一种白僵菌微生物制剂及其应用的制作方法

1.本技术涉及微生物制剂技术领域，特别是涉及一种白僵菌微生物制剂及其应用。


背景技术：

2.地下害虫是指在土中生活，危害植物根部、近土表主茎及其他部位的害虫，主要有蝼蛄、蛴螬、地老虎、金针虫和地蛆等。这类害虫种类繁多，危害寄主广。例如蛀食幼苗的地下组织，例如幼苗的幼根、地下茎等，使幼苗不能出土或整苗枯死；地老虎等地下害虫也主要取食农作物的根、茎、块根、块茎、幼苗及生长点等，常常造成缺苗、断垄或植株生长不良。是严重为害农作物种植业的一大难题。
3.目前，对地下害虫的防治主要以化学药剂为主，例如毒死蜱、辛硫磷等能够快速有效的杀灭蛴螬。虽然具有速效性好的优点，但是，长期使用化学农药存在以下危害或隐患：第一，在对害虫进行杀伤毒害的同时，对害虫的“天敌”及传粉昆虫等益虫益鸟也有杀伤作用，长此以往会破坏自然界的生态平衡。第二，大量使用化学农药，使农药在环境中逐渐积累，尤其是在土壤中，产生农药污染环境问题。第三，农药被农作物吸收、进入动物体内，经过生物富集浓缩，使其毒性更大，这就不仅使得害虫的天敌更易受到毒害作用，而且会通过食物链威胁人类健康；农药残留也会直接影响食品安全，影响农作物的生产和贸易；第四，长期大量使用化学农药，容易使害虫产生极强的抗性，不仅影响害虫防治效果，而且会陷入不断增加化学农药使用剂量的恶性循环。目前，防止农药污染已成为当前世界上很多国家关切的重点，化学农药滥用相比于虫害会产生更为严重和深远的危害。
4.为了减少化学农药的使用，已有相关研究显示，可以采用微生物进行害虫的生物防治；但是，目前能够简便有效杀灭各种地下害虫的生防制剂十分缺乏。大力开发研制微生物农药尤其是基于丝状真菌的生防制剂势在必行，是解决化学农药3r问题(即抗性、再增猖獗和残留)的有效途径。


技术实现要素：

5.本技术的目的是提供一种新的白僵菌微生物制剂及其应用。
6.本技术采用了以下技术方案：
7.本技术的一方面公开了一种白僵菌微生物制剂，该白僵菌微生物制剂包括球孢白僵菌qjbb181和/或球孢白僵菌qjbb181活性物质。
8.需要说明的是，本技术从地老虎僵虫中分离获得一株球孢白僵菌(beauveria bassiana)，标记为球孢白僵菌qjbb181；其具有液固两相发酵生产效率高、产孢量大的优点，分生孢子的含量可达1000亿/克，对地老虎、蛴螬、贪夜蛾、斜纹夜蛾和金针虫等多种地下害虫具有较强的侵染活性。因此，本技术创造性的利用球孢白僵菌qjbb181和/或球孢白僵菌qjbb181活性物质制备地下害虫防治的白僵菌微生物制剂，能够有效的控制植物根部生长过程中的地下害虫。
9.还需要说明的是，本技术的发明人从地老虎僵虫的微生物菌群中分离获得了三株
具有不同功能的地下害虫防治的真菌菌株，对三株真菌菌株分别进行形态学和分子生物学鉴定，确定三株真菌菌株分别为金龟子绿僵菌qjma143、球孢白僵菌qjbb181和萊氏绿僵菌qjmr101。本技术主要是对球孢白僵菌qjbb181 进行保护，其他两个真菌菌株分别在其他的专利申请中进行保护。
10.本技术的一种实现方式中，白僵菌微生物制剂能够防治的地下害虫主要包括地老虎、蛴螬、贪夜蛾、斜纹夜蛾和金针虫中的至少一种。
11.可以理解，本技术的球孢白僵菌qjbb181分离自地老虎僵虫，必然对地老虎有良好的杀灭作用；在本技术的一种实现方式中，在金针虫严重的田间进行试验，发现本技术的球孢白僵菌qjbb181对金针虫也有良好的杀灭作用。此外，对几种危害严重的地下害虫，如蛴螬、贪夜蛾、斜纹夜蛾等也有杀灭作用。
12.本技术的一种实现方式中，球孢白僵菌qjbb181活性物质为球孢白僵菌 qjbb181的分生孢子和/或微菌核发酵产物。
13.可以理解，球孢白僵菌qjbb181活性物质是指施用后具有球孢白僵菌 qjbb181相同作用的物质，例如分生孢子、微菌核发酵产物等。
14.本技术的一种实现方式中，白僵菌微生物制剂还包括发酵基质。
