快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其提出一种快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法。


背景技术：

2.化学防治是农业害虫(螨)防控的主要方式，但其有效性受到害虫(螨)抗性发展迅速的严峻挑战。目前，害虫(螨)抗性监测分子标记的开发主要借助于已发现的抗性靶标突变位点，但长期的田间实际应用发现，这种单一的分子标记开发策略存在明显的缺陷：其一，基因突变本具有稀有性，杀虫(螨)剂靶标突变的发现常要借助室内高抗品系的筛选培养或田间高抗种群的采集，耗时长久，往往存在分子标记尚未得到开发而药剂本身已面临市场淘汰的困境。其二，靶标突变作为分子标记难以实现抗药性的早期监测，因为田间一旦检测到靶标突变，意味着害虫(螨)已经产生了较高的抗药性。其三，有大量研究表明田间害虫(螨)种群抗药性产生的初期，解毒酶活性的升高是常见的现象，而且一些害虫(螨)种群无靶标突变的情况下，仍会对农药产生高抗性。因此，抗药性相关解毒酶基因可开发为分子标记以解决单用靶标突变来监测抗药性所面临的困境。但如何快速、准确获得大量害虫(螨)抗药性相关的解毒酶基因(抗性分子标记)，以实现抗药性早期监测的方法仍不清楚。


技术实现要素：

3.1.要解决的技术问题
4.本发明的目的是为了解决现有技术中缺少快速、准确的获得大量抗性分子标记，无法实现对田间害虫(螨)抗药性早期监测的问题，而提出的快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法。
5.2.技术方案
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法，包括以下步骤：
8.步骤1：采集田间小型害虫或害螨种群，用供试杀虫(螨)剂进行生物测定，确定敏感基线；
9.田间采集害虫(螨)种群约2000头，用叶碟将其在恒温光照培养箱中饲养，用丙酮将待测杀虫(螨)剂原药先配成母液，然后用0.1％吐温80水溶液将其稀释至5个梯度浓度，挑取待测害虫(螨)30头于新鲜叶碟中，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1ml，每个浓度喷施3个叶碟，将受药叶碟放于恒温光照培养箱中培养24h，用体式显微镜观测害虫(螨)受药反应情况，记录死亡数，计算生物测定数据，获得敏感基线；
10.步骤2：根据敏感基线，用80％的致死浓度(lc
80
)对害虫(螨)种群进行1代筛选，提取亲本和f1代害虫(螨)总rna并进行转录组测序；
11.依据敏感基线，用清水将待测杀虫(螨)剂制剂稀释至lc
80
浓度，将1000头害虫(螨)转移至新鲜叶碟中，每个叶碟100头，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂1ml，将受药叶碟放于
恒温光照培养箱中培养24h，将存活的害虫(螨)挑入新鲜叶碟，待其产卵2d后移除，继续培养卵发育至成虫(螨)阶段，得到f1代；
12.挑取亲本与f1代害虫(螨)约200头于1.5ml无酶离心管中，液氮速冻后，加入500μl trizol，充分匀浆，向匀浆液中加入100μl氯仿，离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，将上清液小心转入新的无酶离心管中，加入异丙醇，将离心管放入高速冷冻离心机，12000rpm、4℃离心10min，弃去上清，沉淀用冰冷的75％乙醇洗一次；离心管放入冷冻离心机，8000rpm、4℃离心5min，弃上清，沉淀室温干燥3-5min，待其即将变透明时加入30μl无酶水进行溶解，吸取所得rna溶液5μl，其中2μl用于测浓度，3μl用于电泳检测其完整性，剩余25μl放入-80℃冰箱备用；
13.rna样品首先采用epicentre ribo-zero
tm
去除核糖体rna(rrna)，随后利用fragmentation buffer将rna碎片化；以打碎的rna片段为模板，用random hexamers引物合成cdna第一链，最后通过pcr法富集纯化cdna文库；
14.对双链cdna文库测序得到双末端reads(paired-end reads)的原始数据(raw data)后，使用perl脚本对原始数据进行优化，得到clean data，然后计算评估clean data的q30、gc含量等质控指标；
15.步骤3：以亲本为对照，分析筛选f1代害虫(螨)中上调表达的解毒酶基因，即获得抗性分子标记；
16.所得原始clean reads用tophat2软件将其与参考基因组序列比对分析，并组装转录本映射到参考基因组注释信息进行比较，得出已知功能注释基因和未经注释的新基因，获得基因的注释信息，随后采用deseq软件将f1代基因的表达量与亲本进行比较，筛选出上调表达的解毒酶基因，即抗性分子标记。
