用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒与流程

用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒
1.本技术是申请人为“百欧恩泰诊断有限责任公司”和“斯卓蒂费尔分子病理学有限责任公司”、申请号为“201680022369.x”、发明名称为“用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种用于鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，以及将膀胱癌患者进行分层以进行肿瘤治疗的方法。本发明还涉及相应有试剂盒及其用途，以及用于膀胱癌的预后生物标志物，特别是单一的预后生物标志物。


背景技术：

3.基于组织病理学评估，膀胱癌被认为异质性非常高，其包括全部的不同组织病理学亚型(乳头状，非乳头状，鳞状细胞癌，腺癌，肉瘤，小细胞癌等)。还已知膀胱癌具有广泛多变的临床结果，而且对局部或全身治疗具有显着差异。对膀胱癌的预后和治疗非常重要的是侵入深度。
4.未侵入肌肉层的肿瘤称为表层或非肌层浸润性肿瘤(非肌层肉浸润性膀胱癌，nmibc)。nmibc占所有膀胱肿瘤的70％左右。nmibc不会立即危及生命，但是具有高度的复发倾向，需要进行终生的且昂贵的监护。目前，尽管事实表明在非手术治疗的情况下仍有额外的治疗选择，但是按照当前的治疗标准(经尿道切除术联合卡介苗(bcg)滴注)来看，仍然有超过30％的表层膀胱癌患者明显治疗不足，从而发展为转移性并死亡。表层膀胱肿瘤可以在经尿道切除术中被切除器刮掉，其也可用于肿瘤的病理分期。膀胱内施用bcg是一种免疫治疗方法，可以用来预防表层膀胱癌的复发。然而，高达60％的nmibc复发，需要进一步更极端性的手术(即膀胱切除术)、局部治疗(例如辐射)和/或化疗(其可以直接滴入膀胱)。更具体地说，已经观察到“30定律”，意味着在局部切除术和bcg辅助滴注治疗后，30％的患者未复发，30％的患者复发并需要更极端性的治疗，30％的患者快速进展成为转移性。因此，虽然在许多情况下，局部切除术和bcg治疗是足够的，膀胱可以保留相当长的时间，但是，其他患者却会受到这些当前治疗方案的伤害，并且需要直接的极端性膀胱切除术和围手术期化疗来达到治疗目的。显然，临床上需要更好地评估非肌层浸润性膀胱癌患者的个体风险，以便更好地利用基本治愈方案中现有的治疗方案，例如通过分层患者获得更个体化治疗方法。
5.进一步侵入肌层的肿瘤称为肌层浸润性膀胱癌(mibcs)。mibcs需要极端性膀胱切除和围手术期基于顺铂的联合化疗。目前，治疗的选择完全基于临床病理特征，这些特征严重不准确，导致临床分期不足的比率高得令人无法接受，并导致采用治疗不足并因此危及生命的治疗方案。此外，常规化疗只对30％的病例有效。重要的是，基于顺铂的新辅助化疗提供了获得肌层浸润性膀胱癌患者的病理完全反应的机会，接着与优良的长期保留且较不极端性的手术干预进行联合治疗。然而，对于对新辅助化疗无反应的肿瘤，立即进行极端性手术干预似乎是预防进一步进展和死亡的更好的治疗选择。因此，临床上有很大的需要去
识别可能对化疗有反应的肿瘤，并决定最佳的治疗方案(新辅助化疗或辅助化疗)。此外，靶向治疗方案如抗激素(内分泌)或抗her2疗法目前尚未得到应用，也不可能通过常规方法建立对这些受体的检测，以便能够预测对相应的靶向治疗的反应的方法。
6.总之，医学上需要更好地为膀胱癌患者的复发风险和对化疗或替代治疗的反应进行分类，这对于非浸润性和浸润性膀胱肿瘤患者是非常重要的。重要的是，对于两种膀胱癌不同分期的患者，由于目前的临床病理特征不能可靠地评估预后，所以目前尚不清楚最佳的治疗方案。
7.目前世界上使用的检测癌症(例如乳腺癌)受体状态的标准方法为由福尔马林固定且石蜡包埋(ffpe)活组织切片或切除组织的免疫组织化学(ihc)。在乳腺癌中，内分泌或靶向全身治疗(例如曲妥珠单抗)的施用主要基于ihc。然而，通过基于ihc的方法测试多个标记来确定个体风险，并不能导致可靠的膀胱癌预后分类，这可能有助于解决所描述的诊断和治疗困境。此外，ihc的测试通常缺乏灵敏性。
8.因此，显然需要一种可靠、客观、定量和可重复的膀胱癌分子亚型检测系统，如患者分层，以进行可靠的个体风险评估，从而有利于选择合适的肿瘤治疗方案，并可预测治疗的预后及预测治疗的成功。此外，这种测试系统应允许适合大部分癌症患者的分散测试。
9.这些以及其他目的通过下面将要描述的本发明来解决。


技术实现要素：

10.在一个方面，本发明涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本中至少一种选自人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(esr1)、孕激素受体(pgr)、增殖抗原ki-67(ki67)和racgtp酶激活蛋白1(racgap1)基因的rna转录本的表达水平。
11.在一个实施方案中，确定选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1中的至少两种、三种或四种基因的rna转录本的表达水平。
12.在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
13.(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；和
14.(b)确定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平，
15.其中，所述方法还包括确定肿瘤样本中至少一种选自ki67和racgap1基因的rna转录本的表达水平。
16.在一个实施方案中，本发明涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括以下步骤：
17.(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；
18.(b)确定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平；
19.(c)确定肿瘤样本中pgr的rna转录本的表达水平；和，优选地，
20.(d)确定肿瘤样本中至少一种选自k167和racgap1基因的rna转录本的表达水平。
21.在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
22.(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；
23.(b)测定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平；
24.(c)确定肿瘤样本中pgr的rna转录本的表达水平；和
25.(d)确定肿瘤样本中ki67的rna转录本的表达水平。
26.在一个实施方案中，所述确定rna转录本的表达水平包括确定rna转录本的表达水平是低于还是高于rna转录本的设定表达阈值。
27.在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)、(c)和(d)之前进行。
28.在一个实施方案中，步骤(d)在步骤(a)、(b)和(c)之后进行。
29.在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行，步骤(b)在步骤(c)之前进行，步骤(c)在步骤(d)之前进行。
30.在一个实施方案中，所述分子亚型选自her2阳性、三阴性，管腔a(luminala)型和管腔b(luminal b)型。
31.在一个实施方案中，所述her2的rna转录本的表达水平比her2的rna转录本的设定表达阈值高，将肿瘤的分子亚型鉴定为her2-阳性。
32.在一个实施方案中，所述esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值，表示阳性预后，其中，优选地，所述阳性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选rfs和/或pfs的概率升高。
33.在一个实施方案中，所述esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值，表示阴性预后，其中，优选地，所述阴性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选rfs和/或pfs的概率降低。
34.在一个实施方案中，
35.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
36.esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
37.pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
38.ki67的rna转录本的表达水平低于或高于ki67的rna转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为三阴性。
39.在一个实施方案中，所述分子亚型为管腔a(luminal a)型或管腔b(luminal b)型。
40.在一个实施方案中，
41.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
42.esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
43.pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
44.ki67的rna转录本的表达水平高于ki67的rna转录本的设定表达阈值
45.将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
46.在一个实施方案中，
47.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
48.esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
49.pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
50.ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
51.将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔a(luminal a)型。
52.在一个实施方案中，
53.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
54.esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
55.pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
56.ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
57.将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
58.在一个实施方案中，
59.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
60.esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
61.pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
62.ki67的rna转录本的表达水平高于ki67的rna转录本的设定表达阈值
63.将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
64.在一个实施方案中，
65.her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
66.esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
67.pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
68.ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
69.将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔a(luminal a)型。
70.在一个实施方案中，
[0071]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(dss)的概率相关，该概率比与管腔b型分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％；
[0072]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性分子亚型或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少30％，优选至少35％；和/或
[0073]-所述管腔b型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性分子亚型或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％。
[0074]
在一个实施方案中，所述患者是男性患者，
[0075]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(dss)的概率相关，该概率比与管腔b型分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％；
[0076]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少15％，优选至少20％；
[0077]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少30％，优选至少35％；
[0078]-所述管腔b型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少15％，优选至少20％；和/或
[0079]-所述her2阳性分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％。
[0080]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)。
[0081]
在一个实施方案中，所述样本是从肿瘤提取的rna。
[0082]
在一个实施方案中，通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)确定rna转录本的表达水平。
[0083]
在一个实施方案中，所述定量pcr是实时荧光定量pcr。
[0084]
在一个实施方案中，所述方法包括使用具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：1和2所示序列的至少10个连续核苷酸的esr1特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：4和5所示序列的至少10个连续核苷酸的her2特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：7和8所示序列的至少10个连续核苷酸的ki67特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：10和11所示序列的至少10个连续核苷酸的pgr特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：13和14所示序列的至少10个连续核苷酸的racgap1特异性引物。
[0085]
