吡咯烷醇类化合物及其制备方法与应用

1.本发明涉及微生物农药技术领域，具体的说是一种从菌株aspergillus sp.tr15液体发酵产物中得到吡咯烷醇类化合物及其制备方法和在抑制植物病原菌、杀线虫方面的应用。


背景技术：

2.灰霉病菌(botrytis cinerea)能够危害葡萄、草莓及番茄等多种经济作物的田间生长及果实储藏，预估世界范围每年可造成超过100亿美元的经济损失。因此，灰霉病被列入世界十大植物真菌病害之一。例如：山东为我国最大的果蔬生产基地，由于果蔬大棚潮湿温暖的气候条件，造成灰霉病高发，每年均造成重大经济损失。截止目前，灰霉病的防治仍然以化学合成农药为主，例如：嘧菌酯与啶酰菌胺等。尽管化学合成农药能够较好防治灰霉病，但由于其相对单一的作用机制，导致菌株抗药性不断发展，由此陷入产生抗性——加大化学合成农药使用——抗性发展——农残过量及环境污染的恶性循环。除灰霉病外，果蔬大棚还面临南方根结线虫病的侵染，两者往往共同作用，既加重了经济损失，也大大增加了防治难度。
3.从微生物、植物等生物资源中寻找具有抑制植物病原菌或杀线虫的活性成分，已经成为开发“环境友好”新农药的重要来源。与化学合成农药相比，微生物次级代谢产物一般只含有碳、氢、氧及氮原子，具有易于发酵生产、毒性相对低且环境兼容性好等优点；此外，其防治植物病虫害往往具有“多点作用”的机制，已经成为对抗耐药病虫害的重要武器。
4.根据文献调研，吡咯烷醇类化合物具有抗肿瘤、免疫抑制、抗病毒及抗菌等多种作用。而本发明所涉及的两个吡咯烷醇类化合物为未见报道的新化合物，其结构骨架及脂肪长链取代基等结构特征区别于已知吡咯烷醇类化合物，且首次发现其对耐药灰霉病菌及南方根结线虫具有综合防治作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供吡咯烷醇类化合物及其制备方法与应用。
6.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
7.式(一)所示化合物1和化合物2以及两者在农药上可接受的盐或溶剂合物：
[0008][0009]
上述化合物的制备方法包括下列步骤：将菌株aspergillus sp.tr15接种至已灭
菌的液体培养基中，28℃静置发酵，发酵培养基经提取分离获得；所述菌株保藏编号为cctcc no：m 20211402。
[0010]
在上述方案的基础上，所述液体培养基为蔗糖2％，甘露醇2％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.3％，20％人工海水土豆浸出液配制，ph 7。
[0011]
优选地，所述发酵培养基的提取分离步骤为：
[0012]
(1)发酵培养基经乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
[0013]
(2)将上述发酵粗提物进行硅胶柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为100:1至1:1(v/v)的二氯甲烷-甲醇作为溶剂进行梯度洗脱；收集二氯甲烷-甲醇＝40:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以梯度为1:9至1:0(v/v)的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱；
[0014]
(3)收集甲醇-水＝3:7(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为55％甲醇-水，检测波长为210nm，流速为3ml/min，分别收集保留时间tr值为14.6min及19.0min的组分，即得式(一)所示化合物1和化合物2。
[0015]
吡咯烷醇类化合物在抑制植物病原菌及杀线虫中的应用。
[0016]
优选地，所述吡咯烷醇类化合物为权利要求1所述化合物中的至少一种；所述植物病原菌为灰霉病菌；所述线虫为南方根结线虫。
[0017]
本发明的化合物可以与其他药物组成组合物形式；该组合物包含式(一)所示化合物及农药上可接受的盐和/或溶剂合物作为活性成分，以及农药上可接受的载体，本发明化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们之间不产生拮抗作用。
[0018]
本文所用术语“本发明的化合物”表示以任何形式的式(一)化合物，即任何盐或非盐形式(例如，以游离酸或游离碱形式，或以其药学上可接受的盐形式)及其任何物理形式(例如，包括非固体形式(例如，液体或半固体形式)，和固体形式(例如，无定形或晶型，特定的多晶型形式，溶剂合物，包括水合物(例如，单-、二-和半-水合物))，及其多种形式的混合物。
[0019]
溶剂合物
[0020]
