一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法

1.本发明涉及烟碱的分离提纯技术领域，尤其涉及一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法。


背景技术：

2.我国是烟草种植大国，烟草收入已经成为我国经济增长不可缺少的重要方面。但是每年都有大量废弃烟叶产生，它的处理是一个非常麻烦的问题。而废弃烟叶中含有的烟碱具有很高的应用价值，广泛应用于精细化工、制药、有机合成、国防工业和农业等领域。因此，从废弃烟叶中分离提取高纯度烟碱，使其变废为宝，再创经济价值，成为本领域技术人员的研究热点。
3.传统的烟碱提取方法主要有离子交换法、蒸馏法和萃取法，但以上提取技术因烟碱提取纯度耗时长、溶剂需求量大、成本高等缺点，在烟碱的规模化提取方面并未得到广泛应用。


技术实现要素：

4.鉴于背景技术中存在的上述问题，本发明提供了一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，本发明通过人工合成分子印迹聚合物，并将得到的分子印迹聚合物用于制备色谱柱，实现从废弃烟叶中快速并大量的提取活性成分(烟碱)，解决传统方法从废弃烟叶中提取活性成分存在成本高、步骤复杂、产物纯度低等的问题。
5.具体内容如下：
6.本发明提供了一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，所述方法包括如下步骤：
7.步骤1：将烟碱模板分子、功能单体、交联剂和引发剂超声溶解于溶剂中，得到分散相；
8.步骤2：将表面活性剂span80溶解于液体石蜡中，得到连续相；
9.步骤3：将分散相在搅拌条件下，缓慢滴加到连续相中，使连续相以包覆分散相的形式与分散相发生反相悬浮聚合，得到分子印迹聚合物粗品；
10.步骤4：用含乙酸或盐酸的甲醇溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物；
11.步骤5：将得到的分子印迹聚合物作为色谱柱的固定相填充到空flash色谱柱中制备成分子印迹色谱柱，并将分子印迹色谱柱连接到制备色谱中，用于从烟草粗提液中提取烟碱。
12.优选地，在所述步骤1中，所述功能单体为：4-乙烯基苯硼酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、对乙烯苯甲酸、对乙基苯乙烯、亚甲基丁二酸、二丙烯酰胺-2-甲基-1-磺酸、1-乙烯基咪唑、三氟甲基丙烯酸和丙烯酸中的至少一种；
13.所述溶剂为：水、乙腈、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种；
14.所述交联剂为：三甲氧基丙基三甲基丙烯酸酯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯和苯乙烯中的任意一种；
15.所述引发剂为：过硫酸钾、偶氮二异丁酸二甲酯和偶氮二异庚腈中的任意一种。
16.优选地，在所述步骤1中，所述烟碱模板分子、所述功能单体和所述交联剂的摩尔比为1：1-20:1：-20。
17.优选地，在所述步骤1中，所述引发剂的质量为所述交联剂的0.5％-2.0％。
18.优选地，在所述步骤1中，所述烟碱模板分子与所述溶剂的摩尔体积比为1mol：150-450ml。
19.优选地，在所述步骤2中，所述表面活性剂span80与所述液体石蜡的质量体积比为：1：21-26。
20.优选地，在所述步骤3中，所述分散相与所述连续相的体积比为1：8-32；
21.所述聚合反应的反应温度为30-80℃；反应时间为6h-8h。
22.优选地，在所述步骤4中，所述乙酸或盐酸，与甲醇的体积比为1:1-9。
23.优选地，在所述步骤5中，所述分子印迹色谱柱中，所述分子印迹聚合物的填充量为2-4g。
24.优选地，在所述步骤5中，所述烟草粗提液中提取出的烟碱的纯度大于等于96％。
25.与现有技术相比，本发明提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法具备以下优点：
26.1、本发明提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，该方法结合分子印迹技术与中低压制备色谱技术，将制备得到的分子印迹聚合物作为色谱柱的固定相填充到空flash色谱柱中制备成分子印迹色谱柱，并将其连接到制备色谱中，借助高效液相色谱，从烟草粗提液中提取烟碱，实现从废弃烟叶中快速、大量制备高纯度目标分子烟碱。
