacaagtgtggtaggcagt gccctccaggccttcacgggagaccggctttggggttttaaatcctggagatagagccc aatttcttactctctcttccgaactcttgtgccctcccggcttttctgtcctcatggggct gtcagcacagcagaggaagtgacagtgtgtccagagctgcactgggaaacaccaggc agctatgggagccagaggagggatctgatctggtgcaggggatgggaggaatccaggg aggctccctggaggaggtgcctggcctgagctctgtgggatgactagggattaacaagt gggggagtggggaggcacagggtgttcctggcagagcagctttgtgtagtggagaccc cttcatgcccttgagattctgaacgaccctctgggtctcagttttcatggcagggtggct atgggaaggctgaaggcctggaactaaccggatgctctgatggttaatgtccaggcagc gtgaagtagcctcatctggggacaggggagtcgtggtacctgggaggtggacctcggg ctttggcccgcctgcagtagccccctccttcccagcttccgtgcctctgccctgctctgg aagcttcccagggctccctgtcactcttgtattgaatagccatccctgaccacagccaga cacagctcagtgaggctgacctcatctgctgctcacgaacacccagccttactggcttt cctccactgccggattccttgctgcctccgggcctttgcacaggctgtcccttctgcctg gaaagctcttgcctcctcctttttccttagagaattcttatgaggctttagctcccagatc atacatccaggaagtccagaccaggccacaacctcctcaatttttgcaaattataattta tgtttgtttataagcttccttacgggttattggtctcacccacttgcttcctgcaatatcc ctggggcctgacacgtagcaggtattcaagaaacggttgctgagacggaacaaggagg tggaatctgctgggagtgaaggtggggagcttgaaattctgctcactggccccttcgca ccctccaaggaacccctggtgcccccatggaaaccactttgagaaccaggggcttggg tcagccctttcgctttctggatgggtcaactttacgcccagagccatataagccttgggg ccatggggtggtgactccagcccccagcttcctccaccctctccctcctcaggtcgtatg gtgattaggggagtctcacctttgcttgtggatgatggcctggctcatgggacaggaca ccttgcgtcacctaatggcaggtgcgggggttgggctgagccgtgctgcagctataggc acatttccttctcctcccccggtgtcgccttatccatacccagggagactgtgcctccta aacttcctggtcagccactcactgccgcacacgaacgct
gccccctaggtaaggcctcg ggggcggggggggcaggggatgtaccctctcccagaaggcgtgggtgccccctgggaa gagcctttgggctgcactcccaggggtctttctgggtacccagcgcaccagagtgggat gtttgggttgatttgggaaaccaggagggatagcgtttctctccctgtgtcttccatctc caccccccacccccccacccccccaccctcatcttttcctctcctttgctccctctttctc cctctctcatccctctctcccaccctccatttccttcttccccccatctctctctctctgat gaagttttggatgagaacccccactgctcctgtgcccccatcagcacccccagagccgc tcttccttcctgacccatctcatggaaaaaaaggacctgggatgctgcgggcaaggtgg ggggcgatgtttggattttcttatctttgtggtgtcccagcatagtggcattttaaaaagt tcctttctaggaagaaacatcctgggttcaaatcagtgggatctcagccgtagcctccc