在一个实施方案中，所述方法包括使用具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：3所示序列的至少15个连续核苷酸的esr1特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：6所示序列的至少15个连续核苷酸的her2特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：9所示序列的至少15个连续核苷酸的ki67特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：12所示序列的至少15个连续核苷酸的pgr特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：15所示序列的至少15个连续核苷酸的racgap1特异性探针。
[0086]
在一个实施方案中，将所述表达水平相对于肿瘤样本中一种或多种参照基因的(平均)表达水平进行标准化。
[0087]
在一个实施方案中，所述一种或多种参照基因选自calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh。
[0088]
另一个方面，本发明涉及一种将膀胱癌患者分层以进行肿瘤治疗的方法，所述方法包括，第一步，使用如上所述的体外方法鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型，和第二步，基于通过所述体外方法鉴定的分子亚型选择肿瘤治疗方案。
[0089]
在一个实施方案中，所述分子亚型选自her2-阳性、三阴性、管腔a(luminal a)型和管腔b(luminal b)型。
[0090]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)。
[0091]
在一个实施方案中，
[0092]-所述分子亚型是管腔a型，所述膀胱癌是nmibc，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术(tur)和/或卡介苗(bcg)滴注，优选tur和bcg滴注；
[0093]-所述分子亚型为管腔b型，所述膀胱癌为nmibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用辅助内分泌治疗的辅助化疗；
[0094]-所述分子亚型是her2阳性，所述膀胱癌是nmibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用(新)辅助内分泌治疗的(新)辅助化疗；
[0095]-所述分子亚型为三阴性，所述膀胱癌为nmibc，所述肿瘤治疗方案为新辅助化疗；
[0096]-所述分子亚型是管腔a型，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助内分泌治疗，优选辅助化疗或辅助内分泌治疗；
[0097]-所述分子亚型是管腔b型，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助内分泌治疗，优选辅助化疗和辅助内分泌治疗；
[0098]-所述分子亚型是her2阳性，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助抗her2治疗，优选辅助化疗和辅助抗her2治疗；和/或
[0099]-所述分子亚型是三阴性，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用随后的膀胱切除术的新辅助化疗。
[0100]
在另一方面，本发明涉及一种治疗膀胱癌的方法，该方法包括，第一步，使用上述方法将膀胱癌患者分层以进行肿瘤治疗，第二步，向膀胱癌患者提供选择的肿瘤治疗方案。
[0101]
在另一方面，本发明涉及利用逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)的试剂盒在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型中的用途，所述试剂盒包含至少一对选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1基因特异性的引物和和至少一种选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1基因特异性的探针。
[0102]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1的至少两种、三种或四种基因的特异性引物对和特异性探针。
[0103]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
[0104]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0105]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；和，可选地
[0106]-至少一对ki67特异性引物和至少一种ki67特异性探针；和/或
[0107]-至少一对racgap1特异性引物和至少一种racgap1特异性探针。
[0108]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含：
[0109]-至少一对pgr特异性引物和至少一种pgr特异性探针。
[0110]
在一个实施方案中，本发明涉及利用逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型中的用途，所述试剂盒包含：
[0111]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0112]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；
[0113]-至少一对pgr特异性引物和至少一个pgr特异性探针；和
[0114]-至少一对ki67特异性引物和至少一个ki67特异性探针；和/或
[0115]-至少一对racgap1特异性引物和至少一种racgap1特异性探针。
[0116]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
[0117]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0118]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；
[0119]-至少一对pgr特异性引物和至少一个pgr特异性探针；和
[0120]-至少一对ki67特异性引物和至少一个ki67特异性探针。
[0121]
在一个实施方案中，所述定量pcr是实时荧光定量pcr。
[0122]
在一个实施方案中，所述探针的检测是基于扩增介导的探针置换。
[0123]
在一个实施方案中，所述探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0124]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含逆转录酶和dna聚合酶。
[0125]
在一个实施方案中，所述逆转录酶和dna聚合酶以酶混合物的形式提供，这允许一
步法逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)。
[0126]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一对参照基因特异性引物和至少一个参照基因特异性探针。
[0127]
在一个实施方案中，所述参照基因是选自以下基因组中的一种或多种：calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh。
[0128]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种对照rna样本。
[0129]
在一个实施方案中，所述引物提供小于120bp的扩增子大小。
[0130]
在一个实施方案中，所述esr1特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：1和2所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述her2特异性的引物具有15至30核苷酸的长度且包含seq id no：4和5所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述ki67特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：7和8所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述pgr特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：10和11所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述racgap1特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度并且包含seq id no：13和14所示序列的至少10个连续核苷酸。
[0131]
在一个实施方案中，所述esr1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：3所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述her2特异性的探针具有20至35核苷酸的长度且包含seq id no：6所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述ki67特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：9所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述pgr特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：12所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述racgap1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度并且包含seq id no：15所示序列的至少15个连续核苷酸。
[0132]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)。
[0133]
在另一方面，本发明涉及esr1的rna转录本的表达水平和/或pgr的rna转录本的表达水平作为膀胱癌预后生物标志物的用途。
[0134]
在一个实施方案中，将所述esr1的rna转录本的表达水平或所述pgr的rna转录本的表达水平用作单一预后生物标志物。
[0135]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)。
[0136]
在一个实施方案中，
[0137]-esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后；和/或
[0138]-pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后。
[0139]
在一个实施方案中，所述阳性预后后包括延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选dss的概率升高。
[0140]
在一个实施方案中，
[0141]-esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阴性预
后；和/或
[0142]-pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值表示阴性预后。
[0143]
在一个实施方案中，所述阴性预后包括延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活存(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选dss的概率降低。
[0144]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是her2阳性分子亚型，esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后，其中，优选地，阳性预后延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选rfs和/或pfs的概率升高。
[0145]
在一个实施方案中，所述膀胱癌是her2阳性分子亚型，esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阴性预后，其中，优选地，阴性预后包括延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活存(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选rfs和/或pfs的概率降低。
附图说明
[0146]
图1概述了根据本发明鉴定的管腔a型、管腔b型、her2阳性和三阴性分子亚型的非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)的肿瘤治疗方案(tx——治疗)。
[0147]
图2总结了基于二分法单标记检测的组合使用的分类方案。
[0148]
图3示出了当在西门子versant kpcr系统上使用如本文所述的bladdertyper rt-qpcr试剂盒时，根据图2的方案用于膀胱癌亚型分型的各个标记物的阈值。
[0149]
图4示出了在82例非肌层浸润性膀胱癌样本中使用本文所述的bladdertyper rt-qpcr试剂盒的时候，候选基因esr1、pgr、her2和ki67的mrna的标准表达水平的数据分布。
[0150]
图5示出了评估her2、esr1和pgr的mrna表达水平对于膀胱癌患者的5年疾病特异性存活(dss)率的预后和预测价值的划分检验。来自82个肿瘤的可用数据通过图2所示的分类方案，利用图3所示的各个基因的阈值进行分层。
[0151]
图6示出了具有her2阳性(her2+)、管腔a/b型(lum)或三阴性(tnbc)肿瘤的膀胱癌患者的疾病特异性存活的kaplan meier分析，其中肿瘤的分子亚型根据本发明基于her2、esr1和pgr的mrna表达水平进行鉴定。如本发明人所确定，管腔a/b型(lum)分子亚型与5年后的较高的疾病特异性存活率相关，显著不同于与her2阳性膀胱肿瘤或三阴性膀胱癌的相关性(90％：80％：70％；p＝0.02)。
[0152]
图7示出了评估her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平对于膀胱癌患者的5年疾病特异性存活(dss)率的预后和预测价值的划分检验。来自82个肿瘤的可用数据通过图2所示的分类方案，利用图3所示的各个基因的阈值进行分层。对于腔内肿瘤，ki67的阈值为3612区分管腔a型或管腔b型肿瘤最好。
[0153]
图8示出了具有管腔a型(luma)、管腔b型(lumb)、her2阳性(her2+)或三阴性的膀胱癌患者的疾病特异性存活(dss，经尿道切除术后的癌症特异性死亡)的kaplan meier分析；其中，肿瘤的分子亚型根据本发明基于her2，esr1、pgr和ki67的mrna表达水平进行鉴定。如本发明人所确定，管腔a型型比管腔b型、her2阳性和三阴性肿瘤8年后具有显着更好
的dss率(p＝0.04；管腔a型100％：管腔b型80％：her2阳性70％：三阴性膀胱癌：60％)。
[0154]
图9示出了评估her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平对于男性膀胱癌患者的5年疾病特异性存活(dss)率的预后和预测价值的划分检验。来自67个肿瘤的可用数据通过图2所示的分类方案，利用图3所示的各个基因的阈值进行分层。对于腔内肿瘤，ki67的阈值为3612时区分管腔a型和管腔b型肿瘤最好。
[0155]
