一种橙色假交替单胞菌菌株及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种橙色假交替单胞菌菌株。


背景技术：

2.近年来，我国的畜牧业取得了飞速的发展，畜牧业养殖规模日益扩大，养殖模式已经由家庭农场向规模化养殖场转换，畜牧业效益逐渐增加，为国民经济做出了突出贡献。随着养殖模式的集约化和规模化发展，养殖密度增加也为动物疫病防控带来新的挑战。细菌感染也是动物疫病中的重要组成部分，目前应对细菌感染主要依靠抗生素，但抗生素的使用又带来了严重的细菌耐药问题和动物性食品中和药物残留超标问题，阻碍了养殖业的健康可持续发展。尤其是随着禁抗令的颁布和实行，寻找好的抗生素替代品保障养殖安全变得尤为重要。
3.有益菌也称为益生菌，是来源于自然界中，具有益生作用的一类有益微生物的统称。从50多年前使用的乳酶生至今，有益菌微生态制剂已在畜牧养殖业中得到广泛应用，并已经成为减抗、替抗的较优选择。有益菌可以抑制病原菌生长、提高机体免疫力、提供机体所需营养物质等，可以实现防病治病、提高养殖效益的作用。而且随着养殖成本的日益增加，有益菌却具有成本低廉、适应性强、环境友好、使用简便等优点，更加成为养殖业健康管理的热点。
4.筛选针对某些特定病原菌的拮抗菌是获得有益菌的一种快速有效的手段，拮抗现象在自然界中普遍存在。利用有益菌来拮抗病原菌，不仅可以抑制病原菌的生长、降低其毒力因子的表达，而且可以改善动物的肠道环境，提高动物肠道健康水平，从而实现微生态调节的功效。细菌的信号系统是菌体之间信息交流的主要渠道，在调控细菌耐药性方面也发挥重要的作用。通过淬灭细胞间的信号分子，阻断病原菌之间的交流，可以有效干扰致病菌毒力因子的表达，降低病原菌的致病性。因此，开发既具有抑菌功能，又兼具淬灭病原菌信号系统的有益菌，有望成为控制细菌感染的新途径和新策略。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株橙色假交替单胞菌菌株及其应用，即一种可以抑制多种病原菌的生长、并具有密度感应淬灭活性的海洋源有益菌，可以作为潜在的有益菌为控制细菌性病害提供新的方案。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种橙色假交替单胞菌菌株，所述橙色假交替单胞菌菌株的保藏名称为橙色假交替单胞菌(pseudoalteromonas aurantia)dl1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.8687。
7.所述的一种橙色假交替单胞菌菌株在制备抑制动物病原菌中的应用。
8.进一步地说，所述病原菌为金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌或鳗弧菌。
9.一种由所述的橙色假交替单胞菌菌株制成的菌剂。
10.所述的一种橙色假交替单胞菌菌株制成得菌剂在制备饲料添加剂或动物养殖过程中的药品的应用。
11.本发明的有益效果：本发明的橙色假交替单胞菌dl1菌株可通过产生抑菌活性物质抑制多种常见病原菌，并可产生密度感应淬灭活性物质，降低或消除致病菌的毒力和致病性。
附图说明
12.图1是本发明基于16s rrna序列构建的菌株dl1系统发育树；
13.图2是本发明不同培养时间对菌株dl1生物量(图a)以及不同培养时间菌株dl1对vbi72产生抑菌圈的范围(图b)；
14.图3是本发明菌株dl1降解ahl类信号分子结果图。
具体实施方式
15.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
16.实施例1、一种橙色假交替单胞菌dl1菌株的筛选
17.选取五条健康斑节对虾，研磨后涂布于海洋细菌培养基2216e平板上，28℃恒温培养48h。随机挑取若干单菌落点种于涂有鳗弧菌的平板上，发现一个淡黄色的菌落周围有抑菌圈，随即挑取该单菌落进行继代培养，直至得到纯化菌株，编号为dl1。该菌种已在国家知识产权局中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏日期为2014年01月06日，保藏编号为cgmcc no.8687。
18.将菌株在2216e培养基中培养过夜，酚氯仿抽提法抽提菌株dl1的基因组dna，使用细菌通用引物，上游引物序列为27f(5')－agagtttgatcmtggctcag－(3')，下游引物序列为1492r(5')－ggttaccttgttacgactt－(3')，对其16s rrna基因序列进行pcr扩增。