对于以晶体形式存在的本发明化合物或其盐的溶剂合物，本领域技术人员将理解可形成农药上可接受的溶剂合物，其中在结晶时溶剂分子被掺入晶格中。溶剂合物可包含非水溶剂例如乙醇、异丙醇、dmso、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯，或者它们可包含水作为溶剂(该溶剂被掺入晶格中)。其中水为溶剂(该溶剂被掺入晶格中)的溶剂合物通常称为“水合物”。水合物包含化学计量的水合物以及包含可变量水的组分。本发明包括该类溶剂合物。
[0021]
本发明所具有的优点：
[0022]
(1)本发明所涉及的两个吡咯烷醇类化合物为未见报道的新化合物，其结构骨架及脂肪长链取代基等结构特征区别于已知吡咯烷醇类化合物，且首次发现其对耐药灰霉病菌及南方根结线虫具有综合防治作用，可作为具有抑制植物病原菌与杀线虫活性的先导化合物或新农药成分。
[0023]
(2)式(一)所示化合物1和2能够显著抑制耐药灰霉病菌的菌丝生长，其ic
50
值分别为27.39与40.24μg/ml；其对耐药灰霉病菌的孢子萌发也具有显著抑制活性，ic
50
值分别为36.58与21.99μg/ml；上述活性优于常用化学合成杀菌剂嘧菌酯及啶酰菌胺。此外，式(一)所示化合物1和2对南方根结线虫也具有杀线虫活性，ld
50
值分别为311.5与162.0μg/ml。
[0024]
(3)本发明所涉及的两个吡咯烷醇类化合物由菌株aspergillus sp.tr15发酵产
生，易于进行规模发酵生产；其次，与化学合成农药相比，微生物次级代谢产物的环境兼容性好，防治植物病虫害往往也具有“多点作用”的机制，不易产生耐药性。
附图说明
[0025]
图1为式(一)所示化合物1的1h nmr谱图。
[0026]
图2为式(一)所示化合物1的
13
c nmr谱图。
[0027]
图3为式(一)所示化合物2的1h nmr谱图。
[0028]
图4为式(一)所示化合物2的
13
c nmr谱图。
[0029]
图5为式(一)所示化合物1与2对耐药灰霉病菌的抑制活性(滤纸片法)。
[0030]
图6为式(一)所示化合物1对耐药灰霉病菌的抑制活性(刃天青法)。
[0031]
图7为式(一)所示化合物2对耐药灰霉病菌的抑制活性(刃天青法)。
[0032]
生物保藏信息
[0033]
碱蓬来源曲霉菌tr15，命名为aspergillus sp.tr15，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20211402，保藏日期为2021年11月26日。
具体实施方式
[0034]
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0035]
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0036]
本发明从菌株aspergillus sp.tr15(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年11月26日，保藏号：cctcc no：m 20211402)液体发酵产物中分离得到如下的实施例中所指的吡咯烷醇类化合物，其中，化合物1和化合物2的结构如下(结构中的阿拉伯数字为碳原子的标位)：
[0037]
。
[0038]
实施例1：化合物1和化合物2的制备方法
[0039]
(1)菌株发酵培养
[0040]
切取生长于pda平板表面的菌株aspergillus sp.tr15(大小2
×
2cm)，接种至已灭菌的、盛有液体培养基的锥形瓶中，28℃静置发酵30天。所述液体培养基为蔗糖2％，甘露醇2％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.3％，20％人工海水土豆浸出液配制，ph 7。上述％均为重量％。
[0041]
发酵培养基经乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物。
[0042]
(2)化合物的制备
[0043]
将上述发酵粗提物进行硅胶柱层析(内径65mm，长度300mm，具砂板及抽咀的玻璃层析柱)，按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为100:1至1:1(v/v，下同)的二氯甲烷-甲醇作
为溶剂进行梯度洗脱；收集二氯甲烷-甲醇＝40:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析(内径30mm，长度600mm，具标准四氟节门的玻璃层析柱)，以梯度为1:9至1:0的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱。
[0044]
收集甲醇-水＝3:7(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为55％甲醇-水，检测波长为210nm，流速为3ml/min，分别收集保留时间tr值为14.6min及19.0min的组分，即得化合物1和化合物2。
[0045]
(3)化合物的结构鉴定
[0046]
表1.化合物1的1h(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)
