人基因CHD1位点突变和检测CDH1基因的多个位点突变的试剂盒的制作方法

人基因chd1位点突变和检测cdh1基因的多个位点突变的试剂盒
1.本技术是名称为：检测cdh1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒，申请号为：201911279328.0的分案申请。
技术领域
2.本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测cdh1基因位点突变的引物，采用普通pcr结合sanger测序技术，可用于快速检测遗传性胃癌患者体内cdh1基因位点的突变情况。


背景技术：

3.中国是胃癌高发国家，全世界42％的胃癌发生在我国，是第三大常见肿瘤(在男性中排在肺癌和肝癌之后，女性排在乳腺癌和肺癌之后)。胃癌人群中大多数为散发病例，约10％的患者表现有家族聚集性，这种聚集性可能与基因有关，也可能是由于共同的生活环境和饮食习惯所致，而hdgc(hereditary diffusegastric cancer，遗传性弥漫型胃癌)是已知的以胃腺癌为主的癌症综合征，占所有胃癌总数的1-3％。cdh1基因突变是hdgc遗传的主要原因，也是第一个发现的与遗传性胃癌相关的基因。
4.cdh1是一个抑癌基因，位于16q22.1，由16个外显子组成，长度约105kb，转录mrna长4.8kb，编码的e-钙粘蛋白(e-cadherin)分子量为120kd。e-cadherin 是一类ca2+依赖跨膜糖蛋白，由n端信号肽、前肽和成熟蛋白三部分组成，是目前公认的抑癌蛋白和肿瘤转移抑制蛋白，当它表达减少或功能异常时，将导致肿瘤的侵袭和转移。e-钙粘素在弥漫性胃癌中经常表达缺失，但是在其他类型胃癌中并没有这种现象。
5.至今已发现有150多种cdh1基因的突变类型，遍布cdh1基因的所有外显子。其中70％左右为致病型突变，包括截短突变(truncated mutation)、剪接突变(splicing mutation)、无义突变(nonsense mutation)；30％左右为错义突变 (missense mutation)，其临床意义还有争议。cdh1基因突变率在不同地区、种族的遗传性弥漫型胃癌检出差别很大，提示不同地区胃癌的发病机制可能不同。符合遗传性胃癌诊断标准的家系中，cdh1基因突变携带者一生中患胃癌的概率大约为70％。弥漫性胃癌一旦出现临床症状，大部分已不可治愈，因此遗传性胃癌家系的cdh1基因检测成为必要。其目的是尽可能明确发病原因，并对有发病危险的家族成员提供遗传性检测，以便早期发现突变基因携带者，及时采取干预措施以提高预后。
6.sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对cdh1基因突变进行检测可发现cdh1基因已知和未知的全部类型的异常，为遗传性胃癌患者的诊断提供依据。本发明中发现cdh1基因的c.2076t》c、 c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa四个位点的突变在中国人群中普遍存在。因此，临床在利用cdh1基因突变辅助诊断遗传性胃癌时需格外谨慎，加以区别。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、 c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点突变的引物，采用pcr技术，可用于快速检测遗传性胃癌家系成员体内cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、 c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点的突变情况。所述检测cdh1基因的 c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点突变情况的引物，包括：
8.扩增cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c. 2164+17dupa位点的引物，其碱基序列为： cdh1-f：tgtaaaacgacggccagtggcttgcgggtgtctttag cdh1-r：aacagctatgaccatgtccaggaaataaacctcctcc。
9.进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
10.m13 f：tgtaaaacgacggccagt
11.m13 r：aacagctatgaccatg。
12.本发明还提供了检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、 c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点突变情况的方法，包括以下步骤：
13.1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组dna；
14.2.用pcr扩增步骤1中提取的dna；
15.3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
16.4.对测序结果进行判断，确定cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、 c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点是否发生突变；
17.其中pcr扩增引物为：
18.扩增cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c. 2164+17dupa位点的引物，其碱基序列为： cdh1-f：tgtaaaacgacggccagtggcttgcgggtgtctttag cdh1-r：aacagctatgaccatgtccaggaaataaacctcctcc。
19.进一步地，测序引物碱基序列为：
20.m13 f：tgtaaaacgacggccagt
21.m13 r：aacagctatgaccatg。
22.本发明还提供了一种检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、 c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点突变的试剂盒，包括：
23.(i)血液/组织dna抽提试剂；
24.(ii)检测体系pcr扩增反应液：包括扩增cdh1基因的c.2076t》c、 c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa位点的引物，其碱基序列为： cdh1-f：tgtaaaacgacggccagtggcttgcgggtgtctttag cdh1-r：aacagctatgaccatgtccaggaaataaacctcctcc；
25.(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为： m13 f：tgtaaaacgacggccagt m13 r：aacagctatgaccatg；
26.(iv)阳性对照品和阴性对照品。