aaacctgtcccccaggctgtgctcttcacggtcactgtcaggggcccccatgcctccta ggaggagctgccataaacccaggacaaacagactatattcattttgtattcattttaatta cattgccacgtattaaccttctctgcatggccaaaacccccaacagcacaaagcagctt ggggtcgaagttcaccccctgcctgctccttccttgggctgtccccccaaaggcctgtt ttggggactcattccagaaactcggggggggggacatggaattccaaatcctgctccat tctccttgcacagggccacccgtcgactcctccattctgcactcacatgtttgtagcagt tccacctagcaggagcctgccaaccatcagtggtattattttattttattttttaattaaa aaaaatttttttggctgcacccatggtgtgcagaagttcccggggccaggaagtgaact caagccacggcagtaacaatgctgggtccttaactgctaggccaccagggaactcctac attattttttaaattgtgataaacgtggagttcccattgtggctcagcaggttaggaacc cagctagtatccctgaggatgcgggtctgatccctggcctcactcagtgggttaaggatc cagcattgctgcaagctatgatgtaggttcggatctggagttgctgtggctatggtgtag gctggtacctgtagctcagttttgacccctagcctaggaacctccatatgccatggtttc agccctaaaaaaagaaaagaaaagaaaggaaggaggttaccagaccagggatcaaac tcatgcccctgcagtgacaccactgaatccttaattactaggacaccagggaactcctac attattttttaaaattgtggtaaaatatatatgacctaggagttcccgtcgtggctcagtg gttaatgaatccgactaggagccatgaggttgcgggttcgatccctggccttgcttagtg ggttaaggatccggcattgccgtgagctgtgatgtaggtcgcaggtgtggctcggatcc ctcattgctgtggctctggcgcaggccggtggctacggctccaattggacccctagcct gggaacctccatatgccgcaggagcagcccaagaaatc(seq id no:1)。
13.lncrna
‑
fut3
‑
as1作为靶点在制备用于提高猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用。
14.lncrna
‑
fut3
‑
as1在作为提高猪细菌性腹泻抗性功能基因中的应用。
15.lncrna
‑
fut3
‑
as1在仔猪抗大肠杆菌腹泻病的分子选育中的应用。
16.沉默的lncrna
‑
fut3
‑
as1物质或者以lncrna
‑
fut3
‑
as1为靶点降低fut3基因表达的化学药物在制备用于提高猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用。
17.上述的应用中以在lncrna
‑
fut3
‑
as1作为靶点采用基因沉默或敲除技术或者采用化学药物降低猪lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达，提高猪对大肠杆菌或细菌性腹泻的抗性，或者培育抗大肠杆菌腹泻病的仔猪品种。
18.上述的用于提高猪对大肠杆菌抗性的试剂中能够干扰、抑制、沉默或敲除 lncrna
‑
fut3
‑
as1的物质。
19.上述的干扰、抑制、沉默或敲除lncrna
‑
fut3
‑
as1基因的物质，它包含以下(1)～(3) 中的至少一种：
20.(1)针对lncrna
‑
fut3
‑
as1的干扰序列；
21.(2)包含有lncrna
‑
fut3
‑
as1干扰载体的转基因细胞系；
22.(3)以lncrna
‑
fut3
‑
as1为靶点降低lncrna
‑
fut3
‑
as1表达的化学药物。
23.所述的针对lncrna
‑
fut3
‑
as1基因的干扰序列为rnai
‑
1～4中的任意一组：
[0024][0025][0026]
所述的用于干扰的lncrna
‑
fut3
‑
as1的干扰细胞系的制备方法为：将所设计的针对 lncrna
‑
fut3
‑
