一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.减蛋综合症(egg drop syndrome，eds-76)是由减蛋综合症病毒(egg drop syndrome virus，edsv)引起的，以产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特征的传染病。在1976年荷兰科学家van eck首次发现以来，edsv已经成为世界范围内影响鸡产蛋的主要病因之一。目前研究发现，作为影响家禽业的重要疾病，edsv在雏鸭中能诱发急性呼吸道疾病，具有潜在致病性，带来严重的经济损失。
3.减蛋综合症病毒属于禽腺病毒ⅲ群，血清型单一，菌株之间几乎不存在抗原性差异，病毒基因组为约33kb的线状双股dna，病毒颗粒由结构蛋白组成，核衣壳直径70～80nm，呈二十面体对称，dna被包于衣壳内。该结构蛋白包括核心蛋白(core protein)、构成衣壳的六邻体(hexon蛋白)、以纤维状突起从衣壳突出的三聚体纤维突出(fiber蛋白)及作为其基部的五邻体(penton蛋白)等。其中，六邻体、三聚体纤维及五邻体基座存在中和表位，其中的fiber蛋白与入侵宿主细胞有关。fiber蛋白是制备eds疫苗的理想抗原，能够刺激机体产生强的b细胞免疫应答，也是制备edsv抗体的理想免疫原。
4.由于eds主要引起产蛋性能下降，发病特征不明显，感染鉴别在edsv防控中显示出非常重要的作用，因此，针对现有eds防控技术中的问题，本发明对抗edsv的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的制备方法进行研究。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.一种特异性结合减蛋综合征病毒的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如seq.id no.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如seq.id no.2所示。
8.所述抗体或抗体片段为单克隆抗体或基因工程抗体；所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体和改形单克隆抗体。
9.所述抗体为单克隆抗体6f3h。
10.所述单克隆抗体6f3h的重链恒定区为igg1型，轻链恒定区为kappa型。
11.所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株6f3h，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2021286，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月20日。
12.所述的抗体或抗体片段在制备检测减蛋综合征病毒的胶体金检测试剂中的应用。
13.本发明有益效果：
14.本发明提供一种抗edsv的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6f3h，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2021286，保藏地址为武汉大学，
保藏时间为2021年10月20日。该杂交瘤细胞株制备时，将edsv衣壳蛋白fiber蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达，与疫苗佐剂混合后免疫balb/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(ns0)进行融合，并进行融合细胞的亚克隆与筛选，获得抗edsv的特异性单克隆抗体，特异性识别edsv病毒效价达到1∶20000以上，为eds的诊断制品开发提供生物材料。
15.本发明的单克隆抗体6h3f可用于免疫胶体金检测试纸条，该试纸条具有较好的特异性和灵敏度，试验表明病毒检测限为0.01ng/ml。
附图说明
16.图1纯化重组edsv fiber蛋白的凝胶电泳结果图。
17.其中，m，蛋白marker；1，大肠杆菌重组表达edsv fiber蛋白；2、3，纯化的大肠杆菌重组表达edsv fiber蛋白。
18.图2为balb/c小鼠血清抗体检测结果图。
19.其中，fib 1～4为fiber蛋白免疫小鼠，nc1～2为阴性对照小鼠。
20.图3为单克隆抗体筛选结果图。
21.图4为单克隆抗体ipma效价测定结果图。
22.图5为单克隆抗体6h3f特异性分析结果图。
23.图6为试纸条检测结果示意图。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
25.实施例1balb/c小鼠的免疫
26.抗原配制：取纯化的重组edsv fiber蛋白(由河南联科物联网科技有限公司自制，edsv fiber蛋白采用大肠杆菌重组表达制备，经ni亲和纯化获得纯度85％以上蛋白。其凝胶电泳结果如图1所示)，与等体积弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合后，进行乳化。抗原中fiber蛋白含量为100μg/ml。