图10示出了具有管腔a型(luma)、管腔b型(lumb)、her2阳性(her2+)或者三阴性膀胱癌(tnbc)的男性膀胱癌患者的疾病特异性存活(dss；经尿道切除术后的癌症特异性死亡)的kaplan meier分析；其中，肿瘤分子的亚型根据本发明基于her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平进行鉴定。如本发明人所确定，管腔a型比管腔b型、her阳性和三阴性肿瘤8年后具有显着更好的dss率(p＝0.09；管腔a型100％：管腔b型80％：her2阳性70％：三阴性膀胱癌：60％)。
[0156]
图11示出了esr1阳性膀胱癌(esr1+)与esr1阴性膀胱癌(esr1-)之间的疾病特异性存活(dss；经尿道切除术后的癌症特异性死亡)的kaplan meier分析，其中根据本发明基于esr1的mrna表达水平鉴定了esr1阳性肿瘤。esr1阳性肿瘤具有显着更好的疾病特异性存活率(p＝0.02)。
[0157]
图12示出了pgr阳性膀胱癌(pgr+)与pgr阴性膀胱癌(pgr-)的疾病特异性存活(dss；经尿道切除术后的癌症特异性死亡)的kaplan meier分析，其中根据本发明基于pgr的mrna表达水平鉴定了pgr阳性肿瘤。pgr阳性肿瘤具有显着更好的疾病特异性存活率(p＝0.01)。
[0158]
图13示出了以下mibc“亚型”：her2+、her2-/esr1+、her2-/esr1-/ki67+和her2-/esr1-/ki67-的疾病特异性存活(dss，以月计)的kaplan meier分析(p《0.0001)。
[0159]
图14示出了评估her2、esr1和ki67的mrna表达水平对于mibc患者的疾病特异性存活(dss)率的预后和预测价值的划分检验。
[0160]
图15示出了评估her2和esr1的mrna表达水平对于nmibc患者的无进展存活(pfs)率的预后和预测价值的划分检验。
[0161]
图16示出了以下nmibc“亚型”：her2-、her2+/esr1-和her2+/esr1+的无复发存活(rfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0162]
图17示出了以下nmibc“亚型”：her2-、her2+/esr1-和her2+/esr1+的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0163]
图18示出了基于nmibc肿瘤中her2和esr1的mrna表达状态的无进展存活(pfs；以月计)的多变量分析的比例风险模型。
[0164]
图19示出了整个t1 nmibc群体的亚型分布。
[0165]
图20示出了基于nmibc验证群体中预定义亚型的无复发存活(rfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0166]
图21示出了根据who 2004年方案调整cis、肿瘤大小、性别和who分级后，nmibc验证群体中rfs的预定义分子亚型的预后价值的多变量分析。
[0167]
图22示出了基于nmibc验证群体中预定义亚型的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0168]
图23示出了根据who 2004年方案调整cis、肿瘤大小、性别和who分级后，nmibc验
证群体中pfs的预定义分子亚型的预后价值的多变量分析。
[0169]
图24示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1)分层的nmibc患者的无复发存活(rfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0170]
图25示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1)分层的nmibc患者的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0171]
图26示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1)分层的男性nmibc患者的无复发存活(rfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0172]
图27示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1)分层的男性nmibc患者的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0173]
图28示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1)和“who分级1973”erbb2mrna水平分层的nmibc患者的无复发存活(rfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0174]
图29示出了由erbb2 mrna水平(40.1+/-)分层的nmibc患者在滴注治疗后的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0175]
图30示出了由中等erbb2 mrna水平(40.1+/-)分层的nmibc患者在滴注治疗后的无进展存活(pfs；以月计)的kaplan meier分析。
[0176]
图31示出了在who评估为1、2和3级的膀胱癌肿瘤中erbb2(her2)、esr1、pgr或mki67(ki67)的mrna水平的散点图分析。
[0177]
图32示出了ta(pta)期和(pt1)期的膀胱癌肿瘤中erbb2(her2)、esr1、pgr或mki67(ki67)的mrna水平的散点图分析。
[0178]
从下面的详细描述，特别是结合附图考虑时，本发明的其它目的、优点和特征将变得显而易见。
具体实施方式
[0179]
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将受所附权利要求限制。除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
[0180]
在下方中，对本发明的某些要素进行说明。这些元素可以与具体的实施方案一起列出，然而，应当理解它们可以以任何方式和任何数目组合以产生另外的实施方案。不同描述的示例和优选实施方案不应理解为将本发明仅限于仅明确描述的实施方案。这种描述应理解为支持和包括将明确描述的实施方案与公开的和/或优选的任何数目的元素相组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，本技术中所描述的元素的任何排列和组合均应被认为已被本技术的说明书公开。例如，如本领域技术人员将清楚，本文公开的具体实施方案涉及特定基因的rna转录本的表达水平(高于或低于特定基因的rna转录本的设定表达阈值)和基于此的分子亚型可以组合以便可以鉴定给定肿瘤的分子亚型。
[0181]
优选地，本文所用的术语按“生物技术术语的多语种术语表(a multilingual glossary of biotechnological terms:(iupac建议))”，h.g.w.leuenberger,b.nagel,and h.eds.,helvetica chimica acta,ch-4010basel,switzerland,(1995)中描述的进行定义。
[0182]
除非另有所示，本发明的实施将采用本领域文献(参阅例如molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition，j.sambrook et al.eds.,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor 2000)中解释的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组dna技术的常规方法。
[0183]
除非上下文另有要求，在整个本说明书和所附的权利要求中，词语“包括(comprise)”及变型如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应理解为是指包含所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即，所述主题存在于所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组的内含物中。除非本文中另有所示或者明显与上下文相矛盾，在描述本发明的语境中(特别是在权利要求的语境中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”及“所述(the)”及类似的引用应理解为包括单数和复数。本文中的值的范围的列举仅试图用作分别提及落入所述范围中的每个单独的值的速记方法。除非本文中另有所示，每个单独的值都被并入说明书中，就像其在本文中被单独地列举。除非本文中另有所示或者明显与上下文相矛盾，本文中描述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文中提供的使用的任何和所有实例，或者示例性语言(例如，“如”)，均仅试图更好地说明本发明，并且不对另外要求保护的发明的范围施加限制。本说明书中的语言均不应解释为指示任何未要求保护的对本发明的实施至关重要的元素。
[0184]
在整个本说明书的语境中叙述了数个文件。本文中引用的文件中的每一个(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、厂商说明书、使用说明等)，无论是在上文还是下文中，均在此通过引用以其整体并入本文中。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明由于在先的发明先于这样的公开而没有权利。
[0185]
在一个方面，本发明涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本中至少一种选自人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(esr1)、孕激素受体(pgr)、增殖抗原ki-67(ki67)和racgtp酶激活蛋白1(racgap1)基因的rna转录本的表达水平。
[0186]
在一个实施方案中，确定选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1中的至少两种、三种或四种基因的rna转录本的表达水平。
[0187]
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0188]
(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；和
[0189]
(b)确定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平，
[0190]
其中，所述方法还包括确定肿瘤样本中至少一种选自ki67和racgap1基因的rna转录本的表达水平，其中，优选地，确定ki67的rna转录本的表达水平。
[0191]
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括以下步骤：
[0192]
(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；
[0193]
(b)确定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平；
[0194]
(c)确定肿瘤样本中pgr的rna转录本的表达水平。
[0195]
在一个优选的实施方案中，所述方案包括步骤：
[0196]
(d)确定肿瘤样本中至少一种选自k167和racgap1基因的rna转录本的表达水平，其中，特别优选的，确定ki67的rna转录本的表达水平。
[0197]
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0198]
(a)确定肿瘤样本中her2的rna转录本的表达水平；
[0199]
(b)测定肿瘤样本中esr1的rna转录本的表达水平；
[0200]
(c)确定肿瘤样本中pgr的rna转录本的表达水平；和
[0201]
(d)确定肿瘤样本中ki67的rna转录本的表达水平。
[0202]
在一个实施方案中，所述方法包括确定一种或多种另外的非参照基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。
[0203]
在一个实施方案中，所述方法不包括确定多于三种、两种或一种另外的非参照基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。
[0204]
在一个实施方案中，所述方法不包括确定其它非参照基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。换言之，未确定除her2、esr1、pgr和ki67和/或racgap1以及一种或多种参照基因以外的基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。在一个实施方案中，未确定除her2、esr1、pgr、ki67以及一种或多种参照基因以外的基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。在另一个实施方案中，未确定除her2、esr1和ki67和/或racgap1以及一种或多种参照基因以外之外的基因的表达水平，优选地，未确定除her2、esr1和ki67以及一种或多种参照基因以外的基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。在另一个实施方案中，未确定除her2、esr1和一种或多种参照基因以外的基因的表达水平，特别是其rna转录本的表达水平。
[0205]
在一个实施方案中，确定最多7个，优选6个，更优选5个，甚至更优选4个不同非参照基因的rna转录本的表达水平。
[0206]
在一个实施方案中，所述方法不包括任何其它诊断步骤，例如组织学分级或确定淋巴结状态。在一个实施方案中，所述方法不包括涉及免疫组织化学(ihc)的任何步骤。
[0207]
本文所用的术语“肿瘤”是指所有瘤细胞生长和增殖(无论其是为恶性还是良性的)，以及所有癌前和癌细胞及组织。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤为膀胱或尿道肿瘤，或来源于膀胱或尿道肿瘤(例如，通过转移)。本文所用的术语“膀胱(bladder)”是指膀胱(urinary bladder)。本文所用术语“癌症”包括以特征为异常调控的细胞生长、增殖、分化、粘附和/或转移的疾病。本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。术语“肿瘤”和“癌症”可在本文中互换使用。
[0208]
术语“转移”是指癌细胞从其原始位点向身体的另一部分的扩散。转移的形成是一个非常复杂的过程，其取决于恶性细胞与原肿瘤的脱离，细胞外基质的侵入，内皮基底膜对体腔和血管的渗入，以及经血液输送后向目标器官的渗透。最后，目标部位新肿瘤的生长取决于血管生成。肿瘤转移通常在去除原肿瘤后发生，因为肿瘤细胞或组分可能保留并产生转移潜能。
[0209]
术语“膀胱癌”涉及一种源于膀胱或尿道组织的癌症。在一个实施方案中，膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)或肌层浸润性膀胱癌(mibc)。有时，膀胱癌是转移性的。转移的常见部位包括骨、肝、肺和脑。膀胱癌发生在人类和其他哺乳动物中。虽然大多数人类病例发生在男性中，但女性也可能发生膀胱癌。通常，膀胱癌的治疗可以包括手术治疗、药
物治疗(例如免疫治疗和/或化疗和/或bcg免疫治疗)、放疗和/或靶向治疗。
[0210]
几乎所有的膀胱癌都从尿路上皮开始。当癌症生长进入或穿过膀胱中的其它层时，其便进入更高的分期，其中癌症分期是按照肿瘤在更深的组织层中浸润的进展来分类。分期定义如下：ta(pta)期：非侵入性乳头状癌；tis(ptis)：非侵入性平片癌(原位平片癌或cis)；tl(pt1)期：肿瘤已经从膀胱细胞表层进入到结缔组织下面，但仍被认为是nmibc；t2(pt2)期：肿瘤已经生长到肌层(mibc)；t3(pt3)期：肿瘤已经生长到穿过膀胱的肌层并进入包围它的脂肪组织层；t4(pt4)期：肿瘤已经扩散到脂肪组织之外并进入附近的器官或结构，其可能会生长进入到以下任何一种组织：前列腺间质(主要组织)、精囊、子宫、阴道、骨盆壁或腹壁。
