一种用于测量相对端粒长度的引物组合及其试剂盒和检测方法与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于测量相对端粒长度的引物组合。


背景技术：

2.端粒(telomere)是位于真核染色体末端一段特殊的结构，由端粒重复序列和端粒结合蛋白组成。端粒能够防止染色体末端的降解、融合和重排，是稳固真核生物染色体、保护遗传信息完整的必要组分。端粒序列是由富含g的短双链重复序列ttaggg串联组成，双链区长度一般在0.5-20kb。其中富含g碱基的一条链在3'末端比其互补链多出100-200bp核苷酸，形成一条突出的3'单链dna。这条突出的端粒单链dna被反折插入到端粒dna的双链区，从而使染色体dna终止于一种t型环(t-loop)结构，将末端端粒dna与细胞内环境隔绝，端粒作为染色体的保护性帽来防止dna损伤信号对染色体末端的识别。现有研究表明，端粒对于细胞复制性衰老以及整体衰老、衰老相关性疾病等生理病理过程起着重要的作用，端粒长度更被作为一种生物衰老相关标志物。而当细胞在端粒极短时继续存活，则会引起端粒结构和功能紊乱，导致基因组不稳定性发生，增加疾病发生风险。目前，端粒长度已成为退行性疾病如心血管疾病、阿尔兹海默症、风湿性关节炎等的重要生物指标。因此，建立一种精确可靠的端粒长度测量方法是非常必要的。
3.就目前而言，最常用的端粒长度检测方法包括：端粒末端限制性片段分析(terminal restriction fragment，trf)，是测定端粒长度应用最广泛也是最经典的方法，被称为“金标准"，但其所需dna标本量大(0.5～5ug)，实验周期长(3～5d)，对检测较短的端粒不敏感，而且所测结果还包括部分亚端粒区，选取不同限制性内切酶，所得结果可能不同，因此，端粒末端限制性片段分析不适于需要精确测定以及来源珍贵的标本。
4.原位杂交荧光定量法(quantitative fluorescent in situ hybridization，q-fish)，使用荧光标记的端粒探针直接杂交有丝分裂中期染色体上的端粒dna，用配备有数码相机和专用电脑的荧光显微镜对荧光信号进行分析。其测量结果为每条染色体的真实长度，不包括亚端粒序列长度。局限是不能检测衰老细胞、不分裂细胞和高度畸变细胞的端粒，而且费时费力、需要高水平的技术员，此方法一般应用于科学研究方面，不适合针对普通人群的测量。
5.流式荧光原位杂交法(flow fluorescent in situ hybridization，flow-fish)。是用荧光标记的特异识别端粒区域的肽核酸探针与固定、打孔的细胞杂交，端粒荧光信号用流式细胞仪分析，与标准品对比获得单个细胞内的整体端粒平均长度。此方法是第一个用于临床诊断的端粒长度检测方法，是目前最快、最敏感的检测人血液中粒细胞、t细胞、b细胞和天然杀伤细胞平均端粒长度的方法。此方法只适用于具有完整细胞核的二倍体和核型已知且稳定的有丝分裂间期细胞和样本，对于细胞核型高度变异的肿瘤细胞误差极大；pna探针会非特异结合细胞胞浆中的物质，所以最好是选用完整的细胞核，而不是细胞；此
外，此方法也只能评估单个细胞内的平均端粒长度，无法提供短端粒的信息，且对技术要求较高，耗时不易操作。
6.实时定量pcr(real time quantitative pcr，rt-qpcr)法测量端粒长度的主要原理是用特异的引物来扩增端粒，通过收集荧光估算出端粒的总长度(t)，用单拷贝基因的引物扩增单拷贝基因，来估算基因组拷贝数(s)，根据t/s比率，估算出每个二倍体基因组中端粒的平均长度。该法的优点是与trf法有很好的一致性，样品量的要求较低，且操作快捷、简便、经济、高效，局限是其所得结果反映的是端粒的相对长度而不是绝对长度，对短端粒不能测量，且样本之间可变性较大，移液过程中误差大。但由于端粒序列的特性，采用实时荧光定量pcr方法的引物容易产生非特异性扩增。