as1的干扰序列的正义链和反义链；
[0027]
所述的包含有lncrna
‑
fut3
‑
as1序列的细胞系为将所述转染靶细胞ipec
‑
j2得到。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
本发明通过qpcr技术检测lncrna
‑
fut3
‑
as1在仔猪上的组织表达谱以及大肠杆菌抗性与敏感群体之间的表达差异，并通过免疫组织化学技术(immunohistochemistry，ihc)检测fut3在抗性与敏感群体肠道组织的定位以及表达情况；同时利用f18大肠杆菌刺激和脂多糖诱导处理猪肠上皮细胞系(ipec
‑
j2)检测处理前后lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平，剖析f18 大肠杆菌侵染和lps诱导条件下lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达规律。选择效率最高的转染细胞进行下一步功能验证，通过细菌计数、菌毛蛋白基因定量、间接免疫荧光以及革兰氏染色法综合分析lncrna
‑
fut3
‑
as1沉默对小肠上皮细胞黏附f18大肠杆菌能力的影响。本研究从 mrna、蛋白质以及细胞水平上系统探讨了lncrna
‑
fut3
‑
as1在仔猪抗f18大肠杆菌感染过程中发挥的重要作用，以期确定其可以作为细菌性腹泻重要的抗性候选功能基因，同时也将为之后在生猪生产中开展仔猪抗大肠杆菌腹泻病的分子选育提供科学根据。
附图说明
[0030]
图1 lncrna
‑
fut3
‑
as1在抗性与敏感个体十二指肠组织的荧光定量结果(**表示p< 0.01，***表示p<0.001)；
[0031]
图2 lncrna
‑
fut3
‑
as1在抗性与敏感个体十二指肠组织的northern blot结果；
[0032]
图3 lps诱导ipec
‑
j2细胞后lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平；
[0033]
图4大肠杆菌菌体侵染ipec
‑
j2细胞后lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平；
[0034]
图5 lncrna
‑
fut3
‑
as1干扰ipec
‑
j2细胞系的建立；
[0035]
图6细菌黏附的菌毛蛋白基因定量检测结果(*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)；
[0036]
图7细菌黏附的细菌计数结果(数据单位为103cfu
·
ml
‑1)；
[0037]
图8细菌黏附的革兰氏染色结果(1000
×
)；
[0038]
图9细菌黏附的扫描电镜结果(1000
×
)；
[0039]
图10细菌黏附的间接免疫荧光结果(100
×
)(上面为f18ac菌体侵染后细菌黏附的
间接免疫荧光结果，下面为f18ab菌体侵染后细菌黏附的间接免疫荧光结果)。
具体实施方式
[0040]
1.1试验材料
[0041]
试验的苏太猪来自于课题组早期建立的苏太猪大肠杆菌f18敏感型和抗性型资源群体 (苏州市苏太猪育种中心)，选取5个家系的35日龄苏太断奶仔猪并联合受体结合试验和v 型分泌系统展呈功能性黏附素试验方法，最终严格筛选出f18大肠杆菌敏感型和抗性型断奶仔猪各5头
[136]
。梅山猪来自于梅山猪保种有限公司(江苏省昆山市)，通过攻毒后表型以及体外黏附试验等综合分析获得确证的梅山猪f18大肠杆菌敏感型与抗性型个体各5头
[137]
。仔猪饲养环境相同且体重体型相似，健康状况良好。屠宰后收集仔猪的十二指肠组织样，现场液氮保存，而后移至实验室
‑
70℃冰箱冻存备用。猪小肠上皮细胞系(ipec
‑
j2)由本实验室保存和培养；大肠杆菌f18ab、f18ac菌株由扬州大学兽医学院朱国强教授馈赠。
[0042]
1.2试验试剂
[0043]
dmem/f12(1:1)培养基、opti
‑
mem培养基、trypsin
‑
edta solution、胎牛血清均购自 gibco brl(美国)；青链霉素混合液(100
×
)、dapi溶液、结晶紫染色液以及卢戈碘液购自 solarbio公司(中国北京)；lps(sigma,美国)；lipofectamine
tm 3000转染试剂、10
×
变性凝胶缓冲液和northernmax
tm formaldehyde load dye购自invitrogen公司(美国)；rnasimple 总rna提取试剂盒、血液/组织/细胞dna提取试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒、lnrcutelncrna cdna第一链合成试剂盒和lnrcute lncrna荧光定量检测试剂盒均购自天根生物科技有限公司(中国北京)；aceq qpcr sybr green master mix试剂盒购自vazyme公司(中国南京)；[α