15.需要说明的是，本技术的白僵菌微生物制剂，其主要的杀虫活性成分就是球孢白僵菌qjbb181和/或球孢白僵菌qjbb181活性物质；但是，为了更好的起到杀虫效果，本技术的微生物制剂不仅含有杀虫活性成分，还含有其它营养成份，例如发酵基质；一方面，起到诱杀地下害虫的作用；另一方面，真菌菌丝还能在农作物如烟草根系定植共生，促进作物产量和品质的提高，从而提高了农作物的经济效益。本技术的一种实现方式中，采用本技术的白僵菌微生物制剂进行杀虫，还能够促进烟苗生长，增加产量。
16.本技术的一种实现方式中，发酵基质为玉米淀粉、麦麸和米粉中的至少一种。
17.本技术的一种实现方式中，白僵菌微生物制剂中球孢白僵菌qjbb181和/或球孢白僵菌qjbb181活性物质与发酵基质的质量比为1:100～200。
18.需要说明的是，虽然，本技术的白僵菌微生物制剂可以用于多种地下害虫杀灭；但是，不排除还可以与其它生物或化学药物组合使用，只要不影响本技术白僵菌微生物制剂本身的杀虫活性即可。另外，本技术的白僵菌微生物制剂，也可以根据产品需求制成各种剂型，例如可湿性粉剂、粉剂或颗粒剂等，只要添加相应的辅助成份即可，在此不作具体限定。
19.本技术的另一方面公开了本技术的白僵菌微生物制剂在制备促进烟苗生长的制剂中的应用。
20.本技术的再一方面公开了本技术的白僵菌微生物制剂在制备预防烟苗死苗死棵的制剂中的应用。
21.需要说明的是，本技术研究发现，本技术的白僵菌微生物制剂不仅能够杀灭多种地下害虫，还能够对烟苗生长具有促进作用，具有预防死苗死棵的作用；因此，本技术的白僵菌微生物制剂能够制成促进烟苗生长的制剂或者预防烟苗死苗死棵的制剂。
22.本技术的再一方面公开了一种地下害虫的防治方法，包括将本技术的白僵菌微生物制剂与有机肥或细土混合，制成混合料，在移栽前的碎垡期或起垄期底施用于农作物，起到地下害虫防治的作用。
23.本技术的一种实现方式中，混合料的白僵菌微生物制剂与有机肥或细土的重量比
为1:10。
24.本技术的有益效果在于：
25.本技术的白僵菌微生物制剂，对地老虎、蛴螬、贪夜蛾、斜纹夜蛾和金针虫都具有杀灭作用，可有效预防和减轻地下害虫的发生，而且对烟苗等农作物生长具有促进作用，起到预防死苗死棵的作用。
26.本技术的球孢白僵菌qjbb181于2021年05月17日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center， cgmcc)，保藏号为：cgmcc no.22425。保藏单位地址为中国北京。
具体实施方式
27.下面通过具体实施例对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。
28.实施例
29.一、菌株分离
30.在无菌的条件下，用接种针蘸取僵虫表面的孢子粉，划线在直径为90mm 的1/4sday平板培养基上，或者用灭菌的镊子夹取僵虫轻轻且快速在培养基上震动几下。将平板放入26℃恒温培养箱中黑暗培养。3天后，挑取培养基上的菌落边缘菌丝尖端转移到新的90mm的1/4sday平板培养基上。重复操作2～3 次，即可得到纯化的球孢白僵菌(b.bassiana)。将纯化的菌株在26℃恒温培养箱中黑暗培养2周，分别进行菌株的短期保存和20％甘油冷冻长期保存操作。
31.二、菌株鉴定
32.1.形态特征鉴定
33.一株真菌qjbb181菌株在1/4sday平板培养基上25℃恒温培养14d后，观察菌落形态特征，并采用显微镜观察菌株的菌丝和孢子形态特征，结果如表1 所示。
34.表1白僵菌形态特征鉴定结果
35.菌株种类 球孢白僵菌qjbb181 菌落颜色 白色 菌落形态 棉絮状 基质色素 白色略带呈黄色 孢子色泽 白色 菌丝形态 分枝分隔 孢子形态 大部分为球形 孢子大小 2～2.5
×
1.8～2.8μm 36.2.qjbb181菌株的its序列分子鉴定
37.将qjbb181菌株在1/4sda液体培养基摇瓶培养72h(250rpm，26℃)，用四层灭菌滤布收集菌丝或菌体，液氮研磨成白色粉末后，采用dna试剂盒提取菌株的总dna。以总dna为模板，采用扩增真菌its序列的通用引物(tw81 和ab28)进行pcr，扩增菌株的its序列，扩增的its序列由上海生物公司进行测序。将该序列与ncbi数据库中已知序列进行blast比对，寻找同源性高于为98％，e值为0.0视为同一种。