[0211]
本文所用的术语“患者”是指任何生物体例如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和另一种哺乳动物，例如，诸如啮齿动物、兔或猴。所述啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或者南美栗鼠。优选地，所述患者是人。
[0212]
根据本发明，术语“rna转录本”包括并且优选涉及“mrna”，其指“信使rna”，并涉及编码肽或蛋白的“转录本”。mrna通常包含5'非翻译区(5'-utr)、蛋白或肽编码区，以及3'非翻译区(3-utr)。mrna在细胞和体外具有有限的半衰期。
[0213]
基因her2(也称为erbb2；位置：17ql2，注释：染色体：17；nc_000017.10；uniprot：p04626)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(egf)受体家族的成员。该基因的扩增和/或过表达已在诸多癌症中报导，包括乳腺和卵巢肿瘤。在ncbi数据库中，列出了her2的两种mrna变体，其编码两种蛋白版本。登录号nm_00l005862.1(受体酪氨酸蛋白激酶erbb-2同种型b)和nm_004448.2(受体酪氨酸蛋白激酶erbb-2同种型，一种前体)可以找到蛋白及mrna序列
[0214]
基因esr1(位置：6q25，注释：染色体6，nc_000006.11；uniprot：p03372)编码雌激素受体(er)，其是由对激素结合、dna结合和转录激活重要的几个结构域组成的配体激活的转录因子。已知雌激素受体参与病理过程，包括乳腺癌、子宫内膜癌和骨质疏松症。已知有4种esr1 mrna变体，其中转录本变体的5'utr不同和/或使用不同的启动子，但是每种变体编码相同的蛋白质。
[0215]
基因pgr(也称为pr；位置：11q22-q23，注释：染色体：11；nc_000011.9；uniprot：p06401)编码孕酮受体。类固醇激素如孕酮及其受体参与真核基因表达的调控且影响靶标组织的细胞增殖和分化。该基因在第一个外显子中使用两种不同的启动子和翻译起始位点，从而产生两种mrna同种型a和b。除了在同种型b的n端存在另外的165个氨基酸外，这两种同种型是相同的。
[0216]
基因ki67(ki67；位置：10q26.2，注释：染色体：10；nc_000010.10；uniprot：p46013)编码与细胞增殖相关且可能为细胞增殖所必需的核蛋白。已描述了两种mrna变体。相关的假基因存在于染色体10。
[0217]
基因racgap1(位置：12ql3.1，注释：染色体：12；nc_000012.11；uniprot：q9h0h5)编码racgtp酶激活蛋白1。已描述了3种剪接变体，其均编码相同的蛋白。racgap1是中心纺锤体蛋白(spindlin)复合物的一种组分，并且在调控生长相关的过程和分化中起着关键作用。
[0218]
如本文所用的术语“表达水平”是指特定基因(即her2、esr1、pgr或ki67)的表达，
从而产生转录本和/或蛋白质。根据本发明，在rna转录本水平，特别是mrna水平(转录水平)来确定表达水平，例如，通过测量转录的mrna(例如，通过northern印迹)，通过逆转录(rt)定量pcr或通过直接染色mrna(例如，通过原位杂交)。
[0219]
在一个实施方案中，术语“肿瘤样本”是指分离自癌症患者的肿瘤组织样本(例如，肿瘤的活组织切片或切除组织)。在优选的实施方案中，肿瘤组织样本为肿瘤组织样本的冷冻切片，或者为化学固定的肿瘤组织样本。在更优选的实施方案中，肿瘤组织样本为福尔马林固定且石蜡包埋的(ffpe)肿瘤组织样本。在一个实施方案中，肿瘤样本为提取自肿瘤组织样本的(总)rna。在特别优选的实施方案中，肿瘤样本为提取自ffpe肿瘤组织样本的(总)rna。本领域技术人员能够实施rna提取方案。例如，可以使用高纯度rna石蜡试剂盒(roche,basel,switzerland)，或者优选地，xtrakt rna提取试剂盒xl(stratifyer molecular pathology,cologne,germany)，提取来自ffpe肿瘤组织的5-10μm curl的总rna。还可以将待使用/检测的样本材料保存于冰箱中，并且在将各个样本材料解冻后于合适的时间点实施本发明的方法。可以在开始治疗性疗法之前，在治疗性疗法期间，和/或在治疗性疗法之后，即在给予癌症治疗之前、期间或之后，从癌症患者获取所述样本。
[0220]
如本文所用的术语“肿瘤的分子亚型”(或“癌症的分子亚型”)是指通过以不同的分子谱(例如基因表达谱)为特征的肿瘤亚型。
[0221]
在一个实施方案中，所述分子亚型选自her2-阳性、三阴性(也称为“基底样”)、管腔a型和管腔b型。术语“基底样”是指这样的事实，即这样的肿瘤与基底上皮细胞在基因表达方面具有一些相似性。术语“管腔型”来源于肿瘤与管腔上皮之间的基因表达的相似性。
[0222]
在一个实施方案中，确定her2，esr1和ki67的rna转录本的表达水平，并且分子亚型选自her2+、her2-/esr1+、her2-/esr1-/ki67+和her2-/esr1-ki67-。在一个实施方案中，所述分子亚型涉及mibc。
[0223]
分子亚型在临床结果与和治疗响应方面明显不同。术语“临床结果”被定义为疾病的临床结果，特别是在治疗之后的临床结果，例如症状的减轻或改善。在一个实施方案中，差的临床结果包括疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发生存活的相对减少或更少。关于癌症的术语“复发”包括在原发性疾病的相同部位和器官的肿瘤细胞的再次出现，癌症的初步诊断和治疗之后的甚至数年出现的转移，或在原发部位出现肿瘤细胞渗入到局部淋巴结。所述“远端复发”是指癌细胞扩散(转移)到超过局部淋巴结的身体远端部位(即另一器官)的情况。所述无复发存活通常被定义为从随机出现到首次复发、再发、继发癌症或死亡的时间。所述无进展存活是从某一日期(通常是治疗的第一天，或者是患者被招募进临床试验的日期)到达疾病“进展”日期或者患者因任何原因死亡日期的时间。术语“dss”和“css”(“癌症特异性存活”)可以在本文中互换使用。
[0224]
在一个实施方案中，所述管腔a型和管腔b型分子亚型与治疗后5年的疾病特异性存活的概率相关，该概率比与三阴性或her2阳性分子亚型相关的治疗后5年的疾病特异性存活的概率高至少10％，优选至少15％。在一个实施方案中所述，管腔a型和管腔b型分子亚型，优选地管腔a型分子亚型，与患者的阳性预后相关。在一个实施方案中，所述阳性预后包括疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选dss的概率升高。
[0225]
在一个实施方案中，
[0226]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(dss)的概率相关，该概率比与管腔b型分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％；
[0227]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性分子亚型或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少30％，优选至少35％；和/或
[0228]-管腔b型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％。
[0229]
在一个实施方案中，所述患者是男性患者，
[0230]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(dss)的概率相关，该概率比与管腔b型分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％；
[0231]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与her2阳性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少15％，优选至少20％；
[0232]-所述管腔a型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少30％，优选至少35％；
[0233]-所述管腔b型分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少15％，优选至少20％；和/或
[0234]-所述管腔her2阳性分子亚型与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的dss的概率高至少10％，优选至少15％。
[0235]
本文所用的术语“(治疗性)治疗”，特别是当与癌症治疗相关时，涉及涉及能够改善患者的健康状况和/或延长(增加)患者寿命的任何治疗。所述治疗能够消除癌症，减少患者肿瘤的大小或数目，阻止或减缓患者中癌症的发展，抑制或减缓患者新癌症的发展，降低患者中症状的频率或严重性，和/或减少当前患有或先前患有癌症的患者的复发。在一个实施方案中，术语“治疗”和“治疗性疗法”是指手术切除原发性肿瘤、化疗、抗激素治疗、放疗和免疫治疗/靶向治疗中的一种或多种。
[0236]
辅助治疗是除首要的、主要的或基本治疗外给予的治疗。用于癌症治疗的手术和复合治疗方案已使得该术语可主要用于描述辅助性癌症治疗。辅助治疗的实例为通常在手术后(术后)给予的另外的治疗(例如，化疗)，其中已去除了所有可检出的疾病，但是由于隐匿性疾病仍然存在统计学上的复发风险。新辅助治疗是在首要的、主要的或基本治疗之前给予的治疗(例如，术前化疗)。
[0237]
根据本发明，“确定rna转录本的表达水平”的步骤可包括：(i)测量rna转录本的表达水平，和(ii)分析所测量的rna转录本的表达水平(例如，通过与参照表达水平，如设定表达阈值相比较)，其中测量her2、esr1、pgr和ki67和/或racgap1的rna转录本的表达水平的顺序与分析所测量的her2、esr1、pgr和ki67和/或racgap1的rna转录本的表达水平的顺序无关。
[0238]
在一个实施方案中，确定rna转录本的表达水平包括确定rna转录本的表达水平是低于或还是高于rna转录本的设定表达阈值(＝二分法)。在表达水平等于设定表达阈值的情况下，所述表达水平被认为属于高于所述设定表达阈值的表达水平的组。因此，如本文所用的词语“高于设定表达阈值”包括高于设定表达阈值或等于设定表达阈值的表达水平。“高于设定表达阈值”的表达水平也可被称为“表达阳性的”，而“低于设定表达阈值”的表达
水平也可被称为“表达阴性的”。
[0239]
如本文所用，术语“设定rna转录本的表达阈值”可指从多个样本计算而来的平均阈值(简称：阈值(cut-off))，所述多个样本获自多名受试者，特别是患有癌症的受试者。为了获得阈值，受试者的数量可包括具有不同分子亚型肿瘤的受试者，例如具有her2阳性肿瘤的受试者，和/或具有三阴性肿瘤的受试者，和/或具有管腔a型肿瘤的受试者，和/或具有管腔b型肿瘤的受试者。所述阈值可代表rna转录本的量或浓度。在一个实施方案中，阈值以ct(循环阈值；也称为量化循环，cq)值给出(见下文)。在一个实施方案中，所述(相对)表达水平和表达阈值以40-δct或40-δδct值表示(见下文)。
[0240]
如本文所用的术语“受试者”涉及任何生物体如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和其他哺乳动物，例如，诸如啮齿动物、兔或猴的动物。所述啮齿动物可为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或南美粟鼠。优选地，所述受试者为人。在一个实施方案中，受试者为患有或疑似患有疾病，特别是癌症的受试者，在本文中也称为"患者"。为了确定平均阈值，检测了至少2名受试者，优选至少5名、至少10名、至少20名、至少30名、至少40名、至少50名、至少60名、至少70名、至少80名、至少90名、至少100名、至少200名、至少300名、至少400名、至少500名、至少600名、至少700名、至少800名、至少900名、至少1000名、至少1500名或至少2000名受试者。
[0241]
由于已使用本发明使用的基因标志物进行了各种临床研究，训练-验证环境下的一致研究将足以定义和验证用于将定量结果二分化为“表达阳性”或“表达阴性”的临床阈值(cut-off/threshold)。因此，在一个实施方案中，基于一项或多项在先临床研究来确定所述阈值。此外，可进行另外的临床研究来确立和验证阈值。可通过本领域已知的技术来确定/设定阈值。
[0242]
在一个实施方案中，基于训练群体中的临床-病理参数如ihc-ish，和/或总体存活(os)数据、疾病特异性(dss)和无进展存活(pfs)，通过划分检验(例如，sas software9.0.0)来确定/设定阈值。
[0243]
在一个实施方案中，按如下方式计算40-δct值：40-[患者样本各自的生物标志物(例如her2、esr1、pgr或ki67)的ct-患者样本的参照基因(例如calm2)的ct](＝计算方法1)。如果使用了多于一个参照基因，则按如下方式计算40-δct值：40-(患者样本各自的生物标志物的ct-患者样本的所选参照基因的平均ct)(＝计算方法2)。可选地，可以使用40-δδct值，其中可按如下方式计算40-δδct：δδct＝40-[(患者样本的ct生物标志物-参照样本的ct生物标志物)-(患者样本的ct参照基因-参照样本的ct参照基因)](＝计算方法3)；例如，40-δδct＝40-[(ct ki67患者样本-ct ki67参照样本)-(患者样本的ct calm2-参照样本的ct calm2)]。在一个实施方案中，将calm2用作参照基因。
[0244]
在另一实施方案中，生物标志物的相对表达水平以40-δδct值给出，其按如下方式计算：40-[(患者样本的ct生物标志物-患者样本的ct参照基因)-(对照样本的ct生物标志物-对照样本的ct参照基因)](＝计算方法4)；例如，40-δδct＝40-[(ct ki67患者样本-ct平均combref患者样本)-(ct ki67对照样本-ct平均combref对照样本)]。
[0245]
在一个实施方案中，ct为中值ct。参照基因的ct可为单个参照基因的ct，或者两种或更多种参照基因的平均ct(被称为平均combref)。优选地，在所有分析中使用相同的对照样本(也被称为校准物)，并产生相同的rt-qpcr或qpcr结果。在一个实施方案中，对照样本
为细胞系rna、体外转录的人工rna或dna寡核苷酸的等摩尔混合物，其代表具有恒定比率的生物标志物mrna或cdna或者生物标志物扩增子或生物标志物扩增子的一部分。在一个实施方案中，将calm2和/或b2m用作参照基因，并且将阳性对照(例如，体外转录的人工rna)用作对照样本(校准物)。
[0246]
在示例性的实施方案中，平均阈值以根据计算方法4的40-δδct值给出，其中在versant kpcr仪器ad模块(西门子)上，her2的平均阈值为40.90的40-δδct值，esr1的平均阈值为35.12的40-δδct值，pgr的平均阈值为31.24的40-δδct值，和/或ki67的平均阈值为40.12的40-δδct值。
[0247]
在另一示例性的实施方案中，平均阈值以根据计算方法4的40-δδct值给出，其中在lightcycler 480仪器ii(roche)上，her2的平均阈值为40.10的40-δδct值，esr1的平均阈值为36.12的40-δδct值，pgr的平均阈值为40.08的40-δδct值，和/或ki67的平均阈值为36.52、36.65、37.69或38.97的40-δδct值。
[0248]
在一个实施方案中，上述的ki67平均阈值为36.52的40-δδct值，其中3级肿瘤的40-δδct值等于或高于36.52，1级和2级肿瘤的40-δδct值低于36.52。在一个实施方案中，ki67的平均阈值为36.65的40-aact 3q值，其中等于或大于36.65的40-δδct值表示为t1分期或更高分期的肿瘤，低于36.65的40-δδct值表示为ta分期肿瘤。在一个实施方案中，ki67的平均阈值是37.69的40-δδct值，其中等于或高于37.69的40-δδct值表示癌症进展的风险增加。在一个实施方案中，ki67的平均阈值是38.97的40-δδct值，其中等于或高于38.97的40-δδct值表示癌症特异性死亡的风险增加。
