一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法

1.本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法。


背景技术：

2.丛枝菌根真菌又称am真菌，是一类分布最广泛的土壤真菌，能够与80％的陆生植物共生形成丛枝菌根，在这个共生系统中，am真菌从植物体获取脂类等有机物用于自身的生长代谢，同时协助植物从土壤中吸收水分和矿物质，这种菌根的形成可以扩大根系面积，增加植物对土壤养分的吸收能力，并提高养分利用效率，am真菌与植物之间的共生过程包括相互识别、物理接触和菌根形成，涉及到复杂的分子机制，植物中相关基因的变异可能会提高其与am真菌的共生效率。
3.oscerk1
dy
基因是从东乡野生稻中成功克隆的调控水稻与am真菌共生效率的关键基因，携带该基因的水稻能与am真菌高效共生，如参考文献[huang r l,li z,mao c,et al.natural variation at oscerk1regulates arbuscular mycorrhizal symbiosis in rice.new phytologist,2020,225(4):1762-1776]，该研究结果被专文点评为开辟了水稻与am真菌共生研究与育种利用的新领域，具有极大的实际应用价值[benoit l.an opportunity to breed rice for improve benefits from the arbuscular mycorrhizal symbiosis.newphytologist,2020,225(4):1404-1406]。
[0004]
而目前的籼稻oscerk1基因产生的菌根共生效应较弱，在水稻单倍型分析项目和水稻变异图的4660份栽培稻品种中，没有任何一个品种含有与oscerk1
dy
完全相同的单倍体型，导致在此方面缺乏高效育种方法，因此，本发明提出一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法以解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

[0005]
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法，该培育菌根高效共生籼型水稻的方法操作简便，实验无需特殊的试剂和耗材，单个样品的检测成本很低，有利于开展大规模标记辅助选择育种。
[0006]
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法，包括以下步骤：
[0007]
步骤一、针对控制菌根共生效率基因oscerk1启动子区域的序列特征设计分子标记；
[0008]
步骤二、设计引物gpc5-f和引物gpc5-r，并利用该组引物对样品目标片段进行pcr扩增，获得样品的扩增产物；
[0009]
步骤三、使用3％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，并根据产物片段长度读取oscerk1的基因型；
[0010]
步骤四、将oscerk1
dy
基因供体亲本与籼稻分别进行杂交、回交和自交，利用标记对
各世代单株进行检测，筛选出oscerk1
dy
基因纯合的稳定株系。
[0011]
进一步改进在于：所述步骤一中的分子标记位于水稻第8号染色体上oscerk1基因启动子区域内，所述步骤四中的籼稻在oscerk1基因上游652bp位置插入一段47bp的序列。
[0012]
进一步改进在于：所述步骤二中所用引物gpc5-f核苷酸序列如seq id no.1所示，位于oscerk1
dy
基因上游第718bp-699bp位置，引物gpc5-r核苷酸序列如seq id no.2所示，位于oscerk1
dy
基因上游第469bp-489bp位置。
[0013]
进一步改进在于：所述步骤四中oscerk1
dy
基因的纯合样品扩增产物为250bp条带，籼稻型样品为297bp条带，获得的杂合型样品同时出现250bp和297bp条带。
[0014]
进一步改进在于：所述步骤三中电泳检测操作具体为，先以0.5
×
tbe作为电泳缓冲液，取100ml加入至3g的琼脂糖中，煮沸使琼脂糖完全融化，凝胶自然冷却3min后倒入制胶槽中并插入梳齿，待凝胶完全冷却形成3％琼脂糖凝胶后拔出梳齿；每个扩增样品取10μl点样电泳，电泳电压为150v，时长为1h；电泳完成后用uvp凝胶成像系统即可观察结果。
