1.本发明涉及一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
2.肾小球壁层上皮细胞(pecs)是位于肾小球包曼氏囊的扁平细胞，在生理条件下发挥了选择性的渗透屏障作用。最近的研究发现pecs可能直接参与某些肾小球疾病如新月体肾小球肾炎(cgn)和局灶节段性肾小球硬化(fsgs)的发病；此外，pecs可能是肾小球内祖细胞，参与了足细胞损伤后的再生修复。因此，pecs在肾小球疾病中的作用越来越受到人们的重视。
3.目前已有的原代肾小球的提取方法包括：
4.1、连续过筛法：ohse等依次使用180μm(80目)、107μm(150目)和75μm(200目)细胞筛分离获取小鼠肾小球[1]。单纯使用细胞筛的分离方法需要结合人工挑选肾小球或接种培养后挑选贴壁肾小球爬出细胞并进行后续挑选单克隆的方式才能获得单一种类的细胞，步骤繁琐，效率低下。
[0005]
2、免疫磁珠法：ronconi等使用cd133、cd24免疫磁珠筛选分离cd133+cd24
+
pecs[2]。这一方法需要酶消化，对肾组织进行解离形成单细胞悬液，并且需要其他免疫磁珠如cd31免疫磁珠和cd45免疫磁珠先行进行负选去除内皮细胞和白细胞。免疫磁珠分离虽然能够获得纯度非常高的单一细胞悬液，然而其费用比较昂贵，步骤繁琐。
[0006]
3、微磁珠法：kabgani等报道先使用直径4.5μm的微磁珠(dynabeads m450)灌注小鼠，使微磁珠嵌顿于小鼠肾小球毛细血管袢，然后使用100μm细胞筛对切碎的肾皮质进行初步组织解离，最后通过磁力架吸附磁珠将肾小球从悬液中分离出来[3]，本法虽然步骤较为简单，但费用昂贵。
[0007]
尽管体内研究(包括动物模型实验)仍然是研究肾小球疾病的“金标准”，但是体内研究能够深入地进行pecs机制研究的条件有限，特别是细胞生物应答过程中的胞内机制研究通常需要体外培养具有与体内细胞特性基本一致的细胞进行体外实验。相比较针对足细胞、系膜细胞和小管上皮细胞而言，目前可靠稳定的pecs细胞培养模型屈指可数。shakland等用慢病毒转染sv40大t抗原进入小鼠pecs基因组使其永生化，是目前用于研究pecs的细胞系。然而永生化的细胞系经历基因组改造，其生理功能和对刺激的反应与体内均有一定程度的不同。体外原代培养的细胞状态是可以获得的与体内性状最接近的细胞，也便于控制相关条件进行深入分子机制研究的较好的工具。因此，建立体外原代pecs培养体系并维持其在一定代数内的稳定具有重要意义。
[0008]
参考文献：
[0009]
[1]ohse t,pippin jw,vaughan mr,et al.establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture[j].j am soc nephrol,2008,19(10):1879-1890.doi:10.1681/asn.2007101087
[0010]
[2]ronconi e,sagrinati c,angelotti ml,et al.regeneration of glomerular podocytes by human renal progenitors[j].j am soc nephrol,2009,20(2):322-332.doi:10.1681/asn.2008070709
[0011]
[3]kabgani n,grigoleit t,schulte k,et al.primary cultures of glomerular parietal epithelial cells or podocytes with proven origin[j].plos one,2012,7(4):e34907.doi:10.1371/journal.pone.0034907
技术实现要素：
[0012]
本发明所要解决的技术问题是：提供一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，为进一步深入研究其生理作用提供基础。
[0013]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，包括如下步骤：
[0014]
步骤1：将小鼠肾皮质组织切成碎块，用预冷无菌d-hbss湿润切碎的肾皮质组织，过80目细胞筛，收集组织悬液，组织悬液过150目细胞筛，再次收集组织悬液于离心管中，离心，收集细胞组织；
[0015]
步骤2：加入d-pbs重悬步骤1.1所得的细胞组织于无菌离心管中，将离心管置于磁力架，静置离心管，吸出离心管内组织悬液并收集，用d-pbs冲洗吸附于离心管壁上的组织，吸净d-pbs后换新鲜d-1
×
pbs冲洗，重复冲洗3次；
[0016]
步骤3：吸净d-1
×
pbs后，用上皮细胞生长培养液重悬组织，此时组织悬液内主要为肾小球，即得小鼠肾小球悬液；
[0017]
步骤4：将小鼠肾小球悬液均匀铺于i型胶原包被的培养皿，于co2细胞培养箱中进行原代培养，期间观察肾小球贴壁和细胞爬出情况，吸去未贴壁组织，更换培养基；
[0018]
步骤5：采用预热至37℃的1
×
pbs冲洗培养皿；
[0019]
步骤6：吸净1
×
pbs，加入预热至37℃的0.25％的胰酶消化，加入胰酶孵育，期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态，当贴壁细胞变小变圆边缘透亮时立刻加入预热至37℃的完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打培养皿底上的细胞，将细胞全部冲下，得到细胞培养液；
[0020]
步骤7：将细胞培养液通过40μm细胞筛，目的是去除肾小球，收集细胞培养液于离心管中，进行离心；
[0021]
步骤8：离心后弃去上清培养液，用手指轻弹离心管底以弹松细胞沉淀，加入上皮细胞生长培养液重悬细胞后均匀铺于培养皿中，于co2细胞培养箱中进行培养；
