一种DNA分子标记及利用其培育低直链淀粉含量优良食味水稻的方法与流程

一种dna分子标记及利用其培育低直链淀粉含量优良食味水稻的方法
技术领域
1.本发明属于水稻分子标记辅助选择育种技术领域，具体涉及一种dna分子标记及其应用、分子标记培育底直链淀粉含量优良食味水稻的方法。


背景技术：

2.直链淀粉含量是影响稻米食味品质的最重要因素，一般高直链淀粉含量的米饭食味品质较差，而具有中低直链淀粉含量的米饭适口性较好。在水稻食味品质改良研究中一个重要的途径是通过降低稻米直链淀粉含量来提高稻米的食味品质。近些年，在长三角地区具有低直链淀粉含量的稻米由于米饭软糯、口感较好，而广受消费者的欢迎，这一类稻米由于外观半透明，介于常规稻米和糯米之间而被称为“软米”或“半糯”米（王才林等. 江苏省优良食味粳稻的遗传与育种研究[j]. 遗传, 2021, 43, 442-448）。当前江苏地区主推的软米品种如“南粳”系列软米主要是通过选用本土高产品种与具有较低直链淀粉含量的“关东194”的品种直接或间接杂交选育而来，尽管该方法是培育具有优良食味水稻品种的有效策略，但这也导致了当前江苏软米品种的遗传资源单一，软米品种同质化较为严重。
[0003]
水稻胚乳中的直链淀粉主要由wx基因控制合成，wx基因的等位变异是造成水稻品种间直链淀粉淀粉含量丰富变异的主要原因。在众多的wx等位变异类型中，控制低直链淀粉含量的wx
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等位基因是江苏地区粳型软米品种所主要利用的等位基因，目前江苏省的软米类品种几乎都是利用的来自日本品种“关东194”的wx
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等位基因，这使得当前优良食味水稻品种培育的基因资源单一，亟需拓宽新的软米种质和基因资源（陈智慧，王芳权，许扬，王军，李文奇，范方军，仲维功，杨杰. 软米基因wx-mp在部分粳稻品种资源中的分布. 植物遗传资源学报 2019，20（4）：975-981）。而对于同样控制低直链淀粉含量的wx
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等位基因一般存在于云南等地区的籼稻中。事实上，除了wx基因外，研究还发现了一些能够通过直接调控wx基因表达而影响稻米直链淀粉含量的基因，如du1、du3、qac2和lowac1等，这些基因的突变均能显著降低稻米直链淀粉含量。从优良食味水稻的培育来看，这类水稻种质和基因都具有潜在的育种利用价值（huang et al., plant communications, 2021,2,100237）。然而从已经育成的具有低直链淀粉含量的优良食味水稻品种来看，尚没有明确信息表明这些基因成功用于新品种的培育。因此，从育种实际出发，亟需通过种质资源和新基因的挖掘来拓宽满足育种需求的新种质和新基因，并且利用相关育种技术的建立来实现新型优良食味水稻品种的选育。