‑
32
p]ctp购自perkinelmer；riboprobe体外转录标记系统购自promega；e.coliantibody购自genetex(美国)；二抗anti
‑
rabbit lgg购自r&d systems(美国)；t4 dna连接酶等其他酶购自new england biolabs(neb)公司(美国)；胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、异丙醇、氯仿、无水乙醇、depc水(焦碳酸二乙酯)、edta琼脂糖、10
×
mops凝胶电泳缓冲液和20
×
ssc缓冲液等试剂购自上海生工生物工程有限公司。
[0044]
1.3大肠杆菌抗性调控关键lncrna
‑
fut3
‑
as1来源及序列特征
[0045]
课题组前期已经对苏太猪和梅山猪f18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠组织进行了lncrna测序和转录组测序(数据已经提交于ncbi，bioproject id：prjna476718、prjna476720、prjna476721、prjna476722)，并且前期利用venny软件()分别对差异表达lncrna与mrna进行交集分析，并根据靶基因预测，筛选出1个关键lncrna
‑
fut3
‑
as1，在此基础上，利用igv软件对关键lncrna
‑
fut3
‑
as1进行基因组分布及特征分析。
[0046]
1.4引物设计与合成
[0047]
根据提供的猪lncrna
‑
fut3
‑
as1基因序列，利用invitrogen rnai designer软件设计2个针对lncrna
‑
fut3
‑
as1基因的sirna干扰序列(silncrna
‑
fut3
‑
as1
‑
1和silncrna
‑
fut3
‑
as1
‑
2) 和1条阴性对照序列(nc)，sirna序列如表1；此外以actb基因(又称β
‑
actin)和 lncrna
‑
fut3
‑
as1基因mrna序列为模板，设计实时荧光定量pcr引物，以actb为内参基因，荧光定量引物的片段长度均在100～200bp之间且都跨外显子设计，以避免扩增时基因组dna 的污染；同时以大肠杆菌菌毛蛋白基因pilin和β
‑
actin的dna序列为模板设计细菌黏附定量检测的荧光定量引物，用细胞基因β
‑
actin对细菌菌毛基因pilin进行均一化。为
了便于区分，用于cdna定量检测的引物标记为actb，用于黏附dna样本检测的引物标记为β
‑
actin。所有引物均由生工生物工程有限公司(上海)合成。引物的具体信息如表2中所示。
[0048]
表1 sirnas序列
[0049][0050]
表2 real
‑
time pcr引物信息
[0051][0052][0053]
1.5大肠杆菌f18ab、f18ac菌体侵染与lps诱导ipec
‑
j2细胞
[0054]
1.5.1细胞复苏
[0055]
(1)试验前超净台紫外照射30min，水浴锅预热至37℃，并准备好相关试验用品。
[0056]
(2)对照细胞存放记录本从液氮罐中取出ipec
‑
j2细胞冻存管，迅速将其浸入37℃温水中，并快速摇动令其尽快融化，尽量在2min内完成。
[0057]
(3)融化后取出冻存管，并用酒精棉球擦拭外壁；置于离心机中1000rpm离心5min。
[0058]
(4)弃去液体，加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养液重悬细胞沉淀，接种至细胞培养瓶，37℃5％co2培养箱静置培养。
[0059]
(5)次日及时观察细胞状态，并更换培养液继续培养。
[0060]
1.5.2细胞传代培养
[0061]
(1)当细胞密度长至90％左右，吸出旧的培养基，用pbs清洗2次。
[0062]
(2)弃除pbs，滴加适量胰蛋白酶消化液，37℃培养箱消化4min。
[0063]
(3)显微镜下观察细胞消化状态，在其中加入新鲜培养液吹打混匀，使细胞分散成单个细胞。
[0064]
(4)将细胞悬液分装至3个细胞t25培养瓶并添加适量新鲜培养基，37℃培养箱静置培养。
[0065]
1.5.3大肠杆菌菌体侵染ipec
‑
j2细胞
[0066]
当细胞长至90％时，将其消化铺板至6孔细胞培养板，当覆盖率达到80％时进行细菌侵染试验，细菌需要提前12h进行培养。将大肠杆菌f18ab和f18ac菌株分别接种于lb液体培养液中(1:1000)，220rpm培养12h；4000rpm离心5min，收集细菌菌体沉淀，用pbs 缓冲液重悬沉淀混匀并离心，重复洗涤3次；最后用dmem/f12培养液将细菌菌体沉淀稀释成1.0