[0022]
步骤9：当细胞长至90％～100％汇合后，进行传代培养。
[0023]
优选地，所述步骤1中碎块的大小为0.1
×
0.1
×
0.1mm，所述离心的条件为：500～600
×
g离心5～6min。
[0024]
优选地，所述步骤4中原代培养的条件为：37℃、5％co2的条件下培养7天。
[0025]
优选地，所述步骤6中孵育的条件为：37℃下孵育3～5min。
[0026]
优选地，所述步骤7中离心的条件为：500～600
×
g离心3～4min。
[0027]
优选地，所述步骤8中培养的条件为：37℃、5％co2的条件下培养，每2～3天更换一次上皮细胞生长培养液。
aldrich)。
[0050]
实施例
[0051]
本实施例提供了一种肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法：
[0052]
1、从小鼠肾皮质组织中提取肾小球
[0053]
(1)将肾皮质组织切成约0.1
×
0.1
×
0.1mm大小块状；转移到180μm(80目)筛网上，用预冷无菌d-hbss湿润切碎的肾皮质组织，另一无菌10cm培养皿接过筛的组织悬液；抽出无菌注射器内芯轻轻推压组织过180μm(80目)筛网；取筛网下组织继续过107μm(150目)筛网，过筛后组织悬液收集于离心管中，600
×
g离心5min，弃去上清；
[0054]
(2)加入d-pbs重悬组织于无菌15ml离心管，将离心管置于dynamag磁力架，静置离心管5min，收集离心管内组织悬液(主要成分为近端小管节段)，用1000ul移液枪吸取d-pbs冲洗吸附于离心管壁上的组织，吸尽d-pbs后换新鲜d-1
×
pbs冲洗，重复冲洗3次。
[0055]
(3)尽量吸尽d-pbs后，用上皮生长培养液重悬组织，此时组织悬液内主要为肾小球，即得小鼠肾小球悬液；
[0056]
2、小鼠肾小球壁层上皮细胞原代培养
[0057]
(1)将小鼠肾小球悬液均匀铺于i型胶原包被的培养皿，于co2细胞培养箱37℃、5％co2条件下进行原代培养，培养皿静置4天；
[0058]
(2)铺板第4天观察肾小球贴壁和细胞爬出情况，吸去未贴壁组织，更换培养液；
[0059]
(3)铺板第7天再次观察细胞爬出情况；
[0060]
3、小鼠肾小球壁层上皮细胞传代
[0061]
(1)预热37℃的1
×
pbs冲洗培养皿1次；
[0062]
(2)吸净1
×
pbs，加入预热37℃的0.25％胰酶消化，60mm培养皿加入1ml胰酶，37℃孵育3～5min，期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态，当贴壁细胞变小变圆边缘透亮时立刻加入预热37℃完全培养液终止消化，用1000μl移液器轻轻吹打培养皿底上的细胞，将细胞全部冲下；
[0063]
(3)50ml离心管管口放置一个40μm无菌细胞筛，含有细胞的培养液通过细胞筛，目的是去除肾小球，通过细胞筛后的培养液收集于50ml离心管中，600
×
g离心3min；
[0064]
(4)离心后弃去上清培养液，用手指轻弹离心管底以弹松细胞沉淀，加入上皮细胞生长培养液重悬细胞后均匀铺于60mm培养皿中，于co2细胞培养箱37℃、5％co2条件下培养。每2～3天更换一次上皮细胞培养液；当细胞长至90％～100％汇合后，可进行传代。
[0065]
4、小鼠肾小球壁层上皮细胞传代后的维持培养
[0066]
当细胞传代至3代以后可以使用普通含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液进行维持培养。
[0067]
5、小鼠肾小球壁层上皮细胞的鉴定
[0068]
(1)小球贴壁后细胞爬出生长形成集落。细胞形态呈多形性或纺锤形，胞质较少，遮光度中等，细胞核较小；偶见细胞体积较大、胞质较丰富、细胞核较大，细胞边缘可向外形成短小的触角样结构。静置培养7日后，集落与集落之间可见细胞汇合，细胞呈现铺路石样，胞体、细胞核较大，胞质丰富；
[0069]
(2)分别将分离出的肾小球、肾小管节段和原代pecs提取蛋白。western blot显示原代pecs表达pecs特异性标志蛋白claudin-1，肾小球仅有少量表达，肾小管节段几乎不表
达。原代pecs未表达足细胞标志物nephrin，近端小管标志物aquaporin-1和系膜细胞蛋白α-sma。免疫荧光染色显示原代pecs表达claudin-1，细胞之间呈线性荧光表达。而未见明显的小管上皮细胞蛋白e-cadherin,足细胞特异性蛋白podocalyxin以及系膜细胞表达蛋白α-sma。此外，原代pecs观察到claudin-1与cd24共表达。干细胞标志物cd24与cd133可见共定位表达；
[0070]
(3)pecs传代至第6代，细胞仍显示铺路石状。免疫荧光染色显示p0、p3和p6代pecs均能够共表达cd133和cd24。实时定量pcr和western印迹结果显示，培养至6代的pecs均表达pecs标志蛋白claudin-1，干细胞标志物cd133和cd24；几乎不表达肾小管标志物aqp1、apa和足细胞标志物synaptopodin、podocin、nephrin和wt-1。
[0071]
6、诱导小鼠肾小球壁层上皮细胞向足细胞分化
[0072]
(1)取传代3代以后的肾小球壁层上皮细胞，用移液管吸净上皮细胞生长培养液，更换为诱导分化培养液，诱导分化一周；
[0073]
(2)免疫荧光染色显示经过诱导分化培养基孵育后，细胞之间的线性claudin-1表达消失，而足细胞特异性标志蛋白wt-1表达于细胞核，synaptopodin、podocalyxin表达于胞浆。western印迹结果显示诱导分化的pecs中podocalyxin、synaptopodin和wt-1的水平显著升高，而claudin-1表达下降。
[0074]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。