[0249]
在另一个示例性实施方案中，平均阈值以根据计算方法4的40-δδct值给出，其中her2的平均阈值为40.10的40-δδct值。
[0250]
在一个实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)以随机顺序进行。在优选实施方案中，首先进行步骤(a)，即在步骤(b)、(c)和(d)之前进行。在一个实施方案中，步骤(d)在步骤(a)、(b)和(c)之后进行。在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行，步骤(b)在步骤(c)之前进行，步骤(c)在步骤(d)之前进行。
[0251]
在一个实施方案中，所述her2的rna转录本的表达水平高于her2的rna转录本的设定表达阈值，将肿瘤的分子亚型鉴定为her2阳性。
[0252]
在一个实施方案中，所述肿瘤的分子亚型是her2阳性，所述esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后，其中优选地，所述阳性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选rfs和/或pfs的概率升高。在一个实施方案中，所述肿瘤的分子亚型为her2阳性，所述esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值，表示阴性预后，其中优选地，所述阴性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选rfs和/或pfs的概率降低。在一个实施方案中，所述膀胱癌是nmibc。
[0253]
在一个实施方案中，esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值的her2阳性分子亚型与治疗后5年的rfs和/或pfs的概率相关，该概率比esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值的her2阳性分子亚型的治疗后5年的rfs和/或pfs的概率高至少20％，25％或30％。
[0254]
在一个实施方案中，
[0255]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0256]
esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0257]
pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0258]
ki67的rna转录本的表达水平低于或高于ki67的rna转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为三阴性。
[0259]
在一个实施方案中，
[0260]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0261]
esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0262]
pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0263]
ki67的rna转录本的表达水平高于ki67的rna转录本的设定表达阈值
[0264]
将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
[0265]
在一个实施方案中，
[0266]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0267]
esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0268]
pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0269]
ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
[0270]
将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔a(luminal a)型。
[0271]
在一个实施方案中，
[0272]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0273]
esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0274]
pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0275]
ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
[0276]
将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
[0277]
在一个实施方案中，
[0278]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0279]
esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0280]
pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0281]
ki67的rna转录本的表达水平高于ki67的rna转录本的设定表达阈值
[0282]
将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔b(luminal b)型。
[0283]
在一个实施方案中，
[0284]
her2的rna转录本的表达水平低于her2的rna转录本的设定表达阈值；
[0285]
esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值；
[0286]
pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值；和
[0287]
ki67的rna转录本的表达水平低于ki67的rna转录本的设定表达阈值
[0288]
将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔a(luminal a)型。
[0289]
在一个实施方案中，通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)测定rna转录本的表达水平。由于rna不能在pcr中直接扩增，因此必须使用酶——逆转录酶将其逆转录成cdna。为此，可以使用一步法rt-qpcr，其在同一反应中将逆转录反应与通过pcr dna扩增相结合。在
一步法rt-qpcr中，将rna模板混合至含有逆转录酶、dna聚合酶、引物和探针、dntp、盐和洗涤剂的反应混合物中。在pcr反应的第一步中，使用逆转录酶利用靶标特异性逆转录引物进行逆转录。然后，使用引物/探针和dna聚合酶对cdna进行扩增。
[0290]
在一个实施方案中，所述定量pcr为基于荧光的定量实时pcr。所述基于荧光的定量实时pcr包括使用荧光标记的探针。优选地，荧光标记的探针由标记有荧光报告子染料和猝灭子染料(＝双标记探针)的寡核苷酸组成。合适的荧光报告子和猝灭子染料/部分为本领域技术人员已知的，并且包括但不限于报告子染料/基团6-fam
tm
、j0e
tm
、以及猝灭子染料/基团dabcy i、tamra
tm
、bhq
tm-i、bhq
tm-2或bhq
tm-3。探针特异性产物的扩增造成探针的切割(＝扩增介导的探针置换)，从而产生报告子荧光的增加。反应中荧光的增加与靶标扩增物的增加成正比。通过使用lightcycler 480ii系统(roche)或versant kpcr系统(siemens)或mx3005p系统(agilent technologies)或用于检测来源于探针的荧光的等价实时仪器，可以实时测量荧光的增加。分析输出为每个靶标的ct值。通过pcr扩增循环的数目确定ct(循环阈值)值，其后探针的荧光信号超过某种背景信号，其中ct值为pcr扩增前样本中靶标分子的量的度量。优选地，使用合适的软件(例如，microsoft excel
tm
)或统计软件包(例如，sas9.0.0，graphpad prism4，genedata expressionist
tm
)进一步分析ct值。可基于具有已知靶标浓度的标准曲线的ct结果，将ct值转换为绝对靶标分子的量(例如，ng/μl或分子/μl)。可选地，可基于参照物将靶标量报告为x倍降低或增加的量(＝δct)。相比高
△
ct(较大差异)，低
△
ct值(较小差异)指示相对于参照物较高的靶标量。通过从固定的值(如pcr循环数，例如40)将其减去而重新计算δct是合适的。结果是与靶标量直接相关的值(较高值＝较高量)，且表示为40-δct值，其中一个整数是指加倍靶标量(例如，值34指示其为值33的量的两倍的量)。取决于所需的重复性和系统精度，可以嵌入多个参照物测定或者利用校准物的δct重新计算/标准化样本的
△
ct(1点校准；pfaffl(2001)，nucleic acid res.，29(9):e45)。通过针对特异性探针使用不同的荧光团，也可以在同一反应中进行多个不同的靶标测定。在pcr中，多个测定中的不同靶标被平行扩增，但使用不同的荧光发射分别进行检测。
[0291]
优选地，根据本发明所用的引物具有15至30个核苷酸的长度，特别是脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，所述引物经设计为：(1)对靶标mrna序列(如her2、esr1、pgr或ki67)具有特异性，(2)提供小于120bp(优选小于100bp)的扩增子大小，(3)检测所有已知的编码蛋白的剪接变体，(4)不包括已知的多态性(例如，单核苷酸多态性，snp)，(5)为mrna特异性的(考虑外显子/内含子；优选无dna扩增)，(6)无二聚化倾向，和/或(7)具有58℃至62℃的解链温度tm范围(优选地，tm为约60℃)。
[0292]
如本文所用，术语“核苷酸”包括天然(天然存在的)核苷酸，其包含选自腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)和尿嘧啶(u)的含氮碱基；选自核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖的糖；以及脱氧核糖(碱基和糖的组合，通常称为“核苷”以及1至3个磷酸基团，并且其可形成磷酸二酯核苷基间(internucleosidyl)连接。此外，如本文所用，“核苷酸”涉及核苷酸类似物。如本文所用，“核苷酸类似物”应指a、g、c、t或u的类似物(即，包含碱基a、g、c、t或u的核苷酸的类似物)，其可被dna或rna聚合酶(任一个都适用)识别并掺入至dna或rna的链(任一个都适用)中。这样的核苷酸类似物的实例包括但不限于，5-丙炔基嘧啶(即，
5-丙炔基-dttp和5-丙炔基-dctp)、7-去氮嘌呤(即，7-去氮-datp和7-去氮-dgtp)、氨基烯丙基-dntp、生物素-aa-dntp、2-氨基-datp、5-甲基-dctp、5-碘-dutp、5-溴-dutp、5-氟-dutp、m-甲基-dctp、2-硫代-dttp、4-硫代-dttp和α-硫代-dntp。还包括经标记的类似物，例如荧光类似物如deac-丙二胺(pda)-atp、基于吗啉代核苷酸类似物以及锁核酸(lna)类似物的类似物。
[0293]
根据本发明所用的与引物联合使用的词语“靶标mrna序列特异性的”意指在合适的温度和溶液离子强度条件，特别是pcr条件下，引物与靶标mrna序列的cdna杂交(即，退火)的能力。温度和溶液离子强度条件决定了杂交严格度。杂交需要两种核酸(即，引物和cdna)包含互补序列，尽管取决于杂交的严格度，但是碱基间可能有错配。在一个实施方案中，“合适的温度和溶液离子强度条件”是指pcr反应混合物中常用的58℃-62℃的温度范围(优选约60℃的温度)，和溶液离子强度。在一个实施方案中，如通过本领域已知的序列比较算法所确定的，引物的序列与靶标mrna序列的cdna的相应序列80％，优选85％，更优选90％，甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
[0294]
在一个实施方案中，所述引物在严格或中度严格的杂交条件下与靶标mrna序列的cdna杂交。如本文所定义的“严格的杂交条件”包括在68℃下，于5
×
ssc/5
×
denhardt’s溶液/1.0％sds中杂交，以及在室温下于0.2
×
ssc/0.1％sds中洗涤，或者包括本领域公认的其等同物(例如，这样的条件，在60℃，于2.5
×
ssc缓冲液中进行杂交，然后在37℃下于低缓冲剂浓度中数次洗涤的步骤，并保持稳定)。如本文所定义的“中等严格的杂交条件”包括在42℃下于3
×
ssc中洗涤，或者本领域公认的其等同物。可改变盐浓度和温度参数以实现鉴别引物和靶标核酸的最佳水平。关于这样的条件的指导可在本领域获取，如sambrook et al.eds.,2000,molecular cloning,a laboratory manual,3
rd edition,cold spring harbor press,cold spring harbor；and ausubel et al.,eds.,1995,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,n.y.)。
[0295]
在一个实施方案中，所述方法包括使用具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：1和2所示序列的至少10个连续核苷酸的esr1特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：4和5所示序列的至少10个连续核苷酸的her2特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：7和8所示序列的至少10个连续核苷酸的ki67特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：10和11所示序列的至少10个连续核苷酸的pgr特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：13和14所示序列的至少10个连续核苷酸的racgap1特异性引物。
[0296]
在一个实施方案中，所述方法包括使用包含或具有seq id no：1和2所示序列的esr1特异性引物，和/或包含或具有seq id no：4和5所示序列的her2特异性引物，和/或包含或具有seq id no：7和8所示序列的ki67特异性引物，和/或包含或具有seq id no：10和11所示序列的pgr特异性引物，和/或含或具有seq id no：13和14所示序列的racgap1特异性引物。
[0297]
优选地，根据本发明所用的探针具有20至35个核苷酸(特别是脱氧核糖核苷酸)的长度。在一个实施方案中，所述探针经设计为：(1)对靶标mrna序列(如her2、esr1、pgr或ki67)具有特异性，(2)不包含已知的多态性(例如，单核苷酸多态性，snp)，和/或(3)具有解链温度tm，其比相应引物的解链温度tm高约5℃至8℃。
[0298]
根据本发明所用的与探针联合使用的词语“靶标mrna序列特异性的”，意指在合适的温度和溶液离子强度条件下，特别是在pcr条件下，探针与靶标mrna序列(经扩增)的cdna杂交(即，退火)的能力。温度和溶液离子强度条件决定了杂交的严格度。杂交需要两种核酸(即，探针和cdna)包含互补序列，尽管取决于杂交的严格度，但是碱基间仍可能错配。在一个实施方案中，“合适的温度和溶液离子强度条件”是指pcr反应混合物中通常使用的63℃至70℃的温度范围和溶液离子强度。在一个实施方案中，如通过本领域已知的序列比较算法所确定的，探针的序列与靶标mrna序列的(经扩增的)cdna相应序列80％，优选85％，更优选90％，甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
[0299]
在一个实施方案中，所述探针在如上文所定义的严格或中等严格的杂交条件下与靶标mrna-序列(经扩增)的cdna杂交。
[0300]