27.免疫小鼠：取4只5周龄雌性balb/c小鼠，采用上述抗原进行皮下多点注射，每只注射弗氏完全佐剂制备抗原100ul，两周后用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第二次免疫，继续免疫两次，每次间隔两周。四次免疫后进行抗体效价检测，并取纯化的重组edsv fiber蛋白，用无菌pbs缓冲液稀释至100μg/500μl，然后直接进行腹腔注射500μl进行超免。另取2只小鼠作为阴性对照。
28.实施例2ipma方法检测balb/c小鼠抗体效价
29.小鼠血清抗体效价检测：免疫4次后的小鼠剪尾采血，每只采5μl加入195μl pbs缓冲液中，2000rpm离心5min分离血清；从1∶100开始，用pbs缓冲液连续倍比稀释，采用ipma方法测定血清抗体效价。结果显示，免疫小鼠抗体效价可达1∶6400，对照小鼠未检出抗edsv特异性抗体(图2)。
30.ipma方法：提前24h制备鸭胚成纤维细胞，在96孔板进行培养，细胞长至60-70％时，接入100ticd
50 edsv病毒(a127株，genbank y09598)，在37℃培养箱中培养36h。弃去细胞培养液，加入10％(wt)多聚甲醛，100μl/孔，室温放置20min，然后用pbst缓冲液洗3遍，每孔加入5％(w/v)的脱脂奶，37℃温箱中孵育1h。添加梯度稀释的血清样品，每个样品设置3
个重复，在37℃温箱反应1h。孵育结束后，以pbst缓冲液洗6遍，添加辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠的igg多抗，在37℃温箱孵育1h。孵育结束再用pbst缓冲液洗6遍；然后加入aec显色液进行显色，在显微镜下仔细观察，判定小鼠血清抗体效价。
31.图2为balb/c小鼠血清抗体检测结果，其中fib 1～4为fiber蛋白免疫小鼠，nc1～2为阴性对照小鼠。
32.实施例3单克隆抗体细胞株融合
33.超免后第4天对小鼠进行脱颈处死，无菌手术剪和镊子剖开脾脏，剪碎后用200目的滤网过滤，使单个分散的脾细胞穿透滤网流入无菌的玻璃烧杯内。将单个脾细胞加入洁净的离心管内，离心后添加40ml无血清的1640培养基到脾细胞，得到脾细胞悬液。
34.收集2
×
107～5
×
107个生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞ns0于无菌50ml离心管内，离心后加入40ml无血清的1640培养基，轻轻摇散细胞团，得到ns0细胞悬液。
35.把上述脾细胞悬液和ns0细胞悬液混合后离心去除培养基；逐滴添加1ml的50％(wt)的peg1500融合剂，接着缓慢逐滴加入15ml无血清的1640培养基终止融合。离心更换含hat的1640培养基，轻轻的混匀细胞悬液，把分散充分的悬浮细胞按照250μl/孔加入到20个左右的96孔板中，静置放入37℃培养箱中；3-4天后在显微镜下可以观察到小的细胞团，6-10天继续观察细胞团长大至占据60％的培养孔时，对杂交瘤细胞的上清用ipma的方法进行检测，并对阳性孔进行记录。
36.实施例4单克隆抗体的筛选及抗体效价鉴定
37.经hat培养基筛选的阳性细胞培养孔，转移到24孔板中继续扩大培养，并进行进一步的阳性筛选，待细胞长成明显可见的细胞团后，开始亚克隆。制备饲养细胞铺板96孔板，将每一个阳性孔细胞吹散混匀后，进行计数，取100个细胞稀释至10ml的1640培养基中，然后100μl/孔添加到已经铺有饲养细胞的96孔板中，在37℃温箱中培养5天左右，观察并标记出只有一个克隆的细胞培养孔。
38.当克隆细胞长至清晰可见、大小适宜时，对细胞培养上清再次进行ipma阳性鉴定，鉴定出阳性孔，然后把阳性孔的克隆转入24孔板继续亚克隆。重复三次亚克隆后的阳性单克隆细胞，再次进行ipma鉴定，一共得到3株特异性识别edsv的阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株，即2d6e、5c3a、6h3f(图3)。
39.抗体效价测定结果显示，单克隆细胞株6h3f培养上清，特异性识别edsv病毒效价达到1∶20000以上(图4)。标记单克隆细胞株6h3f并冻存于液氮中保存。
40.杂交瘤细胞株6f3h，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2021286，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月20日。
41.实施例5单克隆抗体的鉴定
42.1、单克隆抗体6h3f的类型和亚类的鉴定：用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体6h3f的亚型进行鉴定，结果显示抗体重链亚类为igg1，轻链亚类为kappa。
43.2、单克隆抗体6h3f检测edsv病毒
44.参照实施例2，用ipma方法检测鸭胚成纤维细胞培养的edsv病毒。取单克隆抗体6h3f对edsv病毒、新城疫病毒ndv、禽流感病毒aiv和禽心包积液综合症病毒(安卡拉)进行检测，结果显示抗体结合edsv病毒，但是与其他3种病毒均无交叉反应(图5)，说明单克隆抗体6h3f能够识别edsv，且具有良好的特异性。