27.2、本发明提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，通过反向悬浮聚合法人工合成分子印迹聚合物，将制备得到的分子印迹聚合物用于制备色谱柱，并通过色谱分离技术实现从烟草粗提液中快速并大量的提取活性成分(烟碱)，有效减少溶剂用量，缩短提取时长，解决传统方法从废弃烟叶中提取活性成分烟碱存在成本高、步骤复杂、产物纯度低等的问题。且该方法具有普适性，仅通过替换模板分子便可用于其他废弃烟叶中活性成分的提取，具有良好的应用前景。
28.3、采用本发明提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法制备得到的分子印迹聚合物，具有吸附性强、选择性高、使用寿命长，可重复利用等优点。
29.4、采用本发明提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法提取得到的烟碱纯度高达96％，且提取过程中使用的烟草粗提液是由废弃烟叶经简单预处理得到，其来源稳定，成本低廉；制备得到的色谱柱可重复利用，使用的溶剂也是可以回收再利用的，极大降低了提取成本，避免环境污染。
附图说明
30.图1示出了本发明实施例提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法流程图；
31.图2示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物的静态吸附曲线图；
32.图3示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物的动力学吸附曲线图；
33.图4示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，在不同上样流速下的吸附率和洗脱率变化图；
34.图5示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，在不同比例洗脱溶液的洗脱效率变化图；
35.图6示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱的吸附饱和曲线图；
36.图7示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，用于分离烟叶粗提物中的烟碱的制备色谱图；
37.图8示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱分离得到的烟碱的质谱图；
38.图9示出了本发明实施例中过载液、洗脱液的液相色谱图。
具体实施方式
39.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
40.实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
41.为了实现从天然产物(废弃烟叶)中快速并大量的提取活性成分烟碱，解决传统方法从废弃烟叶中提取烟碱存在的成本高、步骤复杂、产物纯度低等的问题，本发明提供了一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，具体技术构思为：本发明通过人工合成分子印迹聚合物，并将得到的分子印迹聚合物用于制备flash色谱柱，实现从废弃烟叶中快速并大量的提取活性成分(烟碱)，有效降低了烟碱提纯的成本、简化了烟碱提纯步骤、提高了烟碱提取纯度。
42.基于上述技术构思，本发明提供了一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法，图1示出了本发明实施例提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法流程图，如图1所示，该方法包括如下步骤：
43.s11：将烟碱模板分子、功能单体、交联剂和引发剂超声溶解于溶剂中，得到分散相；
44.s12：将表面活性剂span80溶解于液体石蜡中，得到连续相；
45.s13：将分散相在搅拌条件下，缓慢滴加到连续相中，使连续相以包覆分散相的形式与分散相发生反相悬浮聚合，得到分子印迹聚合物粗品；
46.s14：用含乙酸或盐酸的甲醇溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物；
47.s15：将得到的分子印迹聚合物作为色谱柱的固定相填充到空flash色谱柱中制备成分子印迹色谱柱，并将分子印迹色谱柱连接到制备色谱中，用于从烟草粗提液中提取烟
碱。