技术实现要素：

[0004]
本发明针对上述现有技术存在的技术问题，为拓宽种质资源，建立培育低直链淀粉含量且食味优良水稻的途径，提供一种培育底直链淀粉含量优良食味水稻的方法，利用分子标记辅助选择技术培育具有低直链淀粉含量优良食味水稻，适用于具有低直链淀粉含量优良食味水稻的分子辅助选择育种。
[0005]
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种dna分子标记，与水稻低直链淀粉含量紧密连锁，所述dna分子标记包括引物lac6dc-f和lac6dc-r，所述lac6dc-f的核苷酸序列为seq id no. 1所示（gctcctagatactcttcttacctatccatg）；所述lac6dc-r的核苷酸序列为seq id no. 2（taatattaccatggggtcctga）所示。
[0006]
进一步的，所述dna分子标记可以在水稻低直链淀粉含量基因型鉴定中的应用。
[0007]
进一步的，所述dna分子标记可以在鉴定水稻种质资源中的应用。
[0008]
进一步的，所述dna分子标记在水稻优良食味品种培育中的应用。
[0009]
所述一种dna分子标记培育低直链淀粉含量优良食味水稻其方法为：通过常规杂交方法，以具有低直链淀粉含量且食味品质好的品种a为杂交供体，与常规品种b进行杂交并在杂交后代利用所述dna分子标记进行分子标记辅助选择；所述的分子标记辅助选择是从f2代开始，利用分子标记进行pcr扩增和凝胶电泳检测，选择具有品种a基因型的个体进一步自交或回交，从自交或回交后代中选择综合农艺性状优且带有品种a基因型单株种成系进行小区鉴定，获得性状稳定的新品系。
[0010]
优选的，所述具有低直链淀粉含量且食味品质好的品种a为武香粳113，所述常规品种b为粳稻高产品系p17。
[0011]
进一步的，一种培育低直链淀粉含量优良食味水稻的方法，通过常规杂交方法，以具有低直链淀粉含量且食味品质好的品种a为杂交供体，与常规品种b进行杂交并在杂交后代进行分子标记辅助选择培育具有较低直链淀粉含量且食味品质优良的新型软米。
[0012]
具体步骤如下：（1）杂交亲本的选择：选择具有低直链淀粉含量且品质优良的供体亲本a以及具有综合性状好的亲本b。其中亲本a为具有低直链淀粉含量的新型软米种质，其直链淀粉含量较“南粳”系列软米更低，食味打分值更高，并且能够用与其低直链淀粉含量紧密连锁的dcaps分子标记lac6dc进行鉴定，本方案中所选用的亲本a为武香粳113（审定编号为苏审稻20200040，公知公用材料），所用的亲本b为高产品系p17，其为申请单位自行选育的具有高产潜力且综合农艺性状好的品系。以上两个品种（品系）江苏（武进）水稻研究所可提供。
[0013]
（2）杂交与分子标记辅助选择：以具有低直链淀粉含量且食味品质好的品种a为杂交供体亲本，与常规品种b进行杂交并在杂交后代进行分子标记辅助选择。其中品种a可以是杂交的父本也可以是母本，本方案中品种a为母本，品种b为父本。所述的分子标记辅助选择是从杂交f2代开始，利用与低直链淀粉含量紧密连锁的dcaps分子标记进行pcr扩增和凝胶电泳检测，在f2代中选择具有品种a基因型的个体进一步自交或回交。本方案中所采用的是选择具有品种a基因型的纯合个体100个单株连续自交获得100个f4株系，从中选择50个综合性状好的株系进一步自交获得50个f5株系，利用分子标记lac6dc再次检测，确认所选株系携带品种a纯合基因型。收获f5株系后分析稻米外观和食味品质，从中选择10个具有较好食味品质的系进一步自交获得10个f6株系，并种成小区进行综合性状鉴定。从中获得5个性状稳定的新品系。
[0014]
步骤（1）所要求的杂交亲本a应该为能够通过分子标记检测判定为具有与低直链淀粉含量品种武香粳113同样基因型的品种。同时，所选用的亲本b应当具有区别于亲本a的基因型，其可以是粳稻也可以是籼稻，具体的选择根据育种研究需求进行。
[0015]
步骤（2）所要求的杂交和回交应根据育种需求，具体选择杂交还是回交以及杂交或回交的次数依据育种研究需求进行。
[0016]
步骤（2）所述的dcaps分子标记包括引物lac6dc-f和lac6dc-r，所述lac6dc-f的核苷酸序列为seq id no. 1：gctcctagatactcttcttacctatccatg；所述lac6dc-r的核苷酸序列为seq id no. 2：taatattaccatggggtcctga。
[0017]
步骤（2）所述的分子标记辅助选择的pcr检测方法为，利用引物对lac6dc-f和lac6dc-r进行pcr扩增。pcr扩增试剂采用普通pcr扩增试剂，具体pcr扩增体系依据实际公司说明书进行配置。本方案中pcr扩增体系为20μl，具体程序为95 ℃预变性5 min；随后用3步法扩增，包括95 ℃变性20 s；55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，经过35个循环后，72 ℃延伸2 min，随后10 ℃保持。吸取10μl pcr扩增产物进行3%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认pcr产物是否为207bp，产物是否特异。若无问题，吸取10μl pcr产物进行限制性内切酶ncoi酶切体系配制，具体的酶切体系和反应条件依据试剂公司说明书进行。对酶切后的pcr产物再次进行3%的琼脂糖凝胶电泳检测，其中具有品种a的条带为1条可以分辨的172bp和2条分别为24bp和11bp的条带（不可分辨，与引物带重叠）。具有非有品种a的条带为1条可以分辨的196bp和1条11bp的条带（不可分辨，与引物带重叠）。
[0018]
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种培育具有低直链淀粉含量且食味品质优良的软米方法。该方法绕开了现有软米培育过程中直接利用wx基因的方式，拓宽了可用种质和基因资源，同时也丰富了现有软米品种的种类。此外，基于优异性状紧密连锁标记的发展和利用，能够对目标性状进行精准导入和改良，实现低直链淀粉含量优异软米新品种的高效培育。