技术实现要素：

7.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于测量相对端粒长度的引物组合及其试剂盒和检测方法，本技术针对现有实时荧光定量pcr检测端粒长度的方法进行改进，具有端粒长度检测准确性高、重复性好、测量时间短、检测费用经济的特点。
8.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
9.一种用于测量相对端粒长度的引物组合，引物组合包括扩增待测样品的引物以及扩增内参单拷贝基因的引物，具体序列如seq id no.1～4所示。
10.tel-f:ggtttttgagggtgagggtgagggtgagggtgagggt；(seq id no.1)
11.tel-r:tcccgactatccctatccctatccctatccctatcccta；(seq id no.2)
12.hbg-f:gcttctgacacaactgtgttcactagc；(seq id no.3)
13.hbg-r:caccaacttcatccacgttcacc；(seq id no.4)
14.一种用于测量相对端粒长度的试剂盒，包括上述引物组合。
15.一种测量相对端粒长度的实时荧光定量pcr方法，包括以下步骤：
16.(1)提取待测样本dna；
17.(2)设计扩增待测样本dna的引物tel-f/r，具体序列如seq id no.1～2所示；
18.(3)设计扩增内参单拷贝基因的引物hbg-f/r；
19.(4)采用步骤(2)和(3)设计的引物进行pcr扩增，检测样本端粒长度扩增ct值和内参单拷贝基因扩增ct值；
20.(5)根据公式计算样本的相对端粒长度：
△
ct＝ct
tel-ct
hbg
。
21.进一步地，步骤(4)中对待测样本dna进行pcr扩增的体系包括：tb green premix ex tao il(2x)10μl、rox reference dye ll(50x)0.4μl、tel-f 1μl、tel-r 1μl、dna模板2μl，最后用ddh2o补足至20μl。
22.进一步地，tel-f的浓度为tel-r的10倍。
23.进一步地，步骤(4)中对内参单拷贝基因进行pcr扩增的体系包括：tb green premix ex tao il(2x)10μl、rox reference dye ll(50x)0.4μl、hbg-f 1μl、hbg-r 1μl、dna模板2μl，最后用ddh2o补足至20μl。
24.进一步地，hbg-f的浓度为hbg-r的3倍。
25.进一步地，步骤(4)所述pcr反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56℃退火34s，72℃延伸31s，共40个循环。
26.本发明的有益效果：
27.本技术设计了一种获得更准确且重复性好的端粒长度测量方法，且dna用量少，仅需50ng，测量速度快，有可比性，能精确的大批量测量出端粒长度，特别适合大规模人群端粒长度测量。
附图说明
28.图1为12个样本的检测结果；
29.图2为12个样本的重复性试验。
具体实施方式
30.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
31.实施例
32.1、人的基因组dna提取
33.按照lab-aid 824核酸提取mini试剂盒说明书将样本外周血取300μl于核酸提取试剂盒中同时加入60μldtt溶液于全自动核酸提取仪上机即可。采用超微量紫外分光光度计(thermo fisher)对dna样本进行纯度鉴定，选择a260/a280吸收峰度在1.8-2.0之间的dna样本进行下一步实验。
34.2、设计引物并合成；为了避免寡核苷酸引物ttaggg和ccctaa可能产生的引物自身杂交，将引物加以修饰，6个重复碱基中包括两个错配碱基和4个连续配对碱基，设计得到如下tel-f/r引物序列。
35.表1引物序列
[0036][0037]
3、rt-qpcr法测量人群端粒长度
[0038]
(1)引物按实验浓度要求进行溶解和稀释后，-20℃保存，稀释引物4℃备用不超过1周。
[0039]
(2)rt-qpcr反应体系为：
[0040]
为了减少引物之间的非特异性扩增，我们在pcr扩增时，采用增大上下游引物浓度之比，其中上游引物与下游引物终浓度之比为10:1。
[0041]
表2样本pcr体系
[0042][0043]
表3单拷贝基因体系
[0044][0045]
为确保实验数据的稳定和准确，每个样本都进行三次平行重复实验。在加样过程中需要特别小心，避免吸样和加样误差，同时，由于tb green premix ex tao il含高浓度去垢剂，容易起泡，因此，在取样和加样过程中，应避免小泡产生以造成误差。同时，在加样过程中，也要保证混样均匀，取量精确，避免实验误差的产生。同时，为确保每一板样本的值有可比性并减少实验误差，需要在每一板中加入对照(已知端粒长度的样本dna)。
[0046]
(3)将对照和样本放入abi实时荧光定量pcr仪上，循环条件为:95℃预变性30s；95℃变性5s，56℃退火34s，40个循环，进行pcr反应；95℃15s，60℃1min，95℃15s绘制熔解曲线。
[0047]
4、数据分析
[0048]
abi viia7 software v1.2采集分析数据。我们将对照样本端粒长度定义为1的话，每个样本的相对端粒长度为：该样本的
△
ct/对照样本的
△
ct,其中
△
ct＝ct
tel-ct
hbg
。12个样本的检测结果见图1和图2(重复性试验，4次预实验结果的平均值)。