48.具体实施时，本实施例借助反向悬浮聚合法，通过将烟碱模板分子、功能单体、交联剂和引发剂组成的分散相缓慢滴加到由表面活性剂span80与液体石蜡组成的有机溶液连续相中发生聚合反应，合成分子印迹聚合物粗品，借助洗脱液(含乙酸或盐酸的甲醇溶液)将分子印迹聚合物粗品中结合的烟碱进行洗脱后，得到含有大量烟碱结合位点的分子印迹聚合物，再将制备得到的分子印迹聚合物用于制备flash色谱柱，并通过色谱分离技术实现从烟草粗提液中快速并大量的提取活性成分烟碱，解决传统方法从废弃烟叶中提取活性成分烟碱，存在成本高、步骤复杂、产物纯度低等的问题。且该方法具有普适性，仅通过替换模板分子便可用于其他废弃烟叶中活性成分的提取，具有良好的应用前景。
49.具体实施时，在步骤1中，功能单体为：4-乙烯基苯硼酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、对乙烯苯甲酸、对乙基苯乙烯、亚甲基丁二酸、二丙烯酰胺-2-甲基-1-磺酸、1-乙烯基咪唑、三氟甲基丙烯酸和丙烯酸中的至少一种；
50.溶剂为：水、乙腈、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种；
51.交联剂为：三甲氧基丙基三甲基丙烯酸酯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯和苯乙烯中的任意一种；
52.引发剂为：过硫酸钾、偶氮二异丁酸二甲酯和偶氮二异庚腈中的任意一种。
53.具体实施时，在步骤1中，烟碱模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1：1-20：1-20。
54.具体实施时，在步骤1中，引发剂的质量为交联剂的0.5％～2.0％。
55.具体实施时，在步骤1中，烟碱模板分子与溶剂的摩尔体积比为1mol：150-450ml。
56.具体实施时，在步骤2中，表面活性剂span80与液体石蜡的质量体积比为1：21-26。
57.具体实施时，在步骤3中，分散相与连续相的体积比为1：8-32。
58.具体实施时，在此比例下分散相和连续相在表面活性剂span80作用下有明显液泡生成，形成油包水体系；
59.聚合反应的反应温度为30-80℃；反应时间为6h-8h。
60.具体实施时，在步骤4中，乙酸或盐酸，与甲醇的体积比为1:1-9。
61.具体实施时，在步骤5中，分子印迹色谱柱中，分子印迹聚合物的填充量为2-4g。
62.具体实施时，在步骤5中，烟草粗提液中提取得烟碱的纯度大于等于96％
63.下面通过一些实施例对本发明作进一步说明，但本发明不只限于下面的例子。
64.实施例1
65.1、分子印迹聚合物的制备(反向悬浮聚合法制备)：
66.惰性气体环境中，将40.5mg的烟碱模板分子、43mg的甲基丙烯酸(maa)、36mg丙烯酸(aa)、385mg的n,n-亚甲基双丙烯酰胺(bis)、30mg过硫酸铵(aps)溶于10ml/1ml的水/乙醇中，得到分散相；将10.3g的司盘80溶于352ml的液体石蜡中,得到连续相；然后在70℃、400rpm(转速)机械搅拌速度下，将分散相缓慢滴加到连续相中发生聚合反应，6小时后，对混合溶液进行过滤，得到分子印迹聚合物粗品，用含乙酸与甲醇体积比为1:9的混合溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物mip1。
67.非印迹聚合物nips(nonimprintedpolymers)的制备与实施例1的差别在于不加入模板分子，其他条件相同。以备后续作为空白试验进行对照。
68.2、分子印迹聚合物的吸附表征
69.利用静态吸附和动力学吸附实验来评估烟碱印迹及非印迹聚合物对烟碱的吸附性能，为后续制备色谱应用奠定基础。
70.a、静态吸附实验：
71.准确称取4份10mg上述实施例1制得的分子印迹聚合物mip1，分别置于4个10ml离心管中，并分别向4个离心管中加入不同浓度(0.03g/ml、0.05g/ml、0.1g/ml、0.2g/ml)的烟碱水溶液，置于恒温振荡摇床上一段时间，进行静态吸附实验，之后离心取上清液，氮气吹干定容至10ml进入高效液相色谱检测计算吸附容量。
72.作为对照组，以上述相同的技术手段，对非印迹聚合物nips实施静态吸附实验。
73.b、动力学吸附实验：
74.准确称取上述实施例3制备得到的10mg制得的分子印迹聚合物mip3，置于10ml离心管中，加入0.1g/ml的烟碱水溶液，置于恒温振荡摇床上进行吸附，在5、10、20、40、60、90、120mins时取出，离心取上清液，氮气吹干定容至10ml进入高效液相色谱检测计算吸附容量。
75.作为对照组，以上述相同的技术手段，对对比例1制得的非印迹聚合物nips实施动力学吸附实验。
76.图2示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物的静态吸附曲线图，如图2所示，当本实施例提供的分子印迹聚合物mip3的质量恒定，吸附溶液的烟碱浓度较小时，分子印迹聚合物mip3的吸附量随着烟碱溶液浓度的增大而增加。