[0015]
进一步改进在于：所述步骤四中杂交、回交和自交具体包括
[0016]
s1、以含有oscerk1
dy
基因的水稻单片段代换系cssl-dy为供体亲本，与作为受体亲本的籼稻材料杂交，获得16个f1代单株，并进行杂合型分子标记检测；
[0017]
s2、以杂交f1代为父本与籼稻材料回交，对bc1f1代单株进行分子标记检测，获得含有oscerk1
dy
基因的杂合型单株；
[0018]
s3、以杂合型bc1f1单株为父本与籼稻材料再次回交，对bc2f1代单株进行分子标记检测，获得13个bc2f1杂合型单株；
[0019]
s4、用13个bc2f1杂合型单株自交收种，然后种植bc2f2群体，并用分子标记从每个群体中筛选出3个oscerk1
dy
基因纯合的单株；
[0020]
s5、用筛选出的oscerk1
dy
基因纯合的单株进行自交，收种后种植bc2f3纯合株系；
[0021]
s6、对bc2f3株系的农艺性状进行考察，获得表现稳定的菌根高效共生籼稻品系。
[0022]
进一步改进在于：所述s1中杂合型单株分子标记检测结果全部为杂合型，所述s2中分子标记检测结果含有oscerk1
dy
基因的杂合型单株有8个，所述s6中最终获得了5份表现稳定的菌根高效共生籼稻品系，所述s1-s4中的分子标记检测均使用引物gpc5-f和引物gpc5-r进行扩增。
[0023]
本发明的有益效果为：本发明提供的分子标记可以用于将oscerk1
dy
基因向大部分籼稻品种的杂交转育，拓宽了oscerk1
dy
基因应用范围，同时提供的分子标记为共显性，能够在低世代筛选出oscerk1
dy
基因纯合单株，加快育种进程；
[0024]
本发明方法操作简便，实验无需特殊的试剂和耗材，单个样品的检测成本很低，有利于开展大规模标记辅助选择育种。
附图说明
[0025]
图1为本发明实施例一方法流程图。
[0026]
图2为本发明实施例一亲本材料的分子标记检测结果图。
[0027]
图3为本发明实施例一bc2f2群体的分子标记检测结果图。
[0028]
图4为本发明实施例一杂交、回交和自交流程图。
具体实施方式
[0029]
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
[0030]
实施例一
[0031]
根据图1-4所示，本实施例提供了一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法，包括以下步骤：
[0032]
步骤一、针对控制菌根共生效率基因oscerk1启动子区域的序列特征设计分子标记；
[0033]
分子标记位于水稻第8号染色体上oscerk1基因启动子区域内；
[0034]
步骤二、设计引物gpc5-f和引物gpc5-r，并利用该组引物对样品目标片段进行pcr扩增，获得样品的扩增产物；
[0035]
引物gpc5-f核苷酸序列如seq id no.1所示，位于oscerk1
dy
基因上游第718bp-699bp位置，引物gpc5-r核苷酸序列如seq id no.2所示，位于oscerk1
dy
基因上游第469bp-489bp位置；
[0036]
pcr反应体系包括10
×
buffer 1.0μl，2mm的dntp 1.0μl，10μm的左右引物各0.1μl，taqdna聚合酶1个u，水稻基因组dna 1.0μl，最后用去离子水补充至10μl；
[0037]
pcr反应程序包括95℃预变性7min，94℃变性40sec，55℃复性40sec，72℃延伸50sec，共35个循环，最后再72℃延伸8min。扩增结束后在每个样品中加入3μl gelred染料，4℃保存。
[0038]
步骤三、使用3％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，并根据产物片段长度读取oscerk1的基因型；
[0039]
电泳检测操作具体为，先以0.5
×
tbe作为电泳缓冲液，取100ml加入至3g的琼脂糖中，煮沸使琼脂糖完全融化，凝胶自然冷却3min后倒入制胶槽中并插入梳齿，待凝胶完全冷却形成3％琼脂糖凝胶后拔出梳齿；每个扩增样品取10μl点样电泳，电泳电压为150v，时长为1h；电泳完成后用uvp凝胶成像系统即可观察结果。
[0040]