在一个实施方案中，所述方法包括使用具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：3所示序列的至少15个连续核苷酸的esr1特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：6所示序列的至少15个连续核苷酸的her2特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：9所示序列的至少15个连续核苷酸的ki67特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：12所示序列的至少15个连续核苷酸的pgr特异性探针，和/或具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：15所示序列的至少15个连续核苷酸的racgap1特异性探针。在一个实施方案中，特异性探针包含上述序列的至少20个连续核苷酸。
[0301]
在一个实施方案中，所述方法包括使用包含或具有seq id no：3所示序列的esr1特异性探针，和/或包含或具有seq id no：6所示序列的her2特异性探针，和/或包含或具有seq id no：9所示序列的ki67特异性探针，和/或包含或具有seq id no：12所示序列的pgr特异性探针，和/或包含或具有seq id no：15所示序列的racgap1特异性探针。
[0302]
优选地，如上文定义的探针经过标记，例如选自荧光标记、荧光猝灭标记、发光标记、放射性标记、酶标记及其组合的标记。优选地，如上文定义的探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0303]
在一个实施方案中，将所述表达水平相对于肿瘤样本中一种或多种参照基因的(平均)表达水平标准化。如本文所用的术语“参照基因”意指这样的基因，其在被检测的系统即癌症中基于rna转录本/mrna水平具有相对恒定的表达水平。这样的基因可称为看家基因。在一个实施方案中，所述一种或多种参照基因选自calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh，优选为calm2和/或b2m。其它合适的参照基因是本领域技术人员已知的。
[0304]
如本文所用，calm2是指钙调素-2、磷酸化酶激酶、delta(ref.seq.(mrna):nm_001743)，b2m是指β-2微球蛋白(ref.seq.(mrna):nm_004048)，rpl37a是指60s核糖体蛋白l37a(ref.seq.(mrna):nm_000998)，gusb是指β-葡萄糖醛酸酶(ref.seq.(mrna):nm_000181)，hprt1是指次黄嘌呤-磷酸核糖-转移酶i(ref.seq.(mrna):nm_000194)，gapdh是指甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(ref.seq.(mrna):nm_002046)。
[0305]
本文所用的术语“非参照基因”是指在被检测的系统即癌症中基于rna转录本/mrna水平具有可变表达水平的基因，因此可以用于，例如，肿瘤/癌症的亚型分型和/或癌症进展的评估。在一个实施方案中，非参照基因选自肿瘤标志物，例如从现有技术已知的那些。根据本发明可使用的非参照基因可能是膀胱特异性或非膀胱特异性基因。
[0306]
另一个方面，本发明涉及一种将膀胱癌患者分层以进行肿瘤治疗的方法，所述方法包括，第一步，使用如上所述的体外方法鉴定癌症患者肿瘤的分子亚型，和第二步，基于通过所述体外方法鉴定的分子亚型选择肿瘤治疗方案。
[0307]
根据本发明的“将癌症患者分层以进行肿瘤治疗”包括将癌症患者分配至具有特定分子肿瘤亚型的患者组，这样随后允许医师选择最合适的肿瘤治疗方案。
[0308]
在一个实施方案中，除了使用如上所述的体外方法鉴定癌症患者肿瘤的分子亚型的步骤之外，所述将膀胱癌患者分层以进行肿瘤治疗的方法不包括任何其它诊断步骤，例如组织学分级或确定淋巴结状态。在一个实施方案中，所述方法不包括涉及免疫组织化学(ihc)的任何步骤。
[0309]
在一个实施方案中，所述分子亚型选自包括her2阳性、三阴性、管腔a型和管腔b型的组，优选地，选自由her2阳性、三阴性、管腔a型和管腔b型组成的组。
[0310]
在一个实施例中，
[0311]-所述分子亚型是her2阳性的，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术，和/或bcg滴注，和/或化疗，和/或抗her2治疗，和/或施用靶向免疫检查点抗体，和/或膀胱切除术后施用的抗her2治疗，和/或化疗；
[0312]-所述分子亚型是三阴性，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术，和/或bcg滴注，和/或化疗特别是新辅助化疗，和/或施用靶向免疫检查点抗体，和/或膀胱切除术；
[0313]-所述分子亚型是管腔a型，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术，和/或bcg滴注，和/或膀胱切除术，和/或化疗特别是辅助化学疗法，和/或(辅助)内分泌治疗；和/或
[0314]-所述分子亚型是管腔b型，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术，和/或bcg滴注，和/或内分泌治疗，和/或化疗特别是辅助化疗或围手术期化疗，和/或膀胱切除术。
[0315]
在一个实施例中，
[0316]-所述分子亚型是管腔a型，所述膀胱癌是nmibc，所述肿瘤治疗方案包括经尿道切除术(tur)，和/或卡介苗(bcg)滴注，优选tur和bcg滴注；
[0317]-所述分子亚型为管腔b型，所述膀胱癌为nmibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用辅助内分泌治疗的辅助化疗；
[0318]-所述分子亚型是her2阳性，所述膀胱癌是nmibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用(新)辅助内分泌治疗的(新)辅助化疗；
[0319]-所述分子亚型为三阴性，所述膀胱癌为nmibc，所述肿瘤治疗方案为新辅助化疗；
[0320]-所述分子亚型是管腔a型，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助内分泌治疗，优选辅助化疗或辅助内分泌治疗；
[0321]-所述分子亚型是管腔b型，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助内分泌治疗，优选辅助化疗和辅助内分泌治疗；
[0322]-所述分子亚型是her2阳性，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括(i)膀胱切除术和(ii)辅助化疗和/或辅助抗her2治疗，优选辅助化疗和辅助抗her2治疗；和/或
[0323]-所述分子亚型是三阴性，所述膀胱癌是mibc，所述肿瘤治疗方案包括联用或不联用随后的膀胱切除术的新辅助化疗。
[0324]
在一个实施方案中，所述分子亚型是her2阳性，所述膀胱癌优选为nmibc，所述肿瘤治疗方案包括抗her2治疗与内分泌治疗、激素治疗和/或化疗联用，所有这些可以是辅助
或新辅助治疗的形式。
[0325]
在另一个实施方案中，所述分子亚型为her2阳性，所述膀胱癌优选为nmibc，所述肿瘤治疗方案包括滴注治疗，例如bcg滴注。
[0326]
在一个实施方案中，所述分子亚型是管腔b型，所述膀胱癌优选为nmibc，所述肿瘤治疗方案包括滴注治疗(例如bcg滴注)，和/或新辅助/辅助化疗，优选与利用如他莫昔芬氟维司群(faslodex*)或芳香酶抑制剂的内分泌治疗联用。
[0327]
术语“抗her2治疗”的含义是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，抗her2治疗包括施用抗her2抗体，特别是单克隆抗her2抗体。单克隆抗her2抗体包括曲妥珠单抗和帕妥珠单抗其可单独或组合施用。曲妥珠单抗仅对her2过表达的癌症有效。其他单克隆抗体如厄妥索单抗(ertumaxomab)当前正在进行临床试验。可将抗her2抗体进一步修饰而包含治疗部分/试剂，如细胞毒性试剂、药物(例如，免疫抑制剂)、化疗剂或放射性核素或放射性同位素。因此，如果肿瘤治疗方案包括(或联用)抗her2治疗和化学疗法，则可以使用与化疗剂缀合的抗her2抗体。细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害且特别是能够杀伤细胞的任何试剂。实例包括美登素(mertansine)或emtansine(dm1)、紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二轻炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、鹅膏蕈碱、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及以上物质的类似物或同系物。在一个实施方案中，抗体缀合物是曲妥珠单抗(t)-dm1，例如曲妥珠单抗emtansine。其他合适的用于形成抗体缀合物的治疗试剂包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin)(以前称为道诺霉素(daunomycin))和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素d(dactinomycin)(以前称为放线菌素(actinomycin))、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(amc)，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。在优选的实施方案中，所述治疗剂为细胞毒性试剂或放射性毒性试剂。在另一实施方案中，所述治疗剂为免疫抑制剂。在又一实施方案中，所述治疗剂为gm-csf。在优选的实施方案中，所述治疗剂为阿霉素、顺铂、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒素a。其他治疗部分包括作用于mrna和/或蛋白合成的治疗部分。已知几种转录的抑制剂。例如，放线菌素d为转录抑制剂和dna损伤剂，其插入dna中并由此抑制转录的起始分期。夫拉平度(flavopiridol)靶向转录的延伸阶段。α-鹅膏蕈碱直接与rna聚合酶ii结合，这引起起始和延伸阶段的抑制。抗her2抗体也可与放射性同位素如碘-131、钇-90或铟-111相结合，从而产生细胞毒性放射性药物。施用抗her2抗体的替代是施用靶向her2的小化合物，如拉帕替尼(或)、阿伐他汀或那他啶。还可以使用内分泌治疗(也称为抗激素治疗)、激素治疗例如用孕激素，和/或化学疗法对抗her2治疗进行补充。
[0328]
化疗包括施用化疗剂。根据本发明的化疗剂包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化
合物。传统的化疗剂通过杀伤快速分裂(这是大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞来起作用。根据本发明，术语“化疗剂”包括紫杉烷类化合物、铂类化合物、核苷类似物、喜树碱类似物、蒽环类药物和蒽环类类似物、依托泊苷、博来霉素、长春瑞滨、环磷酰胺、抗代谢物、抗有丝分裂素和烷化剂，包括上文公开的联合抗体缀合物的试剂，以及以上物质的组合。根据本发明，提及化疗剂包括任何前药，例如所述试剂的酯、盐或衍生物如缀合物。实例为所述试剂与载体物质的缀合物，例如结合蛋白的紫杉醇，如结合白蛋白的紫杉醇。优选地，所述试剂的盐为药学上可接受的。化疗剂常常以组合形式给予，通常给予3-6个月。一种最常见的治疗为环磷酰胺加多柔比星(阿霉素；属于蒽环类抗生素和蒽环类抗生素类似物的组)，被称为ac。有时会添加紫杉烷药物如多西他赛，该方案则被称为cat；紫杉烷攻击癌细胞的微管。产生等价结果的另一常见的疗法为环磷酰胺、氨甲喋呤(其为抗代谢物)和氟尿嘧啶(其为核苷类似物(cmf))。另一标准的化疗疗法包括氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(fec)，其可补充有多西他赛或长春瑞滨。
[0329]
在一个实施方案中，所述分子亚型是管腔b型，所述肿瘤治疗方案包括施用化疗剂。在一个实施方案中，所述分子亚型是管腔b型，所述肿瘤治疗方案包括施用紫杉烷，优选多西紫杉醇。在一个实施方案中，紫杉烷与铂基化学疗法联用。
[0330]
内分泌疗法(抗激素治疗)通过施用能够阻止/下调雌激素和/或孕酮受体的药物如三苯氧胺或氟维司群或者可选地，利用芳香酶抑制剂如阿那曲唑或来曲唑阻止雌激素产生，从而靶向需要雌激素来持续生长的癌症。然而，芳香酶抑制剂仅适合于绝经后的患者。这是因为绝经后女性的活性芳香酶不同于绝经前女性中的普遍形式，因而这些试剂在抑制绝经前女性的主要芳香酶中无效。
[0331]
在另一方面，本发明涉及一种治疗膀胱癌的方法，该方法包括，第一步，使用上述方法将膀胱癌患者分层以进行肿瘤治疗，第二步，向膀胱癌患者提供选择的肿瘤治疗方案。所述肿瘤治疗方案是基于上述定义的体外方法鉴定的分子亚型选择的。
[0332]
所述方法的所述第一步和所述第二步在时间和/或地点上可以彼此分开进行。例如，第一步的结果是发布治疗指南，其用于在不同的时间和/或地点执行第二步。第二步也可能紧随第一步进行。
[0333]
在一个实施方案中，所述方法包括使用通过如上文所定义的体外方法获得的定量结果支持或反对辅助性/新辅助性化疗的直接决策制定。
[0334]
另一方面，本发明涉及一种治疗膀胱癌的方法，其中膀胱癌利用本文所定义的分子亚型进行特征描述，其中所述方法包括提供基于分子亚型选择的肿瘤治疗方案。
[0335]
在另一方面，本发明涉及利用逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)的试剂盒在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型中的用途，所述试剂盒包含至少一对选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1基因特异性的引物和和至少一种选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1基因特异性的探针。
[0336]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1的至少两种、三种或四种基因的特异性引物对和特异性探针。
[0337]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
[0338]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0339]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；和，可选地
[0340]-至少一对ki67特异性引物和至少一种ki67特异性探针；和/或
[0341]-至少一对racgap1特异性引物和至少一种racgap1特异性探针。
[0342]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
[0343]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0344]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；和
[0345]-至少一对ki67特异性引物和至少一种ki67特异性探针。
[0346]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含：
[0347]-至少一对pgr特异性引物和至少一种pgr特异性探针。
[0348]
在一个实施方案中，本发明涉及利用逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型中的用途，所述试剂盒包含：
[0349]-至少一对her2特异性引物和至少一种iier2特异性探针；
[0350]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；