附图说明
[0019]
图1为具有不同直链淀粉含量稻米的外观（a）、直链淀粉含量和食味值比较数据（b-c）。
[0020]
图2为低直链淀粉含量调控位点的鉴定（a-b）和分子标记的连锁凝胶电泳分析数据（c）。
[0021]
图3为分子标记辅助选择流程示意（a）和杂交f2代株系的凝胶电泳检测（b）以及f6株系稻米的直链淀粉含量（c）和食味值（d）比较数据。
具体实施方式
[0022]
通过以下实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0023]
实施例1不同直链淀粉含量软米品种的品质分析为明确具有低直链淀粉含量软米的品质特性，收集了具有代表性的2个“南粳”系列软米品种南粳5055和南粳9108，2个发明申请单位自主选育的品种（品系）香软玉和武香粳113。此外，选用了发明申请单位自主选育的2个品种（品系）武运粳30和常12进行稻米基本品质比较分析。首先比较了不同品种稻米的外观品质，如图1a所示，在自然干燥情况下，常规粳稻品种武运粳30和常12精米外观相对透明，而4个软米的籽粒透明度均表现为软米
类稻米典型的半糯不透明表型，其中武香粳113和香软玉稻米的半糯表型较南粳5055和南粳9108更显著。进一步利用碘比色法测定了不同样品的直链淀粉含量（农业部标准ny147-88）。具体为准确称取50 mg米粉于50 ml试管中，用0.5 ml无水乙醇分散样品，再加入4.5 ml 1.0 mol/l的naoh溶液混匀并且煮沸20 min。待糊化的样品冷却后，用蒸馏水定容至50 ml。转移5 ml溶液至100 ml容量瓶中，加入1.0 ml 1.0 mol/l的乙酸溶液和1.5 ml 0.02％的碘液，定容至100 ml并摇匀，随后静置15 min。测定样品在620 nm的吸光值并利用样品计算待测样品的直链淀粉含量。检测结果如图1b所示，6个品种可以明显分为3种类型，其中武运粳30和常12稻米的ac在16%左右，南粳5055和南粳9108稻米ac在10%左右，而武香粳113和香软玉稻米的ac更低些，在8%左右，显著低于2个南粳类软米品种。随后，用米饭食味计（rcta-11a, 佐竹）测定了不同品种的米饭食味值，结果如图1c所示，不同品种稻米的食味值随着直链淀粉含量的下降呈现出显著增加的趋势，即具有更低直链淀粉含量的武香粳113和香软玉稻米的食味值最高，其次是常规软米南粳5055和南粳9108，而两个常规品种武运粳30和常12稻米食味值最低。用这些结果表明武香粳113和香软玉稻米的软米类型明显区别于当前南粳系列软米，暗示其为一类具有更低直链淀粉含量的新型软米。
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实施例2低直链淀粉含量调控位点的鉴定和连锁标记的发展为明确软米武香粳113低直链淀粉含量的遗传调控位点，通过选用常规粳稻高产品系p17与武香粳113进行杂交获得了f2群体。通过对f2群体的658个单株进行直链淀粉含量测定，发现f2群体中低直链淀粉含量植株为162株，高直链淀粉含量植株为168株，其它位于中间类型，说明该性状可能为单个隐性基因控制的性状为隐性遗传，符合孟德尔遗传的隐性单基因分离规律。随后，选取了极端高直链淀粉含量和极端低直链淀粉含量的单株各30个，用于混合分离法（bsa）进行深度测序和关联分析。基于分析，发现在水稻6号染色体存在2个连锁的单核苷酸多态性位点（snp），其均位于控制直链淀粉合成的wx基因下游（图2a-b）。随后，根据snp信息，开发了分子标记，对f2中的62个单株进行pcr检测分析，其中发现分子标记lac6dc（序列seq id no. 1和seq id no. 2）与f2植株中低直链淀粉含量性状紧密连锁（图2c）。基于此，把dcaps分子标记定义为能够鉴定具有武香粳113低直链淀粉含量的分子标记。利用该分子标记对香软玉dna进行检测后，发现其同样具有武香粳113的基因型。这说明该分子标记在辅助选择具有武香粳113品种低直链淀粉含量性状的杂交育种应用中具有重要价值。
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实施例3低直链淀粉含量优良食味软米的选育为培育具有高产潜力且优良食味品质的新品系，本方案利用实施例2中的武香粳113和高产品系p17进行连续杂交并进行分子标记辅助选择（mas）鉴定携带武香粳113基因型的个体。具体杂交流程见图3a。从杂交f2代开始，利用与低直链淀粉含量紧密连锁的dcaps分子标记lac6-dc（序列seq id no. 1和seq id no. 2）对不同植株进行pcr扩增和凝胶电泳检测（图3b），从f2代中选择具有武香粳113纯合基因型的单株连续自交，获得100个f4株系。根据f4株系的综合农艺性状，从中选择50个株系进一步自交获得50个f5株系，利用分子标记lac6-dc再次检测，确认所选株系携带武香粳113纯合基因型。收获f5株系后分析稻米外观和食味品质，从中选择10个具有较好食味品质的系进一步自交获得10个f6株系，
并种成小区进行综合性状鉴定，从中获得5个性状稳定的新品系。通过稻米直链淀粉含量测定和米饭食味值测定，所选5个株系稻米的直链淀粉含量均显著低于常规软米南粳5055，而其食味值均高于南粳5055（图3c-d）。基于上述数据，表明该方法能够快速有效的获得具有优良食味品质的新品系。
[0026]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，然而并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，可利用上述揭示的技术内容对本发明做出可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，在未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均落在本发明技术方案保护范围内。