17.优选地，所述步骤1中用spss 22.0计算生物测定数据。
18.优选地，所述步骤2中氯仿上下剧烈摇晃15s，室温平衡5min。
19.优选地，所述步骤2中加入300μl异丙醇，上下颠倒30次，-20℃放置20min。
20.优选地，所述步骤2中以游离的datp、dutp、dctp、dgtp四种碱基为原料，利用rnase h和dna polymerase i合成cdna第二链，使用磁珠法(ampure xp beads)纯化cdna；对所得双链cdna进行末端修复，3’端加入碱基“a”，然后用ampure xp beads筛选片段，用特异性酶降解含碱基“u”的cdna第一链。
21.优选地，所述步骤2中采用illumina novaseq 6000测序平台对双链cdna文库测序。
22.优选地，所述步骤3中通过blastx软件将所有基因序列与nt、go、swiss-port、nr、kegg、cog和kog数据库序列信息进行比对，获得基因的注释信息。
23.3.有益效果
24.相比于现有技术，本发明的优点在于：
25.(1)快速且准确：本发明中，通过采集田间害虫(螨)种群，无需耗时长久的抗性品系培养过程，只用高剂量杀虫(螨)剂筛选1代，进行转录组测序分析即可获得大量的抗性分子标记，速度快、准确性高。
26.(2)成本低：本发明中，所涉及转录组测序成本低，且针对特定的害虫(螨)及农药只需要1次测序即可大量获得抗性分子标记。
27.(3)方法简单：本发明中，所涉及的技术方法均已成熟，且操作简便，在绝大多数实验室均可完成。
附图说明
28.图1为朱砂叶螨丁氟螨酯抗性品系(yn-cyr)三个抗性阶段上调表达基因的维恩图和表达趋势分析；
29.a为相对于敏感品系(yn-s)，yn-cyr在低、中、高三个抗性阶段过表达基因的维恩图分析；b为三个抗性阶段共同上调的1685个基因的表达趋势分析，左上角数字为表达趋势类型编号，所有基因可被分为20种表达趋势，其中只有第14-19种趋势均有统计学差异(p《0.05)，左下角数字表示趋势线对应的p值，n为基因数；
30.图2为yn-cyr品系三个抗性阶段过表达解毒酶基因的维恩图和趋势分析；
31.a、b、c和d分别为相对于yn-s品系，yn-cyr品系低、中、高三个抗性阶段过表达细胞色素p450(p450)基因、谷胱甘肽s转移酶基因(gst)、酯酶基因(cce)和abc转运蛋白基因(abc)的维恩图和趋势分析；分析目标皆为三个抗性阶段共同上调表达的基因，趋势图中左上角数字为表达趋势类型编号，所有基因可被分为20种表达趋势，图中只展示了有统计学差异(p《0.05)的表达趋势类型，左下角数字表示趋势线对应的p值，n为基因数；
32.图3为高剂量一次筛选和低剂量诱导所得上调解毒酶基因与yn-cyr三个抗性阶段上调解毒酶基因的维恩图分析；
33.a为yn-s品系高剂量一次筛选后，f1代(yn-s-s)上调解毒酶基因与yn-cyr三个抗性阶段上调解毒酶基因的维恩图分析；b为lc
20
丁氟螨酯诱导yn-s后上调解毒酶基因与yn-cyr三个抗性阶段上调解毒酶基因的维恩图分析。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
35.实施例1：
36.参照图1-3，快速获得田间小型害虫和害螨抗性分子标记的方法，包括以下步骤：
37.步骤1：采集田间小型害虫或害螨种群，用供试杀虫(螨)剂进行生物测定，确定敏感基线。
38.于云南昆明嵩明县的蔬菜田中采集朱砂叶螨雌成螨约2000头(该种群命名为yn-s)，寄主为豇豆苗；
39.选用灭菌后的海绵和培养皿，海绵尽量修剪平整，放置于培养皿中央，向培养皿中加水，待海绵吸饱水分且培养皿中水的体积约占其容积的1/2左右时即可，然后将一片直径为9cm的滤纸放置于海绵上，然后挑选大小合适，长势良好的新鲜豇豆叶片，去其叶尖，修剪平整，以页面朝下叶背朝上的方式平铺于滤纸上；
40.用0号毛笔轻挑3-5日龄雌成螨于制备好的叶碟上，每碟30头，共15碟；98％丁氟螨酯原药先用丙酮配置为100mg/l的母液，然后用0.1％的吐温80水溶液稀释至0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l和8mg/l共5个浓度梯度，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂，每碟喷药1ml，每个浓度喷施3个叶碟；
41.受药后的叶碟在恒温光照培养箱中放置24小时后在体式显微镜下观察死亡率，统计死亡与存活雌螨数量，将数据输入spss 22.0软件中计算朱砂叶螨对丁氟螨酯的敏感基线。
42.步骤2：根据敏感基线，用80％的致死浓度(lc
80
)对害虫(螨)种群进行1代筛选，提取亲本和f1代害虫(螨)总rna并进行转录组测序。
43.用0号毛笔将约1000头雌成螨转移至新鲜的叶碟中，每个叶碟约100头；依据步骤1中所得敏感基线，求得丁氟螨酯对朱砂叶螨80％的致死浓度(lc