×
109cfu
·
ml
‑1，每个细胞培养孔中加入2ml稀释液(每组3个重复)，同时设置空白组细胞即只加细胞培养液，刺激4h后收集细胞。
[0067]
1.5.4 lps诱导刺激ipec
‑
j2细胞
[0068]
用dmem/f12细胞培养液将lps稀释至1μg
·
ml
‑1用于诱导试验。当6孔板细胞长至80％时，在对应孔中加入1ml的lps稀释液进行诱导，同时设置只加细胞培养液的空白阴性对照组，每组各有3个平行重复样。最后分别在诱导后的4、8、12h后收集细胞。
[0069]
1.6 lncrna干扰试验
[0070]
lncrna干扰sirna的转染严格参照lipofectamine
tm 3000转染试剂说明书，具体步骤如下：
[0071]
(1)用ddh2o稀释干扰sirna以及control(终浓度为20μmol
·
l
‑1)，混匀。
[0072]
(2)转染前先将细胞传代铺板至24孔板，37℃培养，待细胞长至40％进行sirna转染。
[0073]
(3)使用25μl opti
‑
mem培养液稀释lipofectamine
tm 3000(1μl)，并用移液枪充分混匀，室温静置5min。
[0074]
(4)同时用25μl opti
‑
mem培养液稀释sirna 1.25μl，混匀，室温静置5min。
[0075]
(5)再将稀释的lipofectamine
tm 3000试剂中加入稀释的sirna(1:1)，轻轻吹打混合，室温静置10～15min。
[0076]
(6)将混合液加入到对应的细胞培养孔中，摇动均匀后放入到37℃二氧化碳细胞培养箱中培养。
[0077]
(7)36h后检测lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平。
[0078]
1.7组织和细胞rna的提取与质量检测
[0079]
严格按照试剂盒说明书提取苏太猪和梅山猪肠道组织、菌体侵染和lps诱导细胞以及 lncrna
‑
fut3
‑
as1沉默前后细胞的总rna。具体步骤如下：
[0080]
1.7.1 rna提取
[0081]
(1)对于组织而言，取50～100mg组织样放进5ml的离心管中，在其中加入1ml裂解液rz，放置在冰上，用德国fluko匀浆器进行组织匀浆，使组织裂解充分，之后快速转移到预冷的1.5ml无酶ep管中；对于细胞而言，将收集的细胞离心去上清，直接加入1ml 裂解液rz即可。
[0082]
(2)组织匀浆液室温条件下静置5min，使核酸与蛋白形成的复合物完全分开。加入200μl 氯仿，漩涡振荡15s，室温3min，4℃条件下12000rpm离心10min，转移水相于新的无酶管中。
[0083]
(3)添加0.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，混合液转入吸附柱cr3中，4℃条件下
12000 rpm离心30s。
[0084]
(4)向柱中添加500μl去蛋白液rd，4℃条件下12000rpm离心30s，弃废液。
[0085]
(5)向柱中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，4℃条件下12000rpm离心30s，弃废液，此步骤重复一次。
[0086]
(6)将吸附柱放入收集管，4℃12000rpm离心2min，去除之前残留的液体。
[0087]
(7)将吸附柱放入新的离心管，向其中加入30μl rnase
‑
free ddh2o，室温静置2min，4℃条件下12000rpm离心2min。
[0088]
1.7.2 rna质量检测
[0089]
(1)使用按照nanodrop1000仪器检测rna的浓度。a260/a280的比值在1.7～2.1之间初步表明提取的rna纯度较高，可用于进行下一步实验。
[0090]
(2)制备1.2％甲醛琼脂糖凝胶用于检测rna纯度：0.6g琼脂糖溶解于36ml灭菌水中，微波炉中火加热2min后取出；等到溶液的温度降至55℃左右时加入5ml的10
×
mops电泳缓冲液和9ml的去离子甲酰胺，混匀后倒胶，室温放置直至凝胶完毕，待用。
[0091]
(3)配置用于上样的rna变性反应体系：10
×
mops电泳缓冲液2μl，去离子甲酰胺10μl， 37％甲醛3.6μl，rna 4.4μl和eb 0.2μl。
[0092]
(4)将rna变性混合反应体系放置在65℃孵育10min，样品放置于冰上冷却10min后，轻甩离心管将液体沉降于底部。
[0093]
(5)加入10
×
甲醛凝胶加样缓冲液2.5μl，轻弹混匀。
[0094]
(6)在rna电泳槽中加入适当体积的1
×