[0351]-至少一对pgr特异性引物和至少一个pgr特异性探针；和
[0352]-至少一对ki67特异性引物和至少一个ki67特异性探针；和/或
[0353]-至少一对racgap1特异性引物和至少一种racgap1特异性探针。
[0354]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
[0355]-至少一对her2特异性引物和至少一种her2特异性探针；
[0356]-至少一对esr1特异性引物和至少一种esr1特异性探针；
[0357]-至少一对pgr特异性引物和至少一个pgr特异性探针；和
[0358]-至少一对ki67特异性引物和至少一个ki67特异性探针。
[0359]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一对参照基因特异性引物和至少一个参照基因特异性探针。
[0360]
在一个实施方案中，所述试剂盒不包含多于三种、两种或一种另外的非参照基因的特异引物和探针。
[0361]
在一个实施方案中，所述试剂盒不包含其它非参照基因的任何特异引物组和探针组。换言之，所述试剂盒中不包含除her2、esr1、pgrki67和/或racgap1以及一种或多种参照基因以外的基因的特异性的引物组和探针组。在一个实施方案中，所述试剂盒不包含除her2，esr1，pgr，ki67以及一种或多种参照基因以外的基因的特异性引物组和探针组。在另一个实施方案中，所述试剂盒不包含除her2，esr1和ki67和/或racgap1以及一种或多种参照基因以外之外的基因的特异性引物组和探针组。在另一个实施方案中，所述试剂盒不包含除her2，esr1和一种或多种参照基因以外的基因的特异性引物组和探针组。
[0362]
在一个实施方案中，所述试剂盒包含最多7个，优选6个，更优选5个，甚至更优选4个不同非参照基因组的特异性引物组和探针组。
[0363]
在一个实施方案中，所述定量pcr是实时荧光定量pcr。
[0364]
在一个实施方案中，所述探针的检测是基于扩增介导的探针转换。
[0365]
在一个实施方案中，所述探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0366]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含逆转录酶和dna聚合酶。在一个实施方案中，所述逆转录酶和dna聚合酶以酶混合物的形式提供，这允许一步法逆转录(rt)定量pcr
(rt-qpcr)。
[0367]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一对参照基因特异性引物和至少一种参照基因特异性探针。在一个实施方案中，所述参照基因是选自以下基因组中的一种或多种：calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh，优选地，所述参照基因为calm2和/或b2m。
[0368]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一个对照rna样本。在一个实施方案中，所述至少一个对照rna样本用作阳性对照和/或对照样本(校准物)，其中优选地，所述至少一个对照rna样本包含合成mrna(或部分)，其编码选自her2、esr1、pgr、ki67、racgap1和一种或多种参照基因中的一种或多种基因的一种或多种基因产物。在一个实施方案中，一种或多种参照基因选自包括calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh的组，优选地，所述参照基因为calm2和/或b2m。
[0369]
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含dna酶和dna酶反应缓冲液。
[0370]
优选地，所述引物和探针如上文结合本发明的体外方法所定义。
[0371]
在一个实施方案中，所述引物提供小于120bp，优选小于100bp的扩增子大小。
[0372]
在一个实施方案中，所述esr1特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：1和2所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述her2特异性的引物具有15至30核苷酸的长度且包含seq id no：4和5所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述ki67特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：7和8所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述pgr特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含seq id no：10和11所示序列的至少10个连续核苷酸，和/或所述racgap1特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度并且包含seq id no：13和14所示序列的至少10个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述特异性引物包含上述序列的至少15个连续核苷酸。
[0373]
在一个实施方案中，所述esr1特异性引物包含或具有seq id no：1和2所示序列，和/或所述her2特异性引物包含或具有seq id no：4和5所示序列，和/或ki67特异性引物包含或具有seq id no：7和8所示序列，和/或pgr特异性引物包含或具有seq id no：10和11所示序列，和/或racgap1特异性包含或具有seq id no：13和14所示序列。
[0374]
在一个实施方案中，所述esr1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：3所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述her2特异性的探针具有20至35核苷酸的长度且包含seq id no：6所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述ki67特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：9所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述pgr特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含seq id no：12所示序列的至少15个连续核苷酸，和/或所述racgap1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度并且包含seq id no：15所示序列的至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述特异性探针包含上述序列的至少20个连续核苷酸。
[0375]
在一个实施方案中，所述esr1特异性探针包含或具有seq id no：3所示序列，和/或her2特异性探针包含或具有seq id no：6所示序列，和/或ki67特异性探针包含或具有seq id no：9所示序列，和/或pgr特异性探针包含或具有seq id no：12所示序列，和/或racgap1特异性探针包含或具有seq id no：15所示序列。
[0376]
在一个实施方案中，如上所定义的探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0377]
如本文所用，术语“部件试剂盒(缩写为：试剂盒)”是指物件产品，其包含一个或多个容器，以及任选地，数据载体。所述一个或多个容器可装有一种或多种上述部件或试剂。试剂盒中可包含另外的容器，其含有例如，稀释剂、缓冲剂和其他试剂如dntp。所述数据载体可为非电子数据载体，例如图形数据载体如信息册、信息表、条形码或登录码，或者电子数据载体如软盘、光盘(cd)、数字通用光盘(dvd)、微芯片或另外的基于半导体的电子数据载体。所述登录码可允许登录数据库，例如互联网数据库、中央或分散数据库。所述数据载体可包含在本发明的方法中使用试剂盒的说明。所述数据载体可包含rna转录本如mrna的阈值或参照水平。在所述数据载体包含允许登录数据库的登录码的情况下，所述阈值或参照水平储存于该数据库中。另外，所述数据载体可包含关于如何实施本发明的方法的信息和说明。例如，试剂盒可以包含使用说明书(ifu)和/或指示本文所定义的分子亚型的指南和/或基于本文定义的分子亚型选择的肿瘤治疗方案。
[0378]
另一方面，本发明涉及如上文所定义的试剂盒。所述试剂盒在本文中可以称为bladdertyper试剂盒，特别地称为bladdertyper rt-qpcr试剂盒。
[0379]
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的试剂盒在评估膀胱癌患者的疾病特异性存活的概率和/或远端转移的风险中的用途，优选地，涉及在评估膀胱癌患者的疾病特异性存活的概率中的用途。
[0380]
在另一方面，本发明涉及如本文定义的引物对和/或如本文所定义的探针在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型中的用途，例如，在本文定义的方法中，其中所述引物对和/或探针是对于选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1的基因特异性的。
[0381]
在一个实施方案中，所述分子亚型如本文所定义。
[0382]
在一个实施方案中，所述探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0383]
在另一方面，本发明涉及如本文定义的引物对和/或如本文定义的探针在制备利用逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)的试剂盒在鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的试剂盒中的用途，其中所述引物对和/或探针是对于选自her2、esr1、pgr、ki67和racgap1的基因特异性的。
[0384]
在一个实施方案中，所述试剂盒如本文所定义。
[0385]
在一个实施方案中，所述分子亚型如本文所定义。
[0386]
在一个实施方案中，所述探针为双标记探针，其包含荧光报告基因和荧光猝灭基团。
[0387]
在另一方面，本发明涉及esr1的rna转录本的表达水平和/或pgr的rna转录本的表达水平作为膀胱癌预后生物标志物的用途。
[0388]
在一个实施方案中，将所述esr1的rna转录本的表达水平或所述pgr的rna转录本的表达水平用作单一预后生物标志物。
[0389]
本文所用的术语“预后生物标志物”是指在治疗或未治疗的患者中提供关于相应疾病(这里为膀胱癌)的可能病程信息的标志物。在一个实施方案中，预后包括疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和无远端复发存活的一种或多种。在一个实施方案中，预后包括dss。如本文所用，术语“单一预后生物标志物”意味着不使用或不分析预后的其它预后标志物。
[0390]
在一个实施方案中，
[0391]-esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后；和/或
[0392]-pgr的rna转录本的表达水平高于pgr的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后。
[0393]
在一个实施方案中，所述阳性预后后包括延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选dss的概率升高。
[0394]
在一个实施方案中，
[0395]-esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阴性预后；和/或
[0396]-pgr的rna转录本的表达水平低于pgr的rna转录本的设定表达阈值表示阴性预后。
[0397]
在一个实施方案中，所述阴性预后包括延长的疾病特异性存活(dss)、无复发存活存(rfs)、无进展存活(pfs)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选dss的概率降低。
[0398]
在一个实施方案中，esr1或pgr的rna转录本的表达水平分别高于esr1或pgr的rna转录本的设定表达阈值与治疗后10年的dss的概率相关，该概率比与esr1或pgr的rna转录本的表达水平分别低于esr1或pgr的rna转录本的设定表达阈值相关的治疗后10年的dss的概率高至少25％，优选至少30％，更优选至少35％。
[0399]
在一个实施方案中，所述膀胱癌，优选nmibc是her2阳性分子亚型，所述esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后，其中优选地，所述阳性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选rfs和/或pfs的概率升高。
[0400]
在一个实施方案中，所述膀胱癌，优选nmibc是her2阴性分子亚型，所述esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值表示阳性预后，其中优选地，所述阴性预后包括无复发存活(rfs)、无进展存活(pfs)、疾病特异性存活(dss)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选rfs和/或pfs的概率降低。
[0401]
在一个实施方案中，esr1的rna转录本的表达水平高于esr1的rna转录本的设定表达阈值与治疗后10年的rfs和/或pfs的概率相关，该概率比与esr1的rna转录本的表达水平低于esr1的rna转录本的设定表达阈值相关的治疗后10年的rfs和/或pfs的概率高至少25％、25％或30％。
[0402]
在另一方面，本发明涉及ki67的rna转录本的表达水平作为膀胱癌肿瘤分级和/或分期的生物标志物的用途，还涉及一种包括确定肿瘤样本中ki67的rna转录本的5q表达水平的膀胱癌肿瘤分级和/或分期方法，也涉及包含至少一对ki67特异性引物和至少一种ki67特异性探针的试剂盒在膀胱癌肿瘤分级和/或分期中的用途。
[0403]
本发明克服了基于免疫组化的现有诊断方法或更新的诊断方法的现行标准和状况的主要缺点。本发明提供可靠的肿瘤分子亚型分型，这可允许医师选择最合适的肿瘤治疗方案。由于四个标记物的优选顺序(优选首先确定her2的rna转录本的表达水平)，所以没
有将her2阳性错误分类为管腔a型和管腔b型，而如果分子亚型是基于分级聚类分析或相关性分，则通常会发生这种错误(perou et al.(2000),nature,406:747-752；tcga(cancer genome atlas network)(2012),nature,490:61-70)。此外，本发明不存在假阳性的错误分类，而根据perou等人的观点，her2阴性肿瘤的假阳性在这些病例中可能高达30％。
[0404]
本发明提供用于确定esr1和pgr的激素受体状态的方法和试剂盒，其有助于支持或反对在膀胱癌中使用辅助/新辅助内分泌治疗的直接决策制定，因为esr1和pgr的rna转录本的可靠检测可以对腔内与非腔内亚型进行区分。由于ihc方法的灵敏度，因此不可能利用免疫组织化学试剂，膀胱癌中与例如乳腺癌具有相对较低的esr1和pgr表达水平。男性nmibc中esr1和pgr的mrna表达水平的中值(esr1：39.96；pgr：30.96)低于在女性早期乳腺癌测到的mrna表达水平的中值(esr：140.14；pgr：36.37)观察到的mrna表达。这解释了为什么已经在乳腺癌达到检测极限的ihc方法不适合膀胱肿瘤特征描述。重要的是，在乳腺癌中，1％的激素受体阳性细胞可以将肿瘤完全定义为激素受体阳性，并显示该肿瘤对内分泌治疗敏感，而就算99％的肿瘤细胞基于ihc方法检测为“阴性”，在临床上也不可能确实就是激素受体阴性。
[0405]