80
)，用清水将20％丁氟螨酯悬浮剂稀释至lc
80
浓度压，用potter喷雾塔对叶碟喷施药剂，每碟喷药1ml，受药后的叶碟在恒温光照培养箱中放置24小时，在体式显微镜下观察并将存活的雌成螨挑于新的叶碟中，待其产卵2天后挑除产卵的雌成螨，培养卵至3-5日龄雌成螨阶段，获得f1代。
44.收集亲本和f1代雌成螨各200头于1.5ml无酶离心管中，液氮速冻，用研磨器迅速磨至粉状，离心管中加入500μl trizol，继续充分匀浆，向匀浆液中加入100μl氯仿，上下剧烈摇晃15s，室温平衡5min；离心管放入高速冷冻离心机，4℃，12000g，离心10min，将上清液小心转入新的无酶离心管中，加入300μl异丙醇，上下颠倒30次，-20℃放置20min；离心管于4℃，12000g，离心10min，弃去上清，沉淀用冰冷的乙醇(75％)洗一次，离心管4℃，8000g，离心5min，弃上清，沉淀室温干燥3-5min，待其即将变透明时加入30μl无酶水溶解，吸取所得rna溶液5μl，其中2μl用于测浓度，3μl用于电泳检测其完整性，剩余25μl放入-80℃冰箱备用；
45.所得rna样品首先采用epicentre ribo-zero
tm
去除核糖体rna(rrna)，随后利用fragmentation buffer将rna碎片化；以打碎的rna片段为模板，用random hexamers引物合成cdna第一链；进一步，以游离的datp、dutp、dctp、dgtp四种碱基为原料，利用rnase h和dna polymerase i合成cdna第二链，使用磁珠法(ampure xp beads)纯化cdna；对所得双链cdna进行末端修复，3’端加入碱基“a”，然后用ampure xp beads筛选片段，用特异性酶降解含碱基“u”的cdna第一链，最后通过pcr法富集纯化cdna文库。
46.采用illumina novaseq 6000测序平台对双链cdna文库测序得到双末端reads(paired-end reads)的原始数据(raw data)后，使用perl脚本对原始数据进行优化，得到clean data，然后计算评估clean data的q30、gc含量等质控指标。
47.步骤3：以亲本为对照，分析筛选f1代害虫(螨)中上调表达的解毒酶基因，即获得抗性分子标记。
48.所得原始clean reads用tophat2软件将其与二斑叶螨基因组(http://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/tetur)序列比对分析，并组装转录本映射到参考基因组注释信息进行比较，得出已知功能注释基因和未经注释的新基因，通过blastx软件将所有基因序列与nt、go、swiss-port、nr、kegg、cog和kog数据库序列信息进行比对，获得基因的注释信息，随后采用deseq软件将f1代基因的表达量与亲本进行比较，以上调倍数(fold change)》2倍且发现错误率(fdr《0.01)为筛选条件，筛选出上调表达的细胞色素p450基因、谷胱甘肽s转移酶基因、酯酶基因和abc转运蛋白基因，这些上调的解毒酶基因即为抗性分子标记。
49.本发明中，以新型杀螨剂丁氟螨酯为代表，通过对朱砂叶螨敏感品系(yn-s)抗性筛选，获得抗性品系(yn-cyr)并在其低(l，rr＝7.8倍)、中(m，rr＝17.3倍)和高(h，rr＝
86.1)三个抗性阶段进行转录组测序，结果发现，包括解毒代谢酶基因在内的大量基因在低水平抗性的时候就已经上调表达(图1和图2)，少数基因的表达水平会随着抗性倍数的不断升高而升高，这暗示着在抗性产生的早期阶段就存在着大量解毒酶基因的过表达(图2)，可以从中挖掘具有早期监测害虫(螨)抗性的分子标记。
50.本发明中，对比了两种快速获得分子标记的方法：1.不同浓度丁氟螨酯短时间(1.5小时)诱导；2.高剂量丁氟螨酯一代筛选(通过杀死80％害螨的药剂浓度喷药，将活下来的20％害螨进行培养，对亲本和f1代进行收集测序)。
51.利用本发明，根据敏感基线(表1)，对yn-s进行高剂量(lc
80
)丁氟螨酯1代筛选后可得到16条上调解毒酶基因(表2)，且这些基因在低抗阶段都上调表达(图3)，表明它们可作为分子标记来早期监测朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性，而丁氟螨酯短时间(1.5小时)药剂诱导仅仅获得了2条上调解毒酶基因，信息量太少，存在随机风险(表2)。
52.表1.朱砂叶螨对丁氟螨酯的敏感基线
[0053][0054]
表2.不用浓度丁氟螨酯短期诱导和高剂量一代筛选所获得的上调解毒酶信息
[0055]
[0056][0057]
注：
“‑”
表明表达水平无显著性变化。
[0058]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。