19.具体采用的扩增体系为：2
×
taq master mix 12.5μl、正反向引物(10μm)各1μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl，总体系25μl；扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。
20.pcr产物经测序后在ncbi中进行序列比对，和橙色假交替单胞菌(pseudoalteromonas aurantia)ncimb 2033
t
的同源性最高，达到100％。采用mega5.1构建系统发育进化树(如图1所示)，其与pseudoalteromonas aurantia ncimb 2033
t
的亲缘关系最近，初步确定该菌株为假交替单胞菌属(pseudoalteromonas)。16s rrna序列如seq id no.1。
21.实施例2、橙色假交替单胞菌dl1能够降解ahl类信号分子
22.将菌株dl1接种于2216e液体培养基中，于摇床170rpm、28℃培养12h。
23.ahl报告菌紫色色杆菌cv026和vir24分别用于检测短链(c4～c8)和长链(c8～c14)，将其分别接种于lb液体培养基中，转速170rpm、28℃培养24h。
24.将培养好的dl1菌液、pipes缓冲液(1m，ph 6.7)以及ahl类信号分子(1mm)按比例为10：1：0.1混匀准备反应液，在28℃反应24h。
25.报告菌按3％接种量加入到温度为45℃左右的半固体lb培养基中，将其混匀后倒
至平板，待凝固后打孔后，将上述反应液取10μl加入检测孔，28℃培养观察蓝色或紫色晕圈的出现。信号分子采用ahl报告菌cvo26和vir24检测剩余的ahl分子，检测孔周围的紫色圈的深浅和无色代表着剩余的ahl分子，通过与阳性对照的结果发现，菌株dl1能够降解一部分短链c6-hsl分子和c8-hsl分子，对长链信号分子均具有较强的淬灭活性，说明通过淬灭病原菌分泌的信号分子可能是菌株dl1发挥有益作用的一种方式。具体结果如下表1和图3。
26.表1菌株dl1对不同信号分子的淬灭效果
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－不显紫色，+浅紫色，++较深紫色，+++深紫色。
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实施例3、橙色假交替单胞菌dl1菌株可以抑制常见病原菌
[0030]
采用琼脂扩散法检测菌株dl1对常见病原菌的抑制活性。21株病原菌均由本实验室分离保存，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、东方弧菌、短小芽孢杆菌、志贺氏杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、链球菌。分别接种于2216e和lb液体培养基，制成菌液。用生理盐水稀释至一定浓度后涂布于2216e和lb固体培养基上，挑取菌株dl1点种在平板上。培养24-96h后，观察菌株dl1周围是否有透明圈，并测量直径(如图2所示)。实验结果表明橙色假交替单胞菌dl1对这21株病原菌具有较为广泛的抑菌谱，对其中的21株病原菌均具有较好的抑制作用，抑菌圈直径在10mm以上。其中，尤其对金黄色葡萄球菌pmj4-1、金黄色葡萄球菌qtb1-1、金黄色葡萄球菌ttb2-1的拮抗作用最强，对金黄色葡萄球菌ttb1-1、鳗弧菌vib72、东方弧菌vib303拮抗作用次之，具体结果如表2所示。
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表2菌株dl1对不同病原菌的抑菌结果
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因此，本发明的橙色假交替单胞菌dl1菌株可以作为有效的抑菌制剂应用于动物养殖中，成为控制细菌感染的新方法。
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以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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