本发明提供的的方法和试剂盒还有助于支持或反对在膀胱癌中使用辅助/新辅助化疗的直接决策制定，因为esr1，pgr和ki67的rna转录本的可靠检测可以对管腔a型和管腔b型进行区分，管腔b型肿瘤具有较高的疾病特异性死亡风险，因此利用经尿道切除术和bcg滴注进行治疗。
[0406]
本发明的方法和试剂盒也有助于支持或反对在膀胱癌中使用辅助/新辅助化疗的直接决策制定，因为鉴定为三阴性膀胱癌具有大约30％的癌症特异性死亡的风险。虽然管腔a型肿瘤(约占所有表层膀胱癌的30％)在8年后确实具有高达100％的优异存活率，但三阴性膀胱癌具有约30至40％疾病特异性死亡的风险。对于这些患者，主要通过经尿道切除术和bcg滴注的治疗仅将它们置于在这种升高的风险中，而化疗和/或立即膀胱切除术却具有较高的有效和/或治愈的概率。此外，三阴性膀胱癌对基于铂的化疗方案的敏感性证明可以进行新辅助化疗，这为获得经过较少极端性手术但具有优异长期存活的病理学完全反应提供了可能性。
[0407]
由于her2 rna转录本的测定，本发明的方法和试剂盒进一步有助于支持或反对在膀胱癌中使用联用或不联用辅助/新辅助化疗的抗her2治疗或抗her2食疗的直接决策制定。抗her2食疗联用化疗剂(例如通过使用抗her2抗体和化疗剂的缀合物)的治疗方案在表层膀胱癌中特别有吸引力，因为在经常性的患者为具有并发症(经常心脏性)的年老者的治疗情况下，化疗目前还没有被指示作为必须的治疗方案。
[0408]
本发明提供利用明显不同的疾病特异性存活率对管腔型和三阴性膀胱癌进行区分。虽然管腔b型患者具有疾病特异性死亡的风险，但是管腔a型患者的风险明显较低(如果存在，即使仅进行经尿道切除术和仅bcg滴注，即，不进行化疗和/或内分泌治疗)。因此，所述方法和试剂盒还可以用于评估患者疾病特异性死亡的风险。
[0409]
本发明的新颖之处不仅包括在膀胱癌中对基于mrna的乳腺癌生物标志物进行测定，还包括亚型的算法定义。不管esr1阳性如何，将pgr阳性包括进管腔a型从而扩大管腔a型分子亚型的群组，其显示出100％的8年后疾病特异性存活。
[0410]
本发明的所有这些新方面有助于本发明的基于rt-qpcr的方法和试剂盒的预后价
值。事实上，这些新颖之处为患者提供了更为准确和有意义的分子类型，特别是在非肌层浸润阶段，最终为膀胱癌中更多个体化治疗决策提供了预后工具。综合起来，本发明目前在很大程度上尚未满足临床需求，以便可靠，可重复和定量地评估所有膀胱癌患者中至少70％的治疗成功的预后和预测。
[0411]
通过以下实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。
[0412]
实施例
[0413]
实施例1：通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)测定mrna表达水平
[0414]
rna分离自石蜡包埋福尔马林固定的组织(＝ffpe组织)。更具体而言，使用提取试剂盒(biontech diagnosticd gmbh,mainz,germany)从5-10μm curl的ffpe肿瘤组织提取总rna，并利用calm2作为参照基因通过实时荧光rt-pcr进行质量。通常，每个合格的rna提取物取2.5μl(约50-100ng)利用如下所述qrt-pcr进行分析。
[0415]
对于通过定量rt-pcr方法详细分析的基因表达，使用了目标区域两侧的引物和中间杂交的荧光标记的探针。使用ncbi引物设计工具(www.ncbi.nlm.nih.go)挑选靶标特异性引物和探针。使用了rna特异性引物/探针序列，以能够通过定位穿过外显子/外显子边界的引物/探针序列来进行rna特异性测量。此外，挑选不与具有已知多态性(snp)的序列区域结合的引物/探针。在相同基因存在多种同种型的情况下，选择扩增所有相关的剪接变体的引物。通过常规pcr反应检查所有引物对的特异性。在进一步优化引物/探针后，表1中列出的引物和探针得到最佳结果。这些引物/探针优于现有技术已知的引物/探针，例如，在特异性和扩增效率方面。为了标准化样本rna的量，选择了基因calm2和b2m作为参照基因，因为它们在分析的样本中未被差异调控。
[0416][0417]
表1使用的引物和探针
[0418]
进行了验证实验，表明靶标和对照扩增的效率近似相等，这是通过比较δct法对基因表达进行相对定量的先决条件。为了进行生物样本中目标基因的表达分析，通过将两种特异性测定各自的引物/探针混合来制备4
×
双重测定-混合物。为了单独检测ct值，利用不同的荧光探针修饰测定探针。每份4x测定-混合物含有2μμ的未经修饰的正向和反向引物和1.2μμ的探针。对于每个反应，将提取自ffpe切片(参见上文)的2.5μl总rna与2.5μl测定-混合物，2.5μl酶-混合物和2.5μl水在96孔光反应板的一个孔中混合。根据厂商的说明书，利用versant kpcr循环仪(siemens)或light cycler480(roche)，在合适的条件(5min.50℃，1个循环；20sec.95℃，1个循环；15sec.95℃，1个循环；1min.60℃，40个循
环)下进行pcr反应的测量。在测量目前还未分类的生物样本对照之前，可将具有例如细胞系、健康对照样本、确定分子肿瘤亚型的样本的实验用于实验条件的标准化。
[0419]
实施例2：基于her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平的nmibc肿瘤的分子亚型
[0420]
为了本发明的目的，分析了经过标准治疗的pt1分期的82例nmibc患者的ffpe组织。使用商业rna提取试剂盒提取总rna，利用rna特异性taqma分析法进行一步法rt-qpcr来测量mrna的表达水平。以靶标基因的合成的体外转录本和两种管家基因(calm2，b2m)为对照，利用40-δδct方法对基因表达水平进行标准化以确定相对基因表达水平。通过无监督的聚类分析、划分检验、mann whitney检验和kaplan meier分析评估癌症特异性生存(css)来分析esr1和pgr的mrna表达水平的预后价值。随访时间的中位数为62个月。
[0421]
平均阈值(以40-aact值给出)如下：her2：40.9；esr1：35.12；pgr：31.24；ki67：36.12。her2的阈值基于以前的乳腺癌研究(koutras et al.(2008),brit.j.ofcane,99:1775-1785；pentheroudakis et al.(2009),breast cancer res treat 2009,116:131-143)中对268个样本的评估并应用于finher研究(比例风险模型验证)的方法确定的。calm2为参照基因。
[0422]
基于her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平(阴性/低表示比设定的表达阈值低的表达水平；阳性/增加表示比设定的表达阈值高的表达水平)，将肿瘤指定为分子亚型her2阳性(her2)、管腔a型(luma)、管腔b型(lumb)和三阴性(tnt)。如表2中所示，根据本发明的肿瘤分子亚型分型不同于基于现有技术方法的那些，如免疫组织化学(goldhirsch et al.(2011),annals of oncology,22:1736-1747,st
·
galien international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011)和仅分析3种基因标志物(sotiriou et al.(2009),n engl j med,360(8):790-800)。
[0423][0424]
表2肿瘤的分子亚型分型
[0425]
图2示出了本发明的分类方案，图3示出了在定量各个标记物的连续表达水平时使用的阈值。图4描述了当使用如本文所述的bladdertyper rt-qpcr试剂盒进行测定时，在非肌层浸润性膀胱癌群体中发现的表达水平频率。
[0426]
图5示出了管腔型(luminal a/b；lum)、her2阳性和三阴性非肌层浸润性膀胱癌的亚群区分和大小的划分。40％的肿瘤是三阴性膀胱癌，15％为her2阳性肿瘤，46％为管腔肿瘤。图6所示的kaplan meier分析表明，esr1，pgr和her2的mrna分析定义的管腔型肿瘤在5年后具有最佳的疾病特异性存活率(90％)，而her2阳性和三阴性膀胱癌显著较低且临床相关较低(分别为80％和70％)。
[0427]
图7描述了当使用如本文所述的bladdertyper rt-qpcr试剂盒进行测定时，包含了ki67 mrna水平是如何通过鉴定在经尿道切除术和bcg滴注治疗8年后展示100％疾病特异性的非肌层浸润管腔a型膀胱癌患，来提高结果预测的。所述管腔a型亚群包括了该群体中所有nmibc患者的28％，这与30％的膀胱癌患者可以通过标准治疗来治愈的预期相一致。相比之下，包含该群体中所有nmibc患者的18％的管腔b型患者由于具有更高的肿瘤增殖和由此导致侵袭性而具有稍高的死亡风险。
[0428]
这些通过图8的kaplan meier分析进一步示出。如本发明所定义的管腔a型亚型与8年后100％的疾病特异性存活率相关，而管腔b型患者经尿道切除术和bcg滴注(无进一步辅助或新辅助治疗)后5年内由于膀胱癌而死亡的风险增加20％。her2阳性和三阴性患者的疾病特异性存活率显著较低(8年后分别为70％和60％)。仅针对男性患者的结果在图9和图10中示出。
[0429]
图11示出了根据本发明的方法评估的膀胱癌中esr1 mrna单一标记物测定与预后的相关性。esr1阳性肿瘤的疾病特异性存活率显著高于esr1阴性肿瘤(p＝0.02)。
[0430]
图12示出了根据本发明的方法评估的膀胱癌中pgr mrna单一标记物测定与预后的相关性。pgr阳性肿瘤的疾病特异性存活率显著高于esr1阴性肿瘤(p＝0.02)。
[0431]
实施例3：基于her2、esr1、pgt和ki67的mrna表达水平的mibc肿瘤分子亚型分型
[0432]
利用rt-qpcr分析了肌层浸润性膀胱癌患者(mibc pt1-4；nx)的ffpe组织中的esr1、pgr、her2和ki67的mrna表达水平。
[0433]
对92例患者的ffpe组织(女性22个；男性70个；年龄中位值为67[范围45-97]；pt1/2期23个，pt3期48个，pt4期21个)的基因表达进行回溯分析，并利用rna特异性taqma分析法进行一步法rt-qpcr来测量mrna的表达水平。以靶标基因的合成的体外转录本和两种管家基因(calm2，b2m)为对照，利用40-δδct方法对基因表达水平进行标准化以确定相对基因表达水平。通过无监督的划分检验、mann whitney检验和kaplan meier分析评估疾病特异性生存(dss)来分析单个基因和分型算法的预后价值。
[0434]
与her2和ki67基因表达水平相比，esr1和pgr的mrna表达水平更高(中位值：esr1：34.8；pgr：33.9；ki67：37.7；her2：36.9)。17％的患者发现her2具有高mrna表达水平，这与其良好的预后(5年后57％vs 7％dss；p＝0.0001)相关。当使用乳腺癌划分的预定算法与esr1、pgr、her2和ki67的mrna表达的分类价值结合时，可以鉴定出以下亚型具有显著不同的存活率：her2+(5年后dss为7％)；her2-/esr1+(23％的患者，5年后dss为20％)；her2-/esr1-/ki67+(48％的患者，5年后dss为60％)；her2-/esr1-/ki67-(12％的患者，5年后dss为100％；p《0.0001)。结果如图13和图14所示。
[0435]
这些结果表明，通过分析esr1、pgr、her2和ki67的mrna表达水平(pgr在本例中是可选的)的分型方法可以鉴定在mibc中分子恶性与预后的相关性。这可能有助于鉴定高风险mibc患者和特别适合已经建立的靶向治疗的mibc患者。
[0436]
实施例4：使用esr1作为与her2阳性nmibc肿瘤相关的预后标志物
[0437]
利用rt-qpct分析了非肌层浸润性膀胱癌患者的ffpe组织的her2和esr1的mrna表达水平。
[0438]
图15至17示出了具有her2阳性nmibc肿瘤的膀胱癌患者在依赖esr1的mrna表达状态的无复发存活(rfs)和无进展存活(pfs)方面表现出显著差异。her2+/esr1+肿瘤患者的rfs和pfs延长的概率显著高于her2+/esr1-肿瘤患者。
[0439]
her2阳性肿瘤中esr1的mrna水平的预后价值多元独立于cis、分级1973、性别和肿瘤大小的预后价值(图18)。
[0440]
实施例5：nmibc肿瘤的分子亚型分型——与无复发存活(rfs)和无进展存活(pfs)的关联
[0441]
基于her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平(称为bladdertyper技术)对pt1期肿瘤样本(所有技术上有效的样本；n＝255)进行分类，结果为以下亚型分布：36.7％的tnbc，38.8％的管腔b型，11.3％的管腔a型和12.9％的erbb2(her2)阳性肿瘤(图19)。在验证群体中，通过kaplan meier生存分析(图20至23)确定，该分子亚型对于rfs和pfs是显着的(p值分别为0.0408和0.0010039)。如预期的那样，管腔a型肿瘤具有最佳rfs(也称为无疾病存活，dfs)和pfs，且在管腔a型分子亚型中，没有癌特异性死亡。相比之下，激素受体阳性管腔
b型肿瘤的预后比erbb2阳性和tnbc的肿瘤的预后差。因此，通过使用bladdertyper技术/算法，可以将38.8％的nmibc鉴定为管腔b型，其具有疾病复发和肿瘤进展的高风险，需要进行滴注治疗、新辅助/辅助化疗，而且其还是内分泌治疗策略的候选者，所述内分泌治疗例如使用他莫昔芬氟维司群或芳香酶抑制剂治疗。
[0442]
在整个群体中，her2的表达水平升高至40.1以上，pfs的差异是显著的(p＝0.0025；图25)，并且rfs之间的差异也趋向于显著(p＝0.0674；图24)，对于男性患者群体参见图26和27。对于pfs，升高的erbb2的mrna表达水平可以将who3级肿瘤中的5年后pfs只有60％的高风险组与随访5年后pfs高达90％的低风险组显著区分开(p＝0.0002)(见关于rfs的图28)。有趣的是，已经发现滴注治疗在erbb2mrna阴性的肿瘤中无效(随访5年后的pfs均为90％)，而在erbb2 mrna阳性肿瘤中提供约20％的pfs存活获益(随访5年后的pfs分别为80％和60％；p＝0.0375)(见图29和30)。因此，基于mrna的erbb2表达水平的升高(》40.1)(不能通过原位杂交方法或ihc方法鉴定)确实受益于滴注治疗。相比之下，表现出较低的erbb2 mrna表达水平的肿瘤不会从滴注治疗中受益，因此可以避免这些昂贵的、有毒的和影响生命质量(qol)的疗法。
[0443]
实施例6：肿瘤分级/分期和her2、esr1、pgr和ki67的mrna表达水平
[0444]
如图31所示，通过非参数mann-whitney检验确定，1级、2级和3级肿瘤之间的mki67(ki67)的mrna水平显著不同(两两之间p《0.0001)。通过spearman秩相关性分析确定，mki67的mrna水平与肿瘤分级也具有良好的相关性(r＝0.52；p《0.0001)。相反，erbb2(her2)、esr1和pgr的表达水平在不同分级没有显著差异。虽然erbb2和esr1与分级呈正相关(r＝0.12；p＝0.019和r＝0.15；p＝0.005)，但是pgr与分级呈负相关(r＝-0.16；p＝0.0003)。基于mann-whitney检验，erbb2和esr1在2级和3级肿瘤之间显著不同(p值分别为0.027和0.0006)，而pgr水平在1级和2级肿瘤之间显著不同(p＝0.0043)。
[0445]
63.1％的非肌层浸润性膀胱肿瘤显示出mki67(ki67)的mrna水平低于阈值被分类为pta期(图32)。通过非参数mann-whitney检验确定，pt1期肿瘤中的mki67的mrna水平显着高于pta期肿瘤的mki67的mrna水平(p《0.0001)。通过spearman秩相关性分析确定，mkj67的mrna水平与肿瘤分期也具有的相关性(r＝0.49；p《0.0001)。相反，erbb2(her2)、esr1和pgr在不同肿瘤分期没有显着差异。虽然erbb2与更高分期呈正相关(r＝0.16；p＝0.0028)，但是pgr与较高分期呈负相关(r＝-0.17；p＝0.001)。基于非参数mann-whitney检验，erbb2和pgr的表达水平在pta期和pt1期肿瘤中显著不同(p值分别为0.0088和0.0007)。