亲本材料的检测结果如说明书附图2所示，其中1为东乡野生稻；2为中早35；3为f1代(东乡野生稻/中早35)；4～12为9个粳稻型材料，依次是cssl-dy、松粳19、中花11、三江6号、wj17、wj126、wj260、wj536和cjxj；13～21为9个籼稻型材料，依次是泰丰b、万象b、赣香占、美特占、黄华占、r9113、r310、r317和km102；m为2kbmarker；东乡野生稻和粳稻型材料的扩增产物为250bp条带，籼稻型材料的扩增产物为297bp条带，杂交f1代同时出现250bp和297bp条带。
[0041]
bc2f2群体的检测结果如说明书附图3所示，其中1为cssl-dy；2为泰丰b；3为f1代(泰丰b/cssl-dy)；4～24为21个bc2f2单株；m为2kb marker，cssl-dy的扩增产物为250bp条带，泰丰b的扩增产物为297bp条带，bc2f2群体分离出3种基因型。
[0042]
步骤四、将oscerk1
dy
基因供体亲本与籼稻分别进行杂交、回交和自交，利用标记对各世代单株进行检测，筛选出oscerk1
dy
基因纯合的稳定株系；
[0043]
籼稻在oscerk1基因上游652bp位置插入一段47bp的序列；
[0044]
步骤二中oscerk1
dy
基因的纯合样品扩增产物为250bp条带，籼稻型样品为297bp条带，获得的杂合型样品同时出现250bp和297bp条带；
[0045]
杂交、回交和自交具体包括
[0046]
s1、以含有oscerk1
dy
基因的水稻单片段代换系cssl-dy为供体亲本，与作为受体亲本的籼稻材料杂交，获得16个f1代单株，并进行杂合型分子标记检测，结果全部为杂合型；
[0047]
s2、以杂交f1代为父本与籼稻材料回交，对bc1f1代单株进行分子标记检测，获得8个含有oscerk1
dy
基因的杂合型单株；
[0048]
s3、以杂合型bc1f1单株为父本与籼稻材料再次回交，对bc2f1代单株进行分子标记检测，获得13个bc2f1杂合型单株；
[0049]
s4、用13个bc2f1杂合型单株自交收种，然后种植bc2f2群体，并用分子标记从每个群体中筛选出3个oscerk1
dy
基因纯合的单株；
[0050]
s5、用筛选出的oscerk1
dy
基因纯合的单株进行自交，收种后种植bc2f3纯合株系；
[0051]
s6、对bc2f3株系的农艺性状进行考察，获得了5份表现稳定的菌根高效共生籼稻品系，这些品系的生育期比受体亲本晚1～2天，植株更高，同时具有更大的生物量。
[0052]
s1-s4中的分子标记检测均使用引物gpc5-f和引物gpc5-r进行扩增。
[0053]
实施例二
[0054]
本实施例提供了一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法中对水稻叶片的dna进行抽提方法，待抽提dna的水稻亲本材料共21个，包括东乡野生稻、中早35、f1代(东乡野生稻/中早35)、9个粳稻型材料和9个籼稻型材料。cssl-dy是一个单片段代换系，遗传背景来自中早35，在oscerk1基因座位置的片段来自东乡野生稻，即含有纯合的oscerk1
dy
基因，待抽提dna的bc2f2单株21个。
[0055]
水稻dna抽提的具体为在水稻苗期取2cm长的叶片剪碎放在研钵中，加650μl的1.5
×
ctab并研磨均匀，用1.5ml离心管收集匀浆约500μl样品；将样品在65℃中温浴30min，期间颠倒混匀5次，然后加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇振荡5min；使用离心机以12000r/min离心10min，吸取400μl上清液转移到新的1.5ml离心管中；再加入2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混合后在-20℃中放置约30min；再次使用离心机以12000r/min离心15min，去除上清液；再加入500μl的75％乙醇洗涤，摇晃数次后12000r/min离心5min，去除上清液；最后将离心管静置晾干，然后加入100μl去离子水溶解dna。
[0056]
引物序列表
[0057]
引物名称引物核苷酸序列seq id no.gpc5-f5
’‑
cgatatgctcttgtgcgttc-3’1gpc5-r5
’‑
cgtgtgcttagccactaacct-3
’2[0058]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。