27.有益效果：本发明只用1对引物，可同时检测cdh1基因c.2076t》c、 c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa 4个突变，高效简便。其中还发现了c.2164+66a》c这个新突变(未见文献报道，属首次发现)，在本次检测中突变率为60％。本发明采用pcr技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。相比
较荧光定量pcr 法降低了检测的成本和难度，荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计4个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
28.图1为扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，m为marker dl 2000，1-20为血液样本1-20，经引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。
29.图2为样本3检测cdh1 c.2076t》c位点的测序截图结果。
30.图3为样本6检测cdh1 c.1937-13t》c位点的测序截图结果。
31.图4为样本11检测cdh1 c.2164+66a》c位点的测序截图结果。
32.图5为样本17检测cdh1 c.2164+17dupa位点的测序截图结果。
具体实施方式
33.实施例1
34.下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
35.一种检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c. 2164+17dupa位点突变的引物，该引物是针对cdh1基因的c.2076t》c、 c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：
36.扩增cdh1基因c.2076、c.1937-13、c.2164+66和c.2164+17位碱基的引物，其碱基序列为： cdh1-f：tgtaaaacgacggccagtggcttgcgggtgtctttag cdh1-r：aacagctatgaccatgtccaggaaataaacctcctcc；
37.一种检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c. 2164+17dupa位点突变的试剂盒，包括
38.(i)血液/组织dna抽提试剂；
39.(ii)检测体系pcr反应液；
40.(iii)测序体系试剂；
41.(iv)阳性对照品和阴性对照品。
42.其中，血液/组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。
43.检测体系pcr扩增反应液包括：2
×
pcr buffer；2mm dntps；kod fxdna polymerase(1u/μl)；cdh1上、下游引物(10μm)。
44.测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测cdh1基因的c.2076t》c、c.1937-13t》c、c.2164+66a》c和c.2164+17dupa的上、下游引物(3.2μm)。
45.实施例2
46.血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
47.(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl 蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，
充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
48.(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：
49.x＝18μl反应液
×
(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
50.n为检测标本数。
51.(3)加样：加入检测体系pcr反应液中2μldna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
52.(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：
[0053][0054]
pcr扩增体系试剂配制方法如下：
[0055][0056]
其中，引物序列为：
[0057][0058]
注：f为上游引物，r为下游引物
[0059]
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120v，30min，凝胶成像系统观察。
[0060]
如图1所示，即为20例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
[0061]
(6)sanger测序：
[0062]
取9μl pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0063][0064][0065]
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
[0066][0067]
测序反应程序：
[0068][0069]
沉淀环节：
[0070]
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的edta，静置5min；加入15μl 无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm
离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl cbl后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(abi3730)测序。 (7)结果判断：分别将测序结果与cdh1(ng_008021.1)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0071]
实施例3
[0072]
取20例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。检测结果见下表，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，测序图如图2-5所示。
[0073] c.2076t》cc.1937-13t》cc.2164+66a》cc.2164+17dupa1+
‑‑‑
2+++-3+
‑‑‑
4+-+-5+-+-6+++-7+
‑‑‑
8+
‑‑
+9+
‑‑‑
10++
‑‑
11+-+-12+
‑‑
+13+-+-14+-+-15+-+-16+-+-17+
‑‑
+18
‑‑
+-19
‑‑
+-20+-+-本次检测突变率90％15％60％15％文献报道突变率71.61％9.64％未见报道2.81％
[0074]
注：+表示阳性突变，-表示无突变。