38.其中，通用引物tw81为seq id no.1所示序列，ab28为seq id no.2所示序列。
39.seq id no.1：5
’‑
gtttccgtagctgaacctgc-3’40.seq id no.2：5
’‑
atatgcttaagttcagcgggt-3’41.根据qjbb181菌株生物学培养特性，结合its序列的比对结果，确定 qjbb181菌株为球孢白僵菌(beauveria bassiana)，标记为球孢白僵菌qjbb181。
42.三、球孢白僵菌qjbb181的杀虫活性测定
43.本例对获得的球孢白僵菌qjbb181进行杀虫活性测定，具体如下：
44.收集球孢白僵菌qjbb181菌株在1/4sday培养基上26℃培养12d的成熟分生孢子，以0.5％吐温-80的无菌水制备成1
×
108孢子/ml的孢子悬浮液，采用微量点滴器对3龄期的金针虫进行浸泡处理，每头20μl，处理时间30-40秒；设置3个处理，每重复10头试虫。接种后在室温25℃，湿度50-60％的条件下饲养，以未接菌的0.5％吐温-80溶液为空白对照。每24h检查1次死亡情况，连续观察12d记载死亡虫数目。
45.室内生测表明：球孢白僵菌qjbb181菌株对金针虫幼虫有较高的毒力，累计校正死亡率达到91.5％，通过几率值分析法得到的lt50为6.53d。
46.四、球孢白僵菌qjbb181液体-固相发酵生产孢子粉
47.将球孢白僵菌qjbb181菌株接种于固体1/4sday培养基上，在26℃恒温培养箱中黑暗培养2周。在无菌条件下，分别刮取成熟的分生孢子，在0.1％吐温-80无菌水中配制成1
×
108～1
×
109孢子/ml的悬液，取20ml接种于1l三角瓶中的200ml 1/4sda液体培养基中，保持温度为25～27℃，转速为250rpm，振荡培养72h作为液体种子液。
48.固相发酵物料为大米，按照大米:水的重量比2:1的比例均匀，浸泡大米1h 后，按照每袋300g的装填量将浸泡的大米装入50
×
40的聚乙烯发酵袋中，用线绳扎紧通气袋口，装入灭菌锅，于121℃下，灭菌30min。在超净工作台上自然冷却，再按照1:10(v/w)的接种比例接入液体母菌。混匀后单层放于25～27℃的培养架上，培养12～15天，将上述培养物收集，于室内吹干。再用200目的振荡筛收集孢子粉。将收集的分生孢子粉称重，qjbb181菌株的发酵产率为 0.6～0.7％。再通过血球计数板计数法，统计qjbb181菌株每克孢子粉的活孢数为1000亿/g，加热减量为8～10％。
49.五、球孢白僵菌诱导发酵生产微菌核
50.通过发酵配方、最适ph、温度、需氧量、光照等条件优化，确定菌株的诱导发酵工艺参数，进行了菌株微菌核液体发酵的300l～3000l发酵，并制定了球孢白僵菌微菌核发酵工艺流程：
51.从qjbb181菌株成熟分生孢子平板上切取2cm大小的菌饼，无菌接种到1l三角摇瓶150ml诱导培养液中，保持温度为25～27℃，转速为250rpm，培养56h作为三角瓶母菌菌种液。无菌接种到30l种子罐，采用1/4sda液体培养基，至发酵罐培养所需种子液的量，罐装系数：80％。
52.诱导发酵参数：罐压0.2cm2，通气量按v/v/min计为1:1，罐温27℃
±
1℃，培养时间为2-3d，菌丝量大，菌液变稠，有大量孢子形成，检测无杂菌污染，可作为一级接种体。
53.将合格的一级接种体按1:10的比例转接到300l发酵罐，调好罐压和进、排气阀，开动搅拌、进行诱导液体培养。
54.培养参数：搅拌速度200rpm，罐温27℃
±
1℃，罐内压力0.5kg/cm2，通气量按v/v/
min计为1:0.5～0.7。培养48～72h。培养规程中每隔8h抽样检查一次。
55.液体发酵至第6天，当60～80％菌丝体转化为微菌核时停止发酵。放出发酵液至消毒塑料桶内，按1:2～4比例添加干燥的硅藻土或其他填料。通过控温真空干燥混合填充料，使微菌核和米粉含水量低于13％。
56.六、球孢白僵菌生防菌剂的制备