mops缓冲液，将上述的电泳凝胶放进缓冲液中，预电泳5min。将rna变性体系溶液混合均匀后用移液枪全部加入到凝胶孔中。
[0095]
(7)50v电压，40min后，紫外光下仔细观察rna的条带。
[0096]
1.8 rna反转录及荧光定量pcr检测
[0097]
将上一步得到的rna经过反转录后进行lncrna
‑
fut3
‑
as1的荧光定量pcr检测，检测 lncrna
‑
fut3
‑
as1在苏太猪和梅山猪肠道组织、菌体侵染和lps诱导细胞以及 lncrna
‑
fut3
‑
as1沉默前后细胞中的表达水平，具体步骤如下：
[0098]
1.8.1反转录
[0099]
以组织和细胞rna作为模板，严格按照lnrcute lncrna cdna第一链合成试剂盒实验步骤进行cdna合成。配置基因组dna去除反应体系，每10μl体系中含5
×
grna buffer 2μl，总 rna量不应该超过2000ng，最后加入rnase
‑
free ddh2o补足至10μl；混匀后简短离心，42℃孵育3min。配置反转录体系，在上述混合体系中加入10
×
lnr rt buffer 2μl，lnr rt enzymemix 2μl，lnr rt primer mix 2μl和rnase
‑
free ddh2o 5μl；反转录程序为42℃15min，95℃3min，冰上冷却，得到的cdna用于后续试验或低温保存。
[0100]
1.8.2荧光定量pcr检测
[0101]
实时荧光定量pcr扩增体系20μl：cdna(100～500ng)1μl，上游和下游引物(10μmol
·
l
‑1) 各0.5μl，50
×
rox reference dye 2μl，2
×
lnr lncrna premix 10μl，ddh2o 6μl。pcr扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火延伸32s，40个循环；扩增完成后进行熔解曲线分析，其程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15s。根据熔解曲线具有(85
±
0.8)℃t
m
扩增的特异性判断引物的特异性，每个待测样本均进行3次重复检测，取平均值。
[0102]
1.9 northern blot检测
[0103]
提取ipec
‑
j2细胞中总rna用于northern杂交试验，检测lncrna
‑
fut3
‑
as1在苏太猪和梅山猪肠道组织中的rna表达水平。具体步骤如下：
[0104]
(1)制备变性胶：取1g琼脂糖加入90ml的无酶水中，微波炉加热熔解，待温度降至55℃加入10
×
变性凝胶缓冲液10ml，混匀、制胶。待胶完全凝固后，置于1
×
mops凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
[0105]
(2)制备样品：取总rna样品5μl(20μg)，加入northernmax
tm formaldehyde load dye15μl，65℃孵育15min后迅速冰浴5min。在混合体系中加入eb至终浓度10～50μg
·
ml
‑1，以便在电泳时观察(可省略)。
[0106]
(3)电泳：小心上样，5v
·
cm
‑1进行电泳；电泳结束后取出胶块，置于紫外灯下观察rna 的完整性，记录各个条带的位置(距离样孔的距离)。
[0107]
(4)转膜：剪取一张大小合适的尼龙膜，用depc水浸湿并于20
×
ssc中放置1h；将胶块同样在20
×
ssc浸泡2次(每次15min)。将有机玻璃板放入大的干烤皿上作为平台，上面放一张滤纸，倒入20
×
ssc使液面略低于平台；然后再将翻转的凝胶(用parafilm膜围绕胶周围)、浸湿的尼龙膜、2张湿润滤纸、一叠(5～6cm厚)纸巾和玻璃按从下往上的顺序放置在上面，每层之间都注意不能有气泡，最后放一个重物压在玻璃板上。转膜持续12h后，将膜在6
×
ssc中放置5min，然后于80℃真空干烤30min。烤干后的膜密封保存，4℃备用。
[0108]
(5)探针标记：将lncrna
‑
fut3
‑
as1特异性的dna序列(nt 2693～3635)克隆到 pcdna4/my
‑
chis b载体中，并使用[α
‑
32
p]ctp和riboprobe体外转录标记系统产生长度为942 nt的放射性rna探针。探针序列引物：lncrna
‑
fut3
‑
as1
‑
f： gatagagcccaatttcttactct，lncrna
‑
fut3
‑
as1
‑
r：cagcaaccgtttcttgaatacct。
[0109]
(6)杂交：将膜放入2
×
ssc中，室温浸泡15min；弃去液体，加入预杂交液5ml，42℃条件下摇床中预杂交3h；标记探针100℃变性5min，冰上冷却4min，将变性的标记探针加入预杂交液中，42℃杂交16h。