77.图3示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物的动力学吸附曲线图，如图3所示，当吸附溶液烟碱浓度恒定时，分子印迹聚合物mip3对溶液中烟碱的吸附随时间变化逐渐达到平衡，并在20min左右，烟碱印迹聚合物对烟碱溶液的吸附达到饱和，随时间的增加，吸附量不再变化。
78.进一步地，如图2、图3所示，作为对照组的非印迹聚合物nips对溶液中烟碱的吸附能力均不及本实施例提供的分子印迹聚合物mip1。
79.3、分子印迹聚合物制备flash色谱柱及性能测试
80.(1)、分子印迹制备色谱柱的制备
81.在flash空柱管底部封上20μm孔径的聚乙烯筛板，并将滤膜(0.22μm)置于两层筛板中间，起到过滤作用。准确称取一定量实施例1提供的分子印迹聚合物mip3(2.0g)缓慢装入flash柱中，压紧、压平，在填料顶端加一层筛板将聚合物压实，保证mips在柱中均匀分布、不渗漏、不开裂，并将制备好的分子印迹色谱柱(mips-flashcolumn)连接到制备色谱中。
82.(2)、分子印迹制备色谱柱死时间的确定
83.将制备好的分子印迹制备色谱柱连接到制备色谱中，先用超纯水活化，确保色谱柱中的填料(聚合物)得到均匀润湿，完成活化。需要计算填料吸附率(量)来评价提取效率，为达到良好的分离效果，制作好的flash色谱柱应对烟碱有所保留，因此需要计算该色谱柱的死时间(或死体积)。分子印迹聚合物对甲苯没有吸附作用，选择甲苯为单一流动相以测
量flash色谱柱的死时间，该分子印迹-flash色谱柱的死时间即为甲苯的突破时间。该实验中的色谱条件如下，检测波长为206nm，流动相：甲苯，流速为2.0ml/min。
84.(3)、分子印迹制备色谱色谱条件的优化
85.本实验中制备色谱实验的步骤分为以下几步：用纯水对色谱柱进行活化，平衡色谱系统，确保色谱柱湿润且基线平稳；配置一定浓度的烟碱标准溶液，一定流速下，泵抽取上样一定体积。流动相切换为超纯水，淋洗平衡，洗掉待分离样品中的杂质和未被填料吸附的烟碱分子；流动相切换为水/乙酸混合溶液，洗脱烟碱；随后流动相切换为超纯水，冲洗净色谱中的乙酸，保持体系干净不被腐蚀。
86.洗脱和上样流速的优化：配制10mg/ml的烟碱标准溶液，以不同(2.0、3.0、4.0、5.0ml/min)上样速度用泵上样，随后用超纯水淋洗一定时间，切换流动相用洗脱溶剂以不同(2.0、3.0、4.0、5.0ml/min)流速洗脱80mins，最后用超纯水冲洗20mins，冲净系统中的洗脱溶剂。分别由吸附率和洗脱率来评价上样速率和洗脱速率。
87.洗脱溶剂比例的优化：配制10mg/ml的烟碱标准溶液，以2.0ml/min上样速度用泵上样，随后用超纯水淋洗30mins，切换流动相切换为不同体积分数的水/乙酸混合溶液(70/30，80/20，90/10，100，v/v)，在流速为5.0ml/min条件下洗脱80mins，最后用超纯水冲洗20mins，冲净系统中的洗脱溶剂，由洗脱率评价决定最佳比例洗脱溶剂。
88.图4示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，在不同上样流速下的吸附率和洗脱率变化图；图5示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，在不同比例洗脱溶液的洗脱效率变化图。由图4、图5确定烟碱分子印迹制备色谱最佳上样流速为2.0ml/min、和最佳洗脱流速为5.0ml/min，以及最佳洗脱剂比例为水/乙酸(70/30，v/v)。
89.(4)、烟碱分子印迹制备色谱柱的吸附容量
90.分别配制不同浓度(1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/ml)的烟碱标准溶液，流速为2.0ml/min条件下上样18mins，随后切换流动相为水/乙酸(70/30，v/v)，在流速为5.0ml/min条件下洗脱80mins，最后切换流动相为水，淋洗20mins，洗净体系中的乙酸。每次实验后收集合并过载液，取定量吹干定容，用hplc检测，并计算该flash色谱柱的吸附容量。
91.图6示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱的吸附饱和曲线图，如图6所示，本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱的吸附量随着烟碱溶液浓度的增大而增加。
92.(5)、烟叶预处理