[0047]
谱图数据(nmr测试所用溶剂：氘代氯仿)
[0048][0049][0050]
表2.化合物2的1h(500mhz)和
13
c nmr(125mhz)
[0051]
谱图数据(nmr测试所用溶剂：氘代氯仿)
[0052][0053][0054]
化合物1，无色粉末，hr-esi-ms m/z 316.2634[m+h]
+
，提示分子式为c
21h33
no，其1h-(附图1)和
13
c-nmr(附图2)数据见表1。
[0055]
化合物2，无色粉末，hr-esi-ms m/z 346.31027[m+h]
+
，提示分子式为c
23h39
no，其1h-(附图3)和
13
c-nmr(附图4)数据见表2。
[0056]
实施例2：抑菌活性测定
[0057]
抑菌活性采用滤纸片法进行定性测定、刃天青法进行定量测定。具体步骤如下：
[0058]
(1)供试植物病原菌
[0059]
耐药灰霉病菌zc-8，分离自山东诸城的蔬菜大棚，其对灰霉病常用化学合成杀菌剂：嘧菌酯及啶酰菌胺具有耐药性。
[0060]
(2)样品溶液的制备
[0061]
化合物1和化合物2以甲醇溶解，配制为20mg/ml的母液，用于滤纸片法测定。
[0062]
分别吸取一定体积的母液，以50％甲醇-水溶液稀释至1920、1440、960、480及240mg/l的不同浓度样品溶液，用于刃天青法测定。
[0063]
(3)滤纸片法
[0064]
以打孔器在耐药灰霉病菌zc-8的菌落边缘打取5mm左右的菌饼，将其置于9cm的pda平板中央位置。取2片5mm的无菌滤纸片分别对称放置于菌饼两侧，两者距离菌饼的距离均为约25mm，且处于同一直线上。
[0065]
吸取5μl的化合物1和化合物2母液至滤纸片(上样量为0.1mg)，以加入等体积的甲醇为对照。28℃、培养5d，观察化合物1和化合物2能否抑制耐药灰霉病菌zc-8的生长。
[0066]
(4)刃天青法
[0067]
实验方法参考如下文献：nat.commun.2020,11(01):1608:1-19；lett.appl.microbiol.2015,61:238-244，并根据供试植物病原菌做部分调整。具体步骤如下：
[0068]
将耐药灰霉病菌zc-8接种至pda平板，25℃、培养7-10d，无菌水收集孢子并调浓度至1
×
105个/ml。取96孔细胞培养板，每孔分别加入45μl液体培养基(35μl 1％葡萄糖无菌水溶液与10μl pdb溶液)、5μl不同浓度样品溶液及10μl孢子悬浮液，以加入等体积溶剂为阴性对照，以嘧菌酯与啶酰菌胺为阳性对照；而调零孔中加入等体积的液体培养基及样品溶液(1920mg/l)，不加入孢子悬浮液。
[0069]
每个浓度设置3个重复，震荡混匀后，适当密封96孔细胞培养板，25℃、摇床培养24h。加入刃天青染料(40μmol/l)，避光，25℃恒温培养至阴性对照的颜色变为浅粉色。酶标仪在波长570nm下测定各孔的吸光值。利用spss统计软件，计算抑菌率及ic
50
值。
[0070]
滤纸片法测定结果见图5。可见，化合物1与化合物2能够显著抑制耐药灰霉病菌zc-8的菌丝生长，并产生明显的抑菌带。刃天青法测定结果见图6、7及表3。可见，化合物1和2均能够显著抑制耐药灰霉病菌的菌丝生长，其ic
50
值分别为27.39与40.24μg/ml；其对耐药灰霉病菌的孢子萌发也具有显著抑制活性，ic
50
值分别为36.58与21.99μg/ml；上述活性优于常用化学合成杀菌剂嘧菌酯及啶酰菌胺。
[0071]
表3.刃天青法测定化合物1与化合物2对耐药灰霉病菌zc-8的抑制活性
[0072][0073]
实施例3：杀线虫活性测定
[0074]
以南方根结线虫为供试线虫，测定化合物1与化合物2的杀线虫活性，具体步骤如
下：
[0075]
(1)二龄线虫的孵化
[0076]
采集感染南方根结线虫的黄瓜根部病害，挑取线虫卵团，并以1％naclo溶液震荡分散4min。蒸馏水冲洗过200目筛，滤液转入培养皿中，28℃、黑暗条件孵化2-3d，收集二龄幼虫(j2s)，备用。
[0077]
(2)样品溶液的配制
[0078]
化合物1和化合物2以二甲基亚砜(dmso)溶解，配制为40mg/ml的母液，并以0.1％吐温80水溶液稀释得到不同浓度的样品溶液，备用。
[0079]
(3)杀线虫活性测定
[0080]
分别吸取200μl含40-60条j2s的南方根结线虫悬浮液及不同浓度的样品溶液至48孔板，以加入等体积的溶剂为阴性对照，每个浓度重复测定3次。将培养板28℃、震荡培养48h后，置于显微镜下观察，以细针刺激j2s无反应作为死亡标准，计算校正死亡率及ld
50
值。
[0081]
校正死亡率＝(对照组线虫存活率—处理组线虫存活率)
×
100％/对照组线虫存活率。
[0082]
结果表明，化合物1和2对南方根结线虫具有中等程度的杀线虫活性，ld
50
值分别为311.5与162.0μg/ml。
[0083]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。