[0110]
(7)洗膜：弃去杂交液，加入2
×
ssc/0.1％sds常温清洗15min，再加入0.2
×
ssc/0.1％sds， 55℃清洗2次，每次15min。
[0111]
(8)压片：将膜用双蒸水进行漂洗，用滤纸吸去膜上的水份；将膜包好置于暗盒中并在暗室中盖上x光片，暗盒置于
‑
70℃放射自显影5d左右，显影结束后记录结果。
[0112]
1.10大肠杆菌与猪小肠上皮细胞的黏附能力测定
[0113]
1.10.1细菌计数法检测大肠杆菌对细胞的黏附情况
[0114]
上述3组细胞及空白细胞分别按5.0
×
105个
·
孔
‑1细胞铺板到12孔细胞培养板，培养至细胞覆盖度达到90％左右。f18ab和f18ac大肠杆菌菌株分别接种至lb液体培养液，37℃摇床220rpm培养12h，4000rpm离心5min收集细菌菌体沉淀，用pbs缓冲液重悬沉淀并离心，重复洗涤3次。用dmem/f12细胞培养液将菌体沉淀稀释到1.0
×
109cfu
·
ml
‑1，加入 1.0ml细菌稀释液于细胞培养孔中，各3个重复，37℃5％co2培养箱孵育2h。吸去孔中细菌培养液，pbs缓冲液重悬洗涤3次。立即用0.5％triton x
‑
100(超纯水配制)溶液处理细胞20min，再用移液枪吹打收集细菌悬液，将其按10倍梯度稀释后涂布于lb固体平板， 37℃恒温培养过夜。最后对1000倍细菌稀释液涂布的平板进行细菌计数，利用image j软件统计平板上的菌落个数，最终黏附细菌数(cfu
·
ml
‑1)就等于平板上的菌落数
×
103。
[0115]
1.10.2菌毛蛋白基因定量法检测大肠杆菌对细胞的黏附情况
[0116]
细菌黏附步骤同1.10.1，pbs清洗后向培养孔中加入200μl的dna提取裂解液，并严谨地按照dna提取试剂盒试验步骤提取细胞和细菌总dna。以抽提出的混合dna为扩增模板，通过荧光定量pcr检测进行相对定量分析，每个样本设置3个重复。实时荧光定量 pcr扩增体系10μl：dna 100～500ng，上游和下游引物(10μmol
·
l
‑1)各0.2μl，50
×
rox reference dye i 0.2μl，2
×
aceqtm qpcr sybr green master mix 5μl，ddh2o补足至10μl。 pcr扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸34s，40个循环；扩增完成后进行熔解曲线分析，其程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15 s。根据熔解曲线具有(85
±
0.8)℃tm扩增的特异性判断引物的特异性，每个待测样本均进行3次重复检测，取平均值。
[0117]
1.10.3间接免疫荧光法观察大肠杆菌对细胞的黏附情况
[0118]
利用间接免疫荧光法检测时，细菌黏附前需要在孔中加入无菌的细胞爬片，待密度接近 90％时再进行试验。用pbs缓冲液温和漂洗3遍后，加入适量4％多聚甲醛于4℃冰箱甲醛固定20min。pbs缓冲液轻轻冲洗3遍，每遍5min；使用1％trtion x
‑
100破膜处理10min； pbs缓冲液小心冲洗3遍，每遍5分钟；吸净废液，加入封闭液(含5％bsa)37℃封闭1h；加入抗e.coli一抗(浓度为1:50，使用含5％fbs的pbs配制)，37℃孵育2h后于4℃冰箱过夜；次日吸掉一抗，使用pbs缓冲液小心冲洗3遍，每遍5min；加入红色荧光标记的二抗(浓度为1:200，使用5％fbs的pbs配制)，37℃避光孵育1h(从该步骤开始，所以操作请注意避光操作)；吸掉抗体，使用pbst缓冲液小心冲洗3遍，每遍5min；加入dapi 溶液(1mg
·
ml
‑1)进行染核，37℃孵育5min；使用pbst缓冲液小心冲洗3遍，每遍5min；使用防荧光淬灭封片剂封片，尽快于共聚焦显微镜下观察。
[0119]
1.10.4革兰氏镜检法观察大肠杆菌对细胞的黏附情况
[0120]
细菌黏附2h后用pbs缓冲液温和洗涤3次，以便去除未黏附的细菌。先加入结晶紫染色液初染1min，迅速水洗甩干后加入卢戈碘液进行媒染处理1min，水洗后再用95％酒精进行脱色(大约0.5min)直至加入的液体没有颜色为止，最后加入改良版石碳酸复红稀释液进行复染0.5min。水洗甩干后自然干燥，在显微镜下观察细菌黏附情况。
[0121]
1.10.5扫描电镜法观察大肠杆菌对细胞的黏附情况
[0122]