57.将发酵的球孢白僵菌菌株的干孢子粉连同发酵基质一同粉粹后加入辅料，或一步发酵的微菌核按照1:3(v/w)添加硅藻土制成有效含量≥10亿孢子/g的白僵菌粉剂，依据需要也可以直接使用发酵物料(谷粒)作为的微生物制剂，可以根据产品需求制成各种剂型，例如粉剂、可湿性粉剂或颗粒剂等，只要添加相应的辅助成份即可。
58.七、球孢白僵菌生防菌剂防治烟田地老虎的田间试验
59.1.材料与方法
60.试验药剂：球孢白僵菌粉剂，当地常规处理药剂。地下害虫为草地贪夜蛾。
61.实验设计：随机选择15个10
×
10m的小区，每个小区间隔2m以上，防止小区间互相干扰，所有试验小区间的栽培管理条件基本保持一致。选择烟草金针虫常年发生的烤烟地，试验共设5个处理，3次重复，共15个小区，球孢白僵菌粉剂以及清水对照处理统一在烟田碎阀期至起垄期与肥料混匀后撒施，当地常规处理药剂在移栽环节与定根水同步施用。
62.处理一：球孢白僵菌粉剂，1kg/亩；
63.处理二：球孢白僵菌粉剂，2.5kg/亩；
64.处理三：球孢白僵菌粉剂，5kg/亩；
65.处理四：药剂对照ck1，本例采用毒死蜱作为药剂对照，用量为2.7kg/亩；
66.处理五：空白对照ck2，清水对照，即不施用任何药剂。
67.试验调查：烟苗移栽后3天、5天、10天各调查一次，共调查三次，调查每个小区断苗株数、被害株数和虫量，根据公式(1)、公式(2)计算被害株率和防治效果。同时，根据烟苗被害症状和田间害虫调查情况，记载有虫株数和害虫种类。
68.公式(1)：
[0069][0070]
公式(2)：
[0071][0072]
2.结果与分析
[0073]
球孢白僵菌粉剂不同用量处理区、常规药剂处理区和对照区烟苗移栽后3 天、5天、10天地下害虫为害情况调查统计结果如表2所示。
[0074]
表2不同处理剂量球孢白僵菌地下害虫绿色防控效果调查统计表
[0075][0076]
表2中，所列数值为平均值
±
标准误(n＝172)。数据采用student newman keuls法(s-n-k)统计分析，小写字母不同者表示在0.05水平差异显著，大写字母不同者表示在0.01水平差异显著。
[0077]
调查结果显示，试验区地下害虫为小地老虎。清水对照区烟苗移栽后3天即出现大量断苗和烟株受害情况，移栽后10天，空白对照区断苗率为10.72％，被害株率15.42％，有虫株率为18.75％，百株虫量为22.50头。
[0078]
常规药剂处理后地下害虫为害情况明显轻于对照，随时间推移无明显加重趋势。移栽后10天，处理区有虫株率约15.83％和百株虫量约19.58头与对照区无显著差异，但断苗率2.08％和被害株率为3.33％均显著低于对照(p＝0.01)，最终防效达78.38％。
[0079]
球孢白僵菌粉剂不同用量处理后，地下害虫为害程度明显轻于清水对照区，移栽后10天，白僵菌制剂1、2.5、5kg/亩不同用药量的断苗率分别为3.33％、 2.08％和1.67％；被害株率分别为7.5％、3.33％和2.92％；有虫株率分别为8.75％、 5.42％和5.00％；百株虫量分别为10.42、6.25、5.83头，均显著低于对照(p＝0.01)，其中2.5kg/亩和5kg/亩球孢白僵菌粉剂用量对地下害虫的控制效果最佳，移栽后10天防效分别为78.38％和81.08％，与常规药剂处理防效相当(p＝0.01)。
[0080]
试验结果显示在地下害虫发生严重区域，常规药剂处理和1kg/亩、2.5kg/ 亩和5kg/亩球孢白僵菌处理均能有效防控地下害虫，减少断苗率，提高保苗率。球孢白僵菌碎垡期或起垄时处理可有效降低田间缺苗死棵，在前期即对地下害虫起到良好的控制效果，其中2.5kg/亩和5kg/亩球孢白僵菌颗粒剂处理对地下害虫防控效果最佳，10天后断苗率分别为2.08％～1.67％；最终防效达81.08％。与常规药剂处理防效相近，且对烟苗生长无不良影响，而且具有明显的促进烟苗生长的作用。因此建议在碎阀期或起垄期条施球孢白僵菌
粉剂对地下害虫进行绿色防控，推荐使用剂量为2.5kg/亩。
[0081]
以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。