93.将烟草粉末烘干，置于圆底烧瓶中，加入一定蒸馏水，置于微波反应器中，设定一定功率，辐射一段时间。停止后，过滤，滤液留存待用，滤渣置于圆底烧瓶，加入蒸馏水，重复上述步骤，共萃取3次。合并提取液旋蒸除去多余溶剂得到粗提液，过0.22μm尼龙滤膜待用。
94.(6)、利用分子印迹制备色谱从烟叶粗提物中提取烟碱
95.将粗提的烟叶萃取物用有机溶剂定容至10mg/ml、36ml，以2.0ml/min流速上样18mins，切换流动相为水/乙酸(70/30，v/v)，在流速为5.0ml/min条件下洗脱80min，最后切换流动相为水，淋洗20mins，洗净体系中的乙酸。收集洗脱部分。
96.图7示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱，用于分离烟叶粗提物中的烟碱的制备色谱图，如图7所示，第一个尖峰是预处理后的烟草粗提液，即烟
碱分子印迹flash色谱上样后的过载峰，第二个平台为洗脱峰，经旋转蒸发，得到白色固体。
97.图8示出了本发明实施例提供的分子印迹聚合物制备的flash色谱柱分离得到的烟碱的质谱图，如图8所示，本实施例用分子印迹聚合物制备的flash色谱柱分离烟叶粗提物中的白色固体进一步被确定为烟碱。
98.进一步地，图9示出了本发明实施例中过载液、洗脱液的液相色谱图，如图9所示，烟草粗提液中本来存在的杂质峰并未出现在洗脱液中，说明该烟碱分子印迹flash色谱法有效分离提纯了烟草中的烟碱。
99.经提取，该烟碱分子印迹flash色谱柱(2.0g)可从22.5g烟草原料中提取出纯度大于96％的烟碱307.94mg，产率为1.37％，提取率为83％。
100.实施例2
101.惰性气体环境中，将40.5mg的烟碱模板分子、129mg的maa、385mg的bis、30mgaps溶于10ml/1ml的水/乙醇中，得到分散相；将2.88g的司盘80溶于88ml的液体石蜡中,得到连续相；然后在70℃、400rpm(转速)机械搅拌速度下，将分散相缓慢滴加到连续相中发生聚合反应，6小时后，对混合溶液进行过滤，得到分子印迹聚合物粗品，用含乙酸与甲醇体积比为1:9的混合溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物mip2。
102.本实施例分子印迹聚合物的吸附表征结果以及分子印迹聚合物制备flash色谱柱及性能测试结果与实施例1相同，此处不再赘述。
103.实施例3
104.惰性气体环境中，将40.5mg的烟碱模板分子、86mg的maa、385mg的bis、30mgaps溶于10ml/1ml的水/乙醇中，得到分散相；将2.88g的司盘80溶于88ml的液体石蜡中,得到连续相；然后在70℃、400rpm(转速)机械搅拌速度下，将分散相缓慢滴加到连续相中发生聚合反应，6小时后，对混合溶液进行过滤，得到分子印迹聚合物粗品，用含乙酸与甲醇体积比为1:9的混合溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物mip3。
105.本实施例分子印迹聚合物的吸附表征结果以及分子印迹聚合物制备flash色谱柱及性能测试结果与实施例1相同，此处不再赘述。
106.实施例4
107.惰性气体环境中，将40.5mg的烟碱模板分子、64.5mg的maa、54mgaa、385mg的bis、30mgaps溶于10ml/1ml的水/乙醇中，得到分散相；将2.88g的司盘80溶于88ml的液体石蜡中,得到连续相；然后在70℃、400rpm(转速)机械搅拌速度下，将分散相缓慢滴加到连续相中发生聚合反应，6小时后，对混合溶液进行过滤，得到分子印迹聚合物粗品，用含乙酸与甲醇体积比为1:9的混合溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物mip4。
108.本实施例分子印迹聚合物的吸附表征结果以及分子印迹聚合物制备flash色谱柱及性能测试结果与实施例1相同，此处不再赘述。
109.实施例5
110.惰性气体环境中，将40.5mg的烟碱模板分子、43mg的maa、72mgaa、385mg的bis、30mgaps溶于10ml/1ml的水/乙醇中，得到分散相；将2.88g的司盘80溶于88ml的液体石蜡中,得到连续相；然后在70℃、400rpm(转速)机械搅拌速度下，将分散相缓慢滴加到连续相中发生聚合反应，6小时后，对混合溶液进行过滤，得到分子印迹聚合物粗品，用含乙酸与甲醇体积比为1:9的混合溶液清洗分子印迹聚合物粗品，得到分子印迹聚合物mip5。
111.本实施例分子印迹聚合物的吸附表征结果以及分子印迹聚合物制备flash色谱柱及性能测试结果与实施例1相同，此处不再赘述。
112.以上对本发明所提供的一种分子印迹聚合物提取烟碱的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。