细胞铺板(6孔板或12孔板中放15mm细胞爬片)，待长至80％进行大肠杆菌侵染。大肠杆菌侵染细胞后用无菌pbs缓冲液轻轻洗涤3次，以除去未黏附的细菌。在每孔中加入1ml 2.5％戊二醛溶液使其完全浸没单层细胞，在无菌4℃条件下静置1h固定细胞；固定好的样品用pbs清洗3次，每次4℃10min；将样品依次置于浓度为30％、50％、70％、80％、90％、 95％、100％和100％(加无水na2so4)的酒精中脱水，每一梯度的静止时间为10min，前三个梯度在4℃下进行，80％后在室温进行；脱水后将样品浸入1ml叔丁醇中，加盖后在28℃的温箱内静置15min重复3次，使叔丁醇渗入样品的内部；随后在每孔内加入1ml叔丁醇加盖后放入4℃的冰箱内冷却25min；直接将6孔细胞板去盖后放入真空干燥器内，持续抽真空30min；用具有导电性的双面胶粘贴硅片和样品托板，喷金后用扫描电镜检测。
[0123]
1.11数据处理与分析
[0124]
采用2
‑
δδct
法处理相对定量的结果，用内参基因对表达水平进行均一化。运用下列公式：δδct＝(待测组目的基因平均ct值
–
待测组内参基因平均ct值)
–
(对照组目的基因平均ct值
–
对照组内参基因平均ct值)。利用spss 16.0软件的独立样本t检验对苏太抗性敏
感群体间lncrna
‑
fut3
‑
as1的基因表达差异情况进行比较分析，并利用spss 16.0软件的一般线性模型(general linear model，glm)对细菌侵染细胞前后、lps不同诱导时间、干扰前后的细胞lncrna
‑
fut3
‑
as1基因表达差异情况和干扰前后的细菌黏附情况进行比较分析。
[0125]
结果与分析
[0126]
2.1 lncrna
‑
fut3
‑
as1筛选与序列特征分析
[0127]
课题组前期基于苏太猪和梅山猪十二指肠之间的lncrna测序与mrna测序，并将两个品种差异表达的lncrna和mrna进行交集分析，筛选出3个共同差异表达lncrna和46 个共同差异表达mrna。结合靶基因预测，发现1个关键反义长链非编码 rna
‑
tcons_00183659，位于猪(sus scrofa)2号染色体上：73642050
‑
73663391，并且定位于靶基因fut3反义链上，按照目前通用的命名原则，将其命名为lncrna
‑
fut3
‑
as1，作为本研究重点验证与分析的lncrna分子。
[0128]
2.2 lncrna
‑
fut3
‑
as1在大肠杆菌抗性型与敏感型断奶仔猪十二指肠组织中的差异表达
[0129]
荧光定量结果显示lncrna
‑
fut3
‑
as1在梅山敏感型仔猪十二指肠中的mrna转录水平极显著高于抗性型(p<0.01)，lncrna
‑
fut3
‑
as1在苏太敏感型仔猪十二指肠中的转录水平也极显著高于抗性型(p<0.01)(图1)；northern blot进一步验证表明，敏感型仔猪 lncrna
‑
fut3
‑
as1表达水平明显高于抗性型(图2)。
[0130]
2.3 lps诱导和菌体侵染ipec
‑
j2细胞后lncrna
‑
fut3
‑
as1表达变化
[0131]
荧光定量结果显示，相对于空白对照细胞，lps诱导4h后其表达未发生显著变化，8h 后出现极显著上升(p<0.01)，12h后又开始下降，但仍与空白细胞差异极显著(p<0.01) (图3)；f18ab和f18ac大肠杆菌菌体侵染后，lncrna
‑
fut3
‑
as1表达均出现极显著的上调 (p<0.01)(图4)。
[0132]
2.4 lncrna
‑
fut3
‑
as1干扰ipec
‑
j2细胞系的建立
[0133]
lncrna
‑
fut3
‑
as1干扰sirna转染至ipec
‑
j2细胞24h后细胞观察到荧光，说明干扰 sirna已转染进细胞内能够发挥其干扰作用。利用荧光定量检测lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平，结果发现，相对空白组，sifut3
‑
as1
‑
1组lncrna
‑
fut3
‑
as1的表达水平为0.32，即干扰效率达到68％，表明已经成功建立了干扰lncrna
‑
fut3
‑
as1的ipec
‑
j2细胞系(图5)。
[0134]
2.5干扰lncrna
‑
fut3
‑
as1对大肠杆菌与ipec
‑
j2细胞黏附能力的影响
[0135]
为了探究lncrna
‑
fut3
‑
as1表达水平对大肠杆菌体外黏附能力的影响，本研究分别进行了菌毛蛋白基因荧光定量(图6)、细菌计数(图7)、革兰氏染色(图8)、扫描电镜(图9) 以及间接免疫荧光观察(图10)等一系列检测，结果显示，相对于对照组，lncrna
‑
fut3
‑
as1 表达沉默后，菌毛蛋白基因表达水平出现显著或极显著下降(p<0.05或p<0.01)，且 lncrna
‑
fut3
‑
as1沉默组黏附的f18大肠杆菌数量极显著减少(p<0.01)；同时革兰氏染色、扫描电镜以及间接免疫荧光观察结果均显示f18大肠杆菌与ipec
‑
j2细胞的能力出现明显的降低。