技术特征：
1.一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，其特征在于：所述材料的准备包含有诱饵克隆pgbkt7-ga9-nosc-221、诱饵载体pgbkt7、文库酵母质粒pgadt7-多肽cdna、clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液；所述酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含以下步骤：s100、将诱饵质粒转化受体菌ah109中及其自激活检测；s101、文库筛选；s102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；s103、酵母阳性克隆回转验证。2.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述将诱饵质粒转化受体菌ah109中及其自激活检测包含酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，所述酵母转化方法包含以下步骤：s200、从ypda平板挑取ah109单菌落接种于ypda液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18-20h(过夜)，至od600>1.5；s201、转接ypda液体培养基，培养体积为50ml，使初始od600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至od600＝0.6；s202、离心收菌，室温，4000rpm，5min；s203、用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s204、用5ml 0.1m liac重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s205、用500ul 0.1m liac重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；s206、每个1.5ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；s207、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；s208、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s209、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。3.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述文库筛选是用含有pgbkt7-ga9-nosc-221诱饵质粒的ah109酵母菌株作为受体制备感受态，将文库质粒pgadt7-多肽cdna转入其中，涂sd-tlh筛选平板，所述文库筛选包含有文库dna转化方法，具体步骤如下：s300、从sd-t平板挑取单菌种接于液体sd-t培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；s301、转接于ypda液体500ml，使初始od600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至od600＝0.6；s302、离心收菌，室温，4000rpm，5min；s303、用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s304、用20ml 0.1m liac重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s305、用10ml 0.1m liac重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；s306、向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全
混匀；s307、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏1h；s308、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20ul培养物稀释后涂sd-tl平板，用于检测文库转化效率。其余涂sd-tlh，共20块；s309、30℃恒温培养3-7d，观察菌落生长，挑取长出的克隆单菌落，转接到sd-tlh筛选平板中继续培养3-5d。4.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述酵母阳性克隆鉴定及测序比对是为了鉴定sd-tlh平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行dna测序，并与genbank数据库中的序列进行blast比对分析。5.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述酵母阳性克隆回转验证是将划线于sd-tlh缺陷型平板上长出的阳性克隆分别用无菌水稀释后点至sd-tl、sd-tlh、sd-tlha和sd-tlha+x-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4d。6.根据权利要求1所述的一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，其特征在于：所述回转验证结果表明阳性对照能在sd-tl、sd-tlh、sd-tlha和sd-tlha+x-α-gal缺陷平板上生长，在sd-tlha+x-α-gal缺陷平板上显蓝色；阴性对照仅在sd-tl平板上能生长，而在其他平板都不能生长，筛选得到的31个酵母阳性克隆，31个阳性克隆能在sd-tl缺陷型平板上正常生长，31个阳性克隆能在sd-tlh缺陷型平板上生长，4个阳性克隆能在sd-tlha、sd-tlha+x-α-gal平板上生长，3个克隆能在sd-tlha+x-α-gal缺陷平板上显蓝色。
技术总结
本发明涉及发酵酵母筛选基因技术领域，且公开了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7-gA9-nosc-221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7-多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液。具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9-nosc-221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-gA9-nosc-221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。大大提高了研究的效率。
技术研发人员：朱也
受保护的技术使用者：南京瑞源生物技术有限公司
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/8/5