45.实施例6单克隆抗体6h3f可变区序列的测定
46.根据鼠源单克隆抗体的序列特征，参考文献描述(邹明,陈杖榴.抗二氟沙星单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析[j].核农学报,2011,25(06))设计重链可变区引物序列：
[0047]
ph1引物：5
’‑
gtgaattca tgcaggtgcagctgttggagtctgg-3’(seq id no.3)，
[0048]
ph2引物：5
’‑
atgtcgactgaggagacggtgaccagggtgcctg-3’(seq id no.4)。
[0049]
设计轻链可变区引物序列：
[0050]
pvl1引物：5
’‑
ggcggatccgacattgtgatgacccactc-3’(seq id no.5)，
[0051]
pvl2引物：5
’‑
ccagtcgactaacgtttgatctccagcttggtccc-3’(seq id no.6)，
[0052]
收集单克隆抗体6h3f细胞，提取rna后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增。pcr扩增条件如下：预变性95℃ 10min，pcr进行35个循环，循环条件为变性95℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 40s。pcr反应结束后将扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序。
[0053]
结果，单克隆抗体6h3f的重链可变区的基因序列如seq id no.1所示，轻链可变区的基因序列如seq idno.2所示。
[0054]
实施例7单克隆抗体6h3f用于免疫胶体金方法检测edsv
[0055]
1、胶体金颗粒的制备及金标单抗的制备
[0056]
采用柠檬酸三钠法制备胶体金，具体方法如下：取99ml双蒸水加入耐热三角瓶中，将三角瓶放在具有加热功能的磁力搅拌器上加热并搅拌，然后加入1ml 1％(wt)的氯金酸，加热搅拌至沸腾，随后加入1.6ml 1％(wt)的柠檬酸三钠，持续加热搅拌，观察颜色由浅黄色逐渐变为深红色并至颜色不再变化后再加热搅拌5min，然后取下三角瓶冷却，待恢复室温后用无菌双蒸水定容至100ml，使用紫外扫描确定最大吸收峰波长为530nm后4℃保存。
[0057]
取3-20μl胶体金溶液滴在覆有formvar膜的铜网上，于空气中干燥。干燥后，在透射电镜下观察，使用电镜的统计功能，取多个胶体金颗粒，计算其平均直径。胶体金颗粒在8～12nm范围内方可使用。
[0058]
单克隆抗体6h3f经纯化后，再经透析、离心处理，测定标记胶体金所需抗体的最低稳定量。按照标记物的总量，计算所需胶体金和抗体的量。在磁力搅拌器上快速搅拌，缓慢加入抗体溶液，然后加入bsa溶液至终浓度为10ug/ml。使用高速离心机以18000rpm的速度离心20min，弃上清，用pbs缓冲液重悬沉淀胶体金。重复离心2次，得到金标单克隆抗体6h3f。
[0059]
2、胶体金试纸条的组装
[0060]
胶体金试纸条由底板、硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫、金标垫组成。将金标单克隆抗体6h3f喷涂到玻璃纤维后制备成金标垫；将抗edsv多克隆抗体(自制)和金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)喷涂在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线t和质控线c。将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫黏贴于底板上，即为edsv胶体金检测试纸条。
[0061]
在检测过程中，如果检测样品中不含有edsv抗原，则检测线所在位置没有反应发生，不会出现红色条带。同时出现质控线c和检测线t的为阳性反应，只有质控线而无检测线的为阴性反应。用试纸条检测edsv抗原时，试纸条上出现2条红色线的为阳性，仅质控线呈红色的为阴性(图6)。若质控线不显色则试剂条无效。
[0062]
抗edsv多克隆抗体为自制。使用“实施例1”中所述抗原(抗原中fiber蛋白含量为100μg/ml)，与弗氏完全佐剂按照体积比1∶1混合后充分乳化，免疫2月龄新西兰大白兔3只，免疫三次，每次200μl，每次间隔2周，第三次免疫后检测抗体抗edsv效价，抗体效价高于1∶10000后采血，提取血清igg。
[0063]
3、特异性试验
[0064]
用试纸条分别对edsv、蒸馏水、ndv、ibdv、ibv、安卡拉病毒以及正常鸭胚尿囊液进行检测，根据其显色情况判定结果。结果显示，除检测edsv的试纸条为阳性外，其余均为阴性。
[0065]
4、灵敏度试验
[0066]
制备纯化的edsv，病毒蛋白含量约2μg/ml。对病毒溶液进行稀释，制备稀释倍数为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
的病毒稀释液，用于edsv胶体金试纸的灵敏性检测。结果显示，该试纸条最低能检出10-5
稀释的edsv病毒缓冲液，表明病毒